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热带亚热带植物学报 1997 5(4)：65—68
Journal oj Tropical and Subtropical Botany
巴西橡胶树未受精胚珠培养时愈伤组织与胚状体的起源(简报)
杨晓泉
— - · — — - — — ． ． ． 一一
(华南理工大学食品与生物工程学院、广州 510641)
傅家瑞
(中山大学生命科学学院， 广州 510275)
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THE ORIGIN OF CALLUS AND EMBRYOID IN CULTURED
UNFERTILIZED OVULES 0F 日：￡ ， M
Yang Xiaoquan
(Department of Food Science．shlc^ China University of Techndoyy．Guangzhou 510641)
Fu Jia
(Depctrtmenl of Biology，Zhoa#shan University．Guangzhou 510275)
迄今为止，利用未受精胚珠离体培养诱导木本植物形成单倍体植株的仅有杨树及巴西橡
胶树两例【1～，但均缺乏详细的胚胎学观察资料，胚状体的起源不甚清楚。在某些草本植物中，
起源问题已有详细的研究．例如向日葵未受精胚珠离体培养时，胚状体起源于未受精的卵细胞
分裂141；水稻单倍体植株则来自助细胞无配子生殖形成的胚状体 。木本植物未受精胚珠培养诱
导单倍体植株大都经过愈伤组织阶段，但愈伤组织的起源亦未见相应的切片观察资料．本文采
用组织化学方法，研究了巴西橡胶树未受精胚殊离体培养时胚状体及愈伤组织的起源，以期对
该问题有一个较明确的解释。
1材料与方法
材料 供试材料为 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muel1 ．Arg．)开花前 2—3 d的雌
花，橡胶树品系为IAN873，采自广东省湛江市南亚热带作物研究所标本园．
方法 无菌条件下剖开子房，挑选完整无损的胚珠接种在附加l mg L 2,4-D；l 2 mg
激动素(KT)；5％(v／v)鲜椰乳及5％(w／v)蔗糖的改良MB脱分化培养基上，24 h光照培养
(25℃)。 改良MB培养基采用MS培养基的矿质元素及B。培养基的有机成分 并加以改
进． 接种第 2天起分批取样，乙酸，甲醇(1：3)固定，PAS整体染色161，石蜡连续切片，厚度
5 ，切片再经汞．溴酚蓝复染，鉴定多糖与蛋白质，并同时观察愈伤组织与胚状体的生长状
态． Olympus BH-2显微镜观察，并照相记录。
2 结果与讨论
2．1配子体
巴西橡胶树的胚珠属双珠被、厚珠心、倒生型，具较长的珠心喙。珠心喙和内珠被的PAs
反应强烈(图版I：1)，显示珠心喙和内珠被贮存大量淀粉粒。培养4 d，在胚囊珠孔端观察到
1996—10—07收稿； I997-09—12修回
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带亚热带植物学报 第 5卷
多个游离核(图版 I：2)。 这种现象与巴西橡胶树核型胚乳核的分裂极为类似【 。 而在向日葵及
水稻未受精胚珠离体培养中，胚囊内的游离核多由次生核有限分裂而来_l一，因此我们认为橡胶
树未受精胚囊内的次生核在培养时发生了分裂。在培养4 d的胚囊珠孔端亦观察到具双核仁的
卵细胞(图版I：3)，但未见卵细胞的横分裂。在培养8 d的胚囊珠孔端观察到汞 -溴酚蓝深着
色的细胞团(图版I：4)，但不具胚性结构。从培养8 d起，胚囊中已很难观察到生活的雌配子
体，直至培养24 d，胚囊强烈收缩，未见到配子体起源的细胞结构。
Raghavan认为，离体胚珠培养时胚乳的发育对合子胚的发育起先导与促进作用 ，对于木
本植物尤其如此。 巴西橡胶树的受精卵有长达40 d的休眠期，胚乳的发育是其先决条件 。 本
例观察到胚乳样次生核的分裂，证明巴西橡胶树未受精胚珠离体培养时，配子体已有启动，但
在后续培养中未能发育为胚状体或愈伤组织。
2．2 愈伤组织
培养第 2天起即有愈伤组织产生，最初出现在珠被的创伤面。 创伤面下的薄壁细胞同时进
人分生状态，进行迅速平周分裂并形成小而致密的几层细胞，类似形成层(图版I：5)。值得注
意的是这组细胞分裂潜势不大，随培养继续其分裂明显停滞。
第二类愈伤组织由外珠被内部的某些薄壁细胞脱分化而来，与创伤无关。同周围的薄壁细
胞相比，这类分生细胞体积较小，质浓，形成一种独特的花环状结构(图版 I：6)．切片观察显
示这种分生细胞来自维管束附近的薄壁细胞，多处于外珠被的两端。 图版I：7示培养 16 d的
胚珠纵切面．显示珠被维管束与这类愈伤组织起源的关系。这种愈伤组织起源方式与某些木本
植物如红杉营养器官培养时愈伤组织的起源类似 。这类愈伤组织分裂潜势极强，可持续分裂形
成大量愈伤组织。 随培养继续这类愈伤组织具有分化的趋势。
第三类愈伤组织启动较晚，起源于珠被表皮层的单个细胞。这种脱分化的表皮细胞具有明
显的核仁且细胞明显增大(图版 I：8)，可无序分裂形成肿瘤状的愈伤组织，主要发生在内珠被
的内外两侧。PAs一 汞溴酚蓝衬染的结果表明其正处在旺盛分裂期(图版 I：9)。 此外，单个
外珠被细胞可不对称分裂形成顶细胞与基细胞，按胚胎发育形式形成类似胚胎的细胞结构，随
培养继续，这种由单个或多个外珠被表皮细胞直接形成的细胞结构最终愈伤组织化，多发生在
外珠被外侧(图版I：10)。
比较内外珠被的PAS反应结果，可知内珠被富含大量淀粉粒，纤维化程度较低，而外珠被
纤维化程度较低，不含淀粉粒。 因此我们认为组织的淀粉含量是影响胚性细胞不对称分裂，产
生胚性结构的原因之一。
2．3 胚状体
本文在外珠被外侧观察到单个、两个或多个表皮细胞脱分化，按类似胚胎发育模式形成的
愈伤组织(图版1：10)。 说明橡胶树未受精胚珠离体培养时，孢子体组织有可能通过直接途径
产生胚状体，这一结论尚需进一步研究。
