全 文 ：植物多倍化是一种普遍存在的生物学现象，自
然界中约 95% 的蕨类植物[1]和 70% ~ 80% 的双子
叶植物均为多倍体[2]，同时约 50% ~ 70% 的被子植
物在其进化史中至少经历过一次多倍化进程[3]。多
倍化是植物进化和多样化的重要原动力[4–5]，一些
重要的经济作物， 如小麦(Triticum aestivum)、燕麦
荧光原位杂交技术在植物多倍体起源与进化研究中
的应用
付文炎1,2, 刘义飞1, 黄宏文1*
(1. 中国科学院华南植物园， 中国科学院植物资源保护与可持续利用重点实验室， 广州 510650； 2. 中国科学院大学，北京 100049)
摘要： 多倍化是植物物种形成与多样化的重要原动力。研究植物特别是一些重要经济作物和园艺植物多倍体的起源与进化，
不仅对于揭示多倍体形成过程中性状变异的分子机制具有重要意义，而且可为植物遗传资源的保护与利用提供理论和技术支
持。作为连接基因组序列片段到染色体组的桥梁，荧光原位杂交技术长期被广泛用来研究多倍体形成与进化过程中相关特异
基因或序列的表达定位、外源染色体检测和鉴定、基因组结构变异等科学问题。因此，在简单介绍荧光原位杂交技术发展历史
和植物多倍体主要类型的基础上，主要总结了荧光原位杂交技术在植物多倍体起源与进化相关研究上的应用。
关键词： 荧光原位杂交； 基因组原位杂交； 多倍化； 染色体变异
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2014.03.014
Applications of Fluorescence in situ Hybridization (FISH/GISH) to Study
the Origin and Evolution of Plant Polyploids
FU Wen-yan1,2, LIU Yi-fei1, HUANG Hong-wen1*
(1. Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Sustainable Utilization, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,
Guangzhou 510650, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract: Polyploidization is a driving force to the plant speciation and diversification. The researches about
the origin and evolution of plant polyploids, in particular crop or horticultural plant polyploids can not only give
insights of the molecular mechanism underlying trait variations, but also improve the conservation and utilization
of valuable polyploid germplasm resources. The developing of fluorescence in situ hybridization (FISH/GISH)
technique recently provides a bridge between the sequences of a genome and the corresponding chromosomes. The
uses of FISH and GISH can help to understand the processes of gene expressions, exotic chromosomal invasions
and genomic structural variations related to polyploidy. Thus, the history of the developments of fluorescence
