全 文 ：核 农 学 报 , 了一
通‘如 助碗 ’‘ 抽 如 。万认介松
应用免疫放射分析法鉴定水
稻细菌性条斑病稻种
王公金 朱献水
江苏省农业科学院原子能农业利用研究所 南京 功 。
陈毓等 王法明
江苏省农业科学院植物保护研究所 南京
应 用‘““ 一 蛋 白与兔杭血清无疚球蛋 白 非特异性结合原理 , 建立 了检浏 水
稻 细 菌性 条斑病病原菌的充疫放射分析法
。 经反 复检验表明 检刚 灵敏度约 为 “
菌 ,
‘ 才比 内和批间 变异索数 均
, 兔抗血清付其它病原细菌基本上 无
交又反应 。 通过对我 国南方 省部分水稻 病区 的 个品种稻种样品 鉴定表明 , 水稻
病 区稻 种 自然带菌非常普遍 , 其阳性率高达 。 采用浓缩接种试验证明 , 兔疫
放射分析法应 用于 自然带菌稻种 的鉴 定是可行 的
。
关键词 兔疫放射分析法 水稻 细 菌性 条斑病
前 言
水稻细菌性条斑病 简称细条病 是我国南方稻区的主要病害之一 〔‘ ’ , 该病害最 初 主
要发生在 南方个别省份的局部稻区 , 但因近年来陆续 由病区引进南繁稻种 , 又无有效的稻种
检疫技术 〔“ , 所 以 , 该病害迅速在南方各省如广东 、 广西
、 福建 、 湖南 、 江西等省稻 区 蔓
延 〔’‘“ 〕
。
为此 , 作者研究了应用于水稻带菌稻种鉴定的快速免疫放射分析法 , 并试制出诊断
药盒 , 在有关单位试用 , 取得较好的效果
。
材 料 与 方 法
免痊原的制备及纯化 选择海南省水稻细条病病区植株病 仆卜上分离的 病原菌 作为 免 疫
原 。 该免疫原经牛肉汁蛋 白陈琼脂糖斜面培养基培养 一 小时后 , 用生理盐水洗下 , 制成
免疫原悬液
。 采用离心 、 洗涤法纯化 〔‘ , “ ’。 最后 以适量生理盐水稀释 , 浓度为 。细菌
, 小时内使用 。
细条病抗血清的生产 挑选 一 只健康新西兰雄兔 , 体重 一 , 按常规法饲养管理 。
采用腹股沟皮下多点及淋 巴注射法免疫家兔 〔
。 免疫原悬液用量每次为 , 注射 间隔 天 ,
第 次注射后 天 , 耳静脉采血 一 , 分离血清 , 试管凝集法监测效价 嘴
。 当效价 达
时 , 再注射 工次 , 天 后须功脉采血 , 分离血清 。 血清中加入 。至 浓度 , 分装成每瓶
此义于 年 月 日收到
的 核 农 学 报 卷
血清 , 低温冰箱储存备用
。
免痊杭血清的纯化 取 抗血清加 浓度为 火 “菌 的白叶枯菌悬液 含
, 的磷酸盐缓冲液 , 混匀 , ℃反 应 一 小时后 , 将反应液于 台 式
高速离心机内离心 , 弃含菌沉淀 , 保留上清液 , 上清液再重复离心 次 。
向离心处理后的上清液中加入牛血清 白蛋 白 至 浓度 , 并立即分装于安瓶瓶中 , 每
瓶 , 冻干 , 封 口 , ℃或低温冰箱内保存 。 临用时 , 每瓶冻干品加入 的
磷酸盐缓冲液溶解 , 即成为抗血清工作液
。
标记 蛋白的制备 采用氯胺 法 , “ 标记 蛋 白 〔。 」, 并略加修改 。 标记缓冲系 统 使
用 。 的磷酸盐缓冲液 , ‘ “ ” 放射性比活度为 有还原剂 。 标记结束
后 , 反应液经 柱 中 脱游离碘 , 用 的磷酸盐缓冲 液
洗脱 , 分部收集洗脱液 。 合并‘“ ” 一 蛋 自峰组分 , 并以 等体积的 的磷酸盐 缓 冲 液
含 稀释 。 尔后分装于安瓶瓶内 , 每瓶 时 , ℃冰箱保存 。 使用时 , 衍 瓶
用适量 的磷酸盐缓冲液溶解 , 并稀释至约 。 林 比活度 。
检浦方法及步骤 样品处理 取 一 ’待测水稻茎叶或颖壳 , 剪碎 , 加 样 品
处理液 , 吐温一 的磷酸盐缓冲 液 。 ℃水 浴 浸 泡 小 时 间 断 摇
荡 , 尔后用一层普通滤纸过滤 , 弃去残渣 , 保 留样品滤液备用 。 以健康茎叶或颖壳作为对
照 , 处理步骤与待测样品相同
。
上述滤液临时制备 , 小时内使用 。
测定步骤及结果判定 分别取。 样况和对照滤液 , 加入相应编号的塑料免佼测定
营中 , 尖底具塞离心管 , 一 , 各管加入 抗 血清工作液 , 于 ℃水浴温 育
半小时 。 然后将各管在 台式高速离心机中离心 , 倾弃上清液 。 沉淀物用 标记 蛋
白稀释液溶解 , ℃水浴继续温育
。
最后 , 各管加 磷酸盐缓冲液 含 吐温一
, 旋涡混合器上振荡片刻 , 重复离心 次 , 弃上清液 。 将含沉淀物的各管置 丫 免 疫 计数
器内分别测定计数率 , 并扣除仪器本底计数率
。 然后 , 将样品净计数率的均值 。
与对照净计数率均值 、 相 比较
。 当样品净计数率均值与对照均值 、 》 时 , 则判
断样品为阳性 反之 , 或 时判为可疑 时判为阴性 。
结 果 与 分 析
一 抗血清的特异性