培养至14—24 d，观察到由内珠被愈伤组织发育而来的细胞结构(图版I：l1—13)。其与
愈伤组织之间有明显的PAS反应隔离层(图版 I：l1)。 汞溴酚蓝衬染的结果显示其细胞较
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第 4期 杨晓泉等：巴西橡胶树未受精胚珠培养时愈伤组织与胚状体的起源 67
小 质浓 分裂较为旺盛(图版I：12，13)。 与胚状体的结构特征一致。 这说明，在巴西橡胶
树未受精胚珠在脱分化培养时，孢子体愈伤组织很容易形成类似胚状体的细胞结构．
在巴西橡胶树未受精胚珠或子房培养时，常用子房或胚珠膨大．愈伤组织突破子房壁或外
珠被来判定单倍性愈伤组织及胚状体的起源【I叫。本实验表明富含淀粉的内珠被极易愈伤组织
化，并可突破外珠被；外珠被薄壁细胞的脱分化亦可使胚珠外观膨大。 在本实验的培养条件
下，巴西橡胶树未受精胚珠离体培养时产生的愈伤组织及胚状体均为孢子体起源。 因此，确定
愈伤组织及胚状体起源仍需做详细的胚胎学研究。
参考文献
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图版说明
1—11胚珠纵切．1—4示肛囊与配子悻发育．珠孔端朝上．合点端朝下，e：卵细胞． 游离棱，v：维管柬
1．培养 4 d．示珠心喙 PAS探着色的淀粉粒；×416
2．培养 4 d．示胚囊的游离拔(十)； ×416
3 培养8 d，示胚囊卵细胞双棱仁(十)；×416
4 培养 I2 d，示胚囊内汞一溴酚蓝探着色的细胞团(f)；×416
5 培养4 d，示内珠般创伤面的分生细胞(t)：×208
6 培养 8 d，示外珠般的花环状结构(f)：×208
7 培养16 d，示外珠被的禽伤组筝{与维臂束(t)的关系；×42
8 培养 12 d．示内珠被脱分化的表皮细胞(t)；×416
9．培养 16 d．示内珠被富古淀粉粒及由其表皮细胞形成的愈伤组织 ×208
IO．培养18 d，示由外珠般表皮细胞(f)形成的禽伤组錾{；×208
I1．培养20 d，示内珠技]舡伤组织表面形成的类胚状体．其与愈伤组织之间具呈PAS反应的分隔( )；×208
I2．培养I 8 d，横切面．示内珠般：舡伤组织产生的娄胚状体细胞结构(f)；×208
13．培养24 d．游离的胚状体(f)．×208
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热带亚热带植物学报 第5卷
Explanation of plate
1—1 1 L S of ovules I一4 showing micropylar region of saa． e=Egg cel； f=Free nuc~us； V=Vascu"lar bund~
1 After 4 days of culture．showing starch grains stained by PAS in nucelLar beak；x 416
2 After 4 days of culture，showing free nuclei(f)in embryo sac；×416
3 After 8 days of culture，showing egg cel with two nue~ol( )in embryo sac；×416
4 After I2 days of culture showing multicelular structure stained densely by merolri~bromophenol blue；×416
5 After 4 days of culture．showing m~istematic cels occured in wounded part of inner integument；×208
6．After 8 days of culture，showing floralhoop~ke structure (f)in 0u rintegument；x 208
7 After 16 days of culture，showing calus and vazeu"lar bundle({)ofthe outer integument；×42
8 After 1 2 days of culture．showing a dedifcrential epidemic cel(f)of the inner itltegumcnt；x 416
9 After I 6 days of culture．showing inner integument abundant in starch grains and the calus o15ginated from its
epidemic cels；× 208
10．A r 18 days of culture，showing the cagus originated from epidemic o：ls(f)of outer integument；x 208
1 I After 20 days of culture showing embryoid4~e s unure originated from the calus of inner integument and the
partitions(f)demonstrating pAS positive reaction，by wh ~mbryoid-likc structure was scp~trated from the
龃Ⅱus：×208 。
12．A船r Ig days of culture C．S of the ovules．showing ~mb~oid-lJk~shuc【ure odginated from calus of inner
intngtmcat；×208
I3．A船r 24 days of culture．showingfree embryoid × 208
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