in situ hybridization technique and the main types of plant polyploids were briefly introduced. Furthermore, the
recent progresses of the applications of FISH and GISH on the researches of the origin and evolution of plant
polyploids were reviewed.
Key words: FISH; GISH; Polyploidy; Chromosomal variation
收稿日期： 2013–08–28　　　　接受日期： 2013–10–22
基金项目： 国家自然科学基金项目(30900119)； 中国科学院植物资源保护与可持续利用重点实验室青年基金项目(211006)资助
作者简介： 付文炎(1988 ~ )，女，硕士研究生，从事植物细胞遗传学与基因组学研究工作。E-mail：fuwenyan11@mails.ucas.ac.cn
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: huanghw@mail.scbg.ac.cn
热带亚热带植物学报　2014， 22(3)： 314 ~ 322
Journal of Tropical and Subtropical Botany
第3期 315
(Avena sativa)、马 铃 薯(Solanum tuberosum)、棉 花
(Gossypium hirsutum)等均为多倍体。其他一些作
物，如甘蓝(Brassica oleracea)、玉米(Zea mays)、大
豆(Glycine max)、向日葵(Helianthus annuus)等虽为
二倍体，但其祖先在进化中也经历了多倍化过程，
即古多倍化[6]。通过全基因组测序，在模式植物拟
南芥(Arabidopsis thaliana)的进化过程中发生过多
倍化现象[7]。最近的研究表明，水稻(Oryza sativa)
基因组在禾谷类作物分化之前也发生了全基因组
加倍事件[8]。就多倍体作物而言，多倍化除对其本
身具有重要的进化和生物学意义外，还对其形态的
多样化和抗逆抗病性等均具有重要的影响。相比
二倍体物种，四倍体野生马铃薯(S. stoloniferum)具
有许多优良的抗病毒病性状，其 Rysto 和 Nasto 基因
能抵抗土豆 Y 与 A 病毒病[9]。研究多倍体植物，特
别是一些重要的多倍体经济农作物和园艺作物的
多倍体形成机制、基因组组成和进化规律，不仅对
揭示多倍体形成过程中性状变异的分子机制具有
重要的科学意义，而且可为新种质资源的驯化以及
新品种品系的培育提供理论和技术基础。
随着现代分子遗传和分子生物学技术方法
的发展，各种研究多倍体基因组组成和结构变异
的方法不断出现，这为研究、评价和发掘利用多
倍体植物或者多倍体作物种质资源本身提供了
便利条件。特别的，随着新一代测序技术(Next-
generation sequencing, NGS)的广泛使用，结合荧光
标记技术发展的原位杂交技术(in situ hybridization,
ISH)，即 荧 光 原 位 杂 交 技 术(Fluorescence in situ
hybridization, FISH)，作为连接基因组序列片段到
染色体组的桥梁，使得基因组分析不再停留在草图
阶段，而是可以实现更精细化的分子细胞遗传学操
作，极大地促进了从分子基因组模式研究到辅助作
物遗传育种，从基础研究到应用研究的转变。本文
将综述荧光原位杂交技术的相关发展历史背景，并
结合多倍体植物类型的背景介绍总结荧光原位杂
交技术对于研究多倍体植物基因组组成和结构变
异方面的相关研究进展，以期为今后类似的研究提
供思路借鉴和指导。
1 荧光原位杂交技术的发展
1969 年，Pardue 和 John 等[10]利用放射性同位
素 3H 标记的 rDNA 探针与非洲爪蟾(Xenopus laevis)
细胞核杂交首次获得成功。其原理是通过设计一
种带标记的外核苷酸片断探针，利用碱基配对原则
与经变性成单链的染色体 DNA 杂交，最后经过专
门的检测方法将目标 DNA 在染色体上的具体位置
显示出来，他们将该技术命名为原位杂交。在该项
技术发展之初所用的探针多为放射性标记探针，但