表 为某些病原菌 。吕细菌 与抗细条病抗皿清交叉反应程度的测定结果 。 显然 ,
经处理后的抗血清 , 除对水稻 白叶拈病菌 型 及 自叶拈菌伴随杂菌有轻微的交义反应外 ,
对其余病原菌基本上无交叉反应 , 说明该抗血清具有较强的特异性
。
二 免痊放射分析法的灵敏度
检验结果列于表
。 参照 倍标准差法 〔‘ ” , 本文把 , 、值 》 相对应的菌浓度定为
该方法的灵敏度 。 据此 , 免疫放射分析法对细条病菌的最小检出浓度为 菌
三 免疫放射分析法的孟现性
该方法的重现性 即精密度 以批内和批间测定结果的变异系数 表示 〔生。 ’。 表
为带菌水稻叶片及稻种颖壳样品各重复 批 的测定结果 。 统计分析表明 测定结果
的批内 , 批间 , 与一般血清学方法相比状 , 该方法有良好的重现性 。
期 应用免疫放射分析法鉴定水稻细菌性条斑病稻种 仓自
门目
表 抗血清对若千脚旅的交叉反应
一
。
病 原 菌 名 称 交 叉 反 应
叮 。 肠
。
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二 。 ” , 、。二 。 , 魏氮黯彝愁兜愿碧器乳乙
。
水稻白叶枯病伴随菌 杂菌
水稻褐斑病菌
爪 。凡
水稻基腐病菌
脚 ‘ 夕‘ ” ‘
桑疫病菌
‘ ” 川
桃根癌病菌
。 。
马铃薯环腐病菌
” 亡阳珑 用 ” , 琳
棉花角斑病菌
” 附 爪夕 ‘
表 免夜放射分析法的员敏度
菌液浓度
士
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吞 核 农 学 报 卷
表 免痊放射分析法的孟现性
批 号 批内 肠
病叶 病种
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表 稻病区稻种带菌鉴定结果
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海南省
广东省
广西省
江西省
浙江省
江苏省
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一 内
口 ,
人工接种稻种 。
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四 水稻病区稻种带菌鉴定
一 年期 间 , 分别从我国南力 若于省份水怕细条病病 区收集了 个品种的 成 热
稻种
。 经免疫放射分析法鉴定表明 表 各病区稻种带菌阳性检出率达 一 纬 可
疑率为。一 阴性率为。一 纬 个品种的阳性检出率为
。 将部分鉴 定 后
空期 应用免丧放射分析法鉴定永稻细菌性条斑病糟种 鱿
的稻种样品用浓缩接种法作对比试验 , 其阳性符合率和阴性符合率分别为 和
由于接种效果易受环境诸种因素影响 , 尽管稻种带少量病菌 , 但在当季接种稻株上不一定呈
现发病症状 , 所 以 , 阳性符合率偏低 。
五 免皮放射分析法的德定性
储存时间
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图 抗血浦的稳定性
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·
一
·
,
℃
长期储存的检验结果 见图 证明 抗血清冻干品在一 ℃和 一 ℃条件下分别 保 存
天和 天后 , 其免疫活性 以对细条病病菌和标记 蛋 白的结合能力表示 均未降 至 储
存第 天后的一半 , 由此可见 , 该方法是较稳定的
致谢 本研究得到江苏省农业科学院畜牧兽医所黄夺先副研究员的大力支持和指导 , 唐彬 、 赵永富
、
赵伟 、 严建民 、 史
阿宝等同志参加部分工作 , 在此一并致谢
参 考 文 献
〔 〕方中达 水稻白叶枯病及条斑病和李氏禾条斑病原细菌的比较研究 植物病理学报 , , 了 一 。
〔幻 赖文姜等 水稻细菌性条斑病种子检疫及种子检疫技术研究简报 广东农业科学 , 一 。
〔 〕何启华等 , 广东水稻细菌性条斑病的 问题 植物检疫 , , 一
〔 王法明等 应用反向间接血凝技术检验水稻白叶枯菌的研究 中国农业科学 , , 一
〔 〕王公金等 水稻细菌性条斑病病原的免疫放射检测法 征苏农业科学 , , 一
〔 〕中国医学科学院流行病防治研究所 常见病毒病实验技术 科学出版社 , 一 。
〔了〕 , ,
, 一
〔 梁业楷 放射免疫分析及其在微生物免疫学中的应用 人民卫生出版社 , , 一 ,
〔幻 杜念兴 兽医 免疫学 上海科学技术出版社 , 一
杰夫考特 , 著 , 丙卜圣民译 放射免疫测定的质盆控制 上海科学技术文献出版社 , 一玲 。
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