是放射性标记有许多缺陷，如杂交信号检测比较困
难、分辨率低、定位不准确等。1977 年，Rudkin 等[11]
发明了用间接免疫荧光法检测目的 DNA 的非同位
素原位杂交技术(Nonisotopic in situ hybridization,
NISH)。1981 年，Bauman[12]通过制备抗 DNA∶RNA
复合物的抗体来检测杂交后的 RNA 探针，然后通
过免疫荧光法结合抗体、显示 RNA 的杂交位点。
1982 年，Langer 等[13]将 偶 联 有 生 物 素 的 核 苷 酸
(Biotin-11-dUTP)通过缺口转移法掺入 DNA 探针进
行染色体原位杂交，从而开创了非放射性原位杂交
时期。但是，自 1969 年 Pardue[10]、Gall 以及 John
等创建这项技术后，植物染色体原位杂交的研究由
于受到植物细胞的细胞壁以及细胞质覆盖等因素
的制约，远远落后于在人类及哺乳动物中的研究。
随着植物染色体制片技术的改进及相应应用于植
物染色体原位杂交的检测系统的发展，该技术在植
物上的运用瓶颈逐渐消除。1985 年，Rayburn 等[14]
以黑麦(Secale cereale)的 DNA 探针(120 bp)与中国
春小麦的染色体进行原位杂交，在小麦 21 对染色
体中的 11 条染色体上观察到了 24 个杂交位点，该
实验的成功使得该项技术在植物研究中逐渐地推
广和应用。随着该项技术的发展与成熟，Stelly[15]
于 20 世纪 80 年代末进一步开发了棉花花粉母细
胞(PMC)染 色体 的 原 位 杂 交 技 术(Chromosome in
situ hybridization, CISH)。
Pinkel 等[16]于 1986 年首次报道了荧光原位杂
交技术，即用荧光素标记探针检测杂交信号，即荧
光原位杂交技术(FISH)。与传统的放射性同位素标
记相比，荧光素标记的优点是不具有放射性，同时
实验周期短、非特异杂交信号污染少，标记的探针
稳定、 检测简便快速、灵敏度高和安全等。目前主
要使用的荧光染料包括异硫氰酸荧光素(Fluorescein
isothiocyanate, FITC)、若 丹 明(Rhodamine)、德 克 萨
斯 红(Texas red)、3H-吲 哚 菁 类 染 料(Cy3)、4,6-联
脒-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化丙啶(Propidium iodide,
PI)等。利用荧光染料标记的探针可以直接原位
杂交到染色体或 DNA 纤维切片上，并通过洗脱、
付文炎等：荧光原位杂交技术在植物多倍体起源与进化研究中的应用
316 第22卷热带亚热带植物学报
杂交信号放大等处理后在荧光显微镜下观察探
针序列在染色体或 DNA 纤维上的位置和分布方
式[17]。Schwarzacher 等[18]在 1989 年发表了用基因
组总 DNA 为探针进行原位杂交的研究结果， 后来
把这种方法称为基因组原位杂交(Genome in situ
hybridization, GISH)，主要原理是标记一种植物的
总基因组 DNA 作探针， 另一种植物的基因组总
DNA 不加标记用作封阻 DNA，利用基因组专化
重复 DNA 序列优先杂交，使探针 DNA 与染色体
DNA 结合，从而区分来自不同基因组的染色体。
目前，FISH 和 GISH 被广泛的用来进行细胞核型
分析、特异基因或序列的表达定位、外源染色体检
测和鉴定、染色体物理作图和基因组结构变异分
析[19–20]。
2 植物多倍体的分类
Grant[1]把 多 倍 体 定 义 为 含 有 更 多 染 色 体 的
个体，含有附加的 1 个或多个祖先的全部染色体
组。简单地来说多倍体是含有 3 套及 3 套以上的
染色体组[21]。最开始植物多倍体分为同源多倍体
与异源多倍体两种，但是这两种分类方式无法概
括所有多倍体物种的类型，尤其是对于一些起源
比较复杂，基因组组成牵涉到多个物种的多倍体。
Stebbins[22–23]根据染色体减数分裂时形成多价体和
二价体的情况把多倍体分为 4 类：同源多倍体(只
形成多价体)、部分异源多倍体(多价体多于或者少
于同源多倍体)、严格异源多倍体 (只有二价体)和同
源异源多倍体(多价体二价体都存在)。Grant[1]提出
通过染色体减数分裂行为、隔离系数、可育性和形
态特征等法则来综合判断多倍体类型，并且认为同
源多倍体和异源多倍体是多倍体分类的两个极端，
中间有许多过渡的类型，他将多倍体分为 2 大类和
5 小类：第一大类为同源多倍体(Autopolyploids)，
包括严格同源多倍体(Strict autopolyploid, AAAA)
和 小 种 间 同 源 多 倍 体(Interracial autopolyploid,
AAAA); 第二大类为双倍体(Amphiploids), 包括部
分异源多倍体(Segmental allopolyploid, AsAsAtAt)、
基因组异源多倍体(Genomic allopolyploid, AABB)
和同源异源多倍体(Autoallopolyploid, AAAABB)。
关于多倍体的分类到目前还没有一个最终的定
论[21]，目前广泛接受的说法是：同源多倍体是指在
同一物种种内交配产生的多倍体物种，也包括有遗
传差异的不同居群之间杂交产生的多倍体后代，异
源多倍体是指不同物种之间杂交产生的多倍体后
代[24]。
3 植物多倍体基因组起源和组成
对于植物多倍体基因组起源和组成的研究，
最开始主要用到的方法是核型分析，通过核型和分
带特征确定物种间的亲缘关系，辅助植物分类学工
作，但这些数据并不可靠，因为同属植物的核型是
很相似的，不能明显区分物种中来源不同的基因
组，并且植物染色体分带技术目前也无法得到非常
稳定清晰的条带，因而通常很难准确地了解物种间
遗传物质的差异性。但是这些问题通过原位杂交
可以得到很好的解决。对于植物多倍体，GISH 与
FISH 是探测祖先基因组来源、理清种间进化关系、
构建遗传图谱、分析基因组杂交渐渗和促进遗传育
种的重要手段[25]。普通小麦 A、B 和 D 基因组染
色体第 1 到第 7 号同源群模式图就是结合核型分
析和原位杂交技术构建起来的[26]。
3.1 单个多倍体物种起源问题研究
传统区分同源与异源多倍体的方法是通过观
察其减数分裂过程中染色体的配对行为，若形成多
价体则可能是同源多倍体，若为二价体则可能是异
源多倍体[27]。然而传统的方法只能大致判断出多
倍体类型，并不能准确识别基因组组成与来源。而
通过 GISH 与 FISH 则可以较为清晰的识别多倍体
基因组的同源或者异源组成。
单色 GISH 方法是利用一个潜在亲本的基因
组作为标记 DNA，利用另一个亲本作为封阻 DNA
与待测样本的染色体进行杂交，若发现有杂交信号
就说明其与潜在亲本的亲缘关系很近。通过单色
GISH 可以追溯多倍体起源问题，例如在对云南山
茶(Camellia reticulata)多倍体复合体基因组起源的
探究中，用近缘种西南山茶(C. pitardii)和怒江红山
茶(C. saluenensis)作为标记 DNA，用二倍体云南山
茶的基因组作为封阻 DNA 进行 GISH，结果表明，
西南山茶与四倍体和六倍体均有杂交信号，而怒江
红山茶只与六倍体有杂交信号，从而推断异源四倍
体是由二倍体云南山茶和西南山茶杂交产生的，异
源六倍体是由异源四倍体与怒江红山茶杂交得到
的[28]。以甘薯近缘野生种 Ipomoea trifida (2x)的全
第3期 317
基因组为探针，与 I. trifida (4x)的 2 个株系 695104
和 697288 的体细胞染色体进行 GISH，结果表明，
695104 几乎所有染色体整条都有均匀明亮的信号，
有可能是由二倍体 I. trifida 基因组直接加倍而来；
697288 虽然各条染色体也均有杂交信号，但信号的
区域与亮度有差异，有可能是由于染色体加倍的同
时或之后发生了基因组重组与部分变异[29]。
单色 GISH 一次只能检测一种杂交信号，对于
起源牵涉到两物种及以上的异源多倍体基因组组
成的检测效率不高，所以后来又出现了双色 GISH，
即用两个潜在亲本的全基因组序列为标记 DNA，
不用封阻 DNA，一起与待测样本的染色体进行杂
交，这样可以同时检测待测样本与两个潜在亲本
的亲缘关系。在对多倍体变色鸢尾(Iris virginica)
起 源 的 研 究 中，通 过 GISH 将 两 个 潜 在 祖 先 I.
virginica 与 I. setosa 的全基因组标记后与变色鸢
尾染色体进行杂交，结果表明有 38 条染色体被 I.
setosa 的 DNA 标记，70 条染色体被 I. virginica 的
DNA 标记，据此证明变色鸢尾为异源多倍体[30]。
通过开发基因组特异的探针序列，即发掘基
因组或者染色体特异的 FISH 信号(探针的分布方
式与数量)，也可以准确的区分多倍体染色体和基
因组的组成。在小麦、水稻等重要经济作物中都已
开发出许多基因组特异的标记探针。用从黑麦中
开发的 R 染色体组特异性序列 pSC119 作为探针，
与小麦染色体进行 FISH 杂交，结果表明与小麦的
A、B、D 染色体组都有杂交信号，但与 B 染色体
杂交信号最多，所以黑麦的 R 染色体组与小麦的
B 染色体同源性高一些[14]。此外，通过 FISH 结合
核型分析以及染色体减数分类时的配对行为，也可
以用来判断多倍体类型。Lavia 等[31]通过 FISH 证
实了多年生花生(Arachis pintoi)二倍体和三倍体中
rDNA 位点分布都是一样的，核型组成也是一样的，
并且三倍体中同源染色体联会时基本都以三价体
的形式，从而表明多年生花生为一个同源三倍体。
以 45s rDNA 为探针，对柑橘属品种‘红江橙’(Citrus
sinensis Osbeck. ‘Hongjiangcheng’)不同倍性的植株
进行 FISH 研究，结果表明，‘红江橙’二倍体有 3 个
位点，三倍体有 4 个位点，其中有 3 个与二倍体相
同，另 1 个分布在不同染色体上；四倍体中有 6 个
位点，与二倍体在染色体上的分布和信号强弱都基
本相同，以此推断三倍体的形成与 2n 雌配子的形
成有关，伴随有外源基因组的重组；四倍体可能产
生于珠心系细胞的直接加倍[32]。
许多植物物种的种内与种间存在连续倍性
变异(如从二倍体到更高的八倍体、十倍体等的连
续倍性变异)，而正确区分这些多倍体系列的同源
或者异源十分困难。在这种情况下需结合 FISH
和 GISH 数 据 对 多 倍 体 基 因 组 进 行 综 合 分 析。
Hasterock 等[33]最近基于原位杂交对二穗短柄草
(Brachypodium distachyon)的 整 倍 体 系 列(2n = 10,
20, 30)进行分析，认为其染色体 2n = 30 的个体并
不是想象中的同源多倍体，而是经 2n = 10 和 20
的物种杂交形成的异源多倍体。以长的 BAC 序
列为探针进行 BAC-FISH 分析还可以有效的探测
同源多倍体中的亚基因组结构变异，可用以解释
一些同源多倍体具有类似异源多倍体染色体分离
的现象[34]。此外利用双色 GISH 将信号叠加可以
解决同源性高的问题：香蕉栽培种分别由 A、B、
S 和 T 等 4 个染色体组构成，对应的物种分别是
Musa acuminata，M. balbisiana，M. schizocarpa 和
Australimusa 属的物种，其中 A 基因组和 B 基因组
同源性很高(通过单色 GISH 无法将 A、B 基因组
区分开来)，A 基因组和 T 基因组间的同源性很低。
在检测有可能包含了 A、B 和 T 基因组的三倍体
栽培种 ‘Yawa 2’ 的基因组组成时，用了两种探针：
M. acuminate (AA)和 M. balbisiana (BB)，通过这两
种基因组探针的杂交信号叠加观察到有 22 条染色
体为 A 基因组，有 11 条染色体为 B 基因组，剩下
10 条没有杂交信号有可能是来源于 T 基因组，从
而成功鉴定出三倍体栽培种的基因组组成[35]。
3.2 物种间网状进化关系探讨
由 于 多 倍 化 和 自 然 杂 交 导 致 的 网 状 进 化
(Reticulate evolution)在 植 物 中 广 泛 存 在[36–37]，从
而进一步加剧了我们对多倍体形成机制理解的困
难。在没有足够的完整基因组遗传差异的情况下，
GISH 是理清网状进化关系最有效的工具。在利
用 GISH 对南芥属植物 Boechera holboellii 复合体
的研究中，观察到大量与倍性水平相关的网状进化
和种间杂交渐渗[38–39]。但对一些物种复合体，多倍
体的祖先基因组遗传差异却较小，GISH 往往不能
形成具有分辨性的荧光信号，此时若利用基因组上
一些快速进化区域，如 DNA 重复序列(Repetitive
sequence)作为标记探针进行 FISH 检测，就可以产
生物种基因组或者染色体特异的原位杂交信号，进
付文炎等：荧光原位杂交技术在植物多倍体起源与进化研究中的应用
318 第22卷热带亚热带植物学报
而区分基因组或者染色体类型，并检测出可能的基
因组杂交渐渗以及进行系统进化重建[17]。在烟草
(Nicotiana tabacum)中，几个与病毒相关的 DNA 呈
现出串联重复的形式，以它们作为 FISH 探针，对整
个 sect. Tomentosae 的系统进化关系进行了重构，
同时报道了普通烟草进化过程中经历的基因组重
组事件[19,40]。
4 多倍体基因组结构变异分析
物种多倍体形成以后其基因组往往会发生大
量的结构变异，如重复序列位点与数量、基因的增
加与删除、染色体数量、染色体结构(包括染色体组
内与组间的易位、倒位、互换)等的变异[41–45]。通过
荧光原位杂交技术可以准确地识别这些结构变异，
促进我们对多倍体早期进化的理解。
4.1 重复序列变化
4.1.1 转座子序列
基因组 DNA 重复序列主要包括串联重复序
列(Tandem repeat)和 转 座 子(Transposable element,
TEs)。相比串联重复序列，基因组转座子多呈现
分散式分布。根据最近 Wicker 等[46]的分类系统，
基因组转座子主要包括反转座子(Retrotransposon)
和 DNA 转座子(DNA transposon)两大类，其主要区
别在于前者的转位依赖反转录酶的存在，而后者不
依赖于反转录酶即可实现在基因组上的移动。反
转录转座子也分为两大类：具有长末端重复(Long
terminal repeat, LTR)的反转录转座子和无长末端
重复 LINE (Long interspersed nuclear element)类的
反转录转座子， 前者又可分为 Ty1-copia 类和 Ty3-
gypsy 类。反转录转座子以高拷贝的形式在植物界
中广泛分布，它可以通过纵向和横向方式分别在世
代之间和不同种之间进行传递，同一家族的反转录
转座子具有很高的异质性。当处在一些生物的和
非生物的逆境条件下时，反转录转座子的转录便可
以被激活[47]。
转座子最早是 McClintock[48]在玉米中发现的，
它是真核生物基因组的重要组成部分，玉米约 85%
的基因组为重复序列[49]、香蕉的约 55% 为重复序
列[50]，其中有许多都属于转座子序列。这些快速进
化的基因组重复序列多具有物种或者染色体特异
性，从而导致了广泛的基因组大小变化和遗传多样
性[51]。在模式植物拟南芥中，180 bp 的微卫星串
联重复序列是其着丝粒区域的主要成分[52]，而在油
菜中则主要为 176 bp 的串联重复序列[53]，其他植
物，如水稻为 155 bp[54]，玉米为 156 bp 和一个第四
染色体特异的 740 bp[55]，普通小麦则为 570 bp[56]。
之前的研究还报道了大量基因组或者物种特异转
座子元素，如水稻着丝粒区域特异的反转座子 CRR
家族[57]，棉花 AD 基因组特异的反转座子 Gorge3
家族[58]等。对于缺乏完整基因组信息的物种，利用
低深度(< 1% 的基因组覆盖)NGS 测序分析可有效
地发掘出物种主要的重复序列家族。最近，利用罗
氏 454 测序仪对豌豆(Pisum sativum)进行仅 0.77%
的测序覆盖便获得了占完整基因组约 35% ~ 48%
的重复序列的主要家族类别[59]。利用生物信息学
分析选择一定的重复序列制成 FISH 探针便可用
来进行基因组组成和网状进化相关的分析。通过
FISH 用 Matita (一种 LTR 反转座子)作为标记探测
异源四倍体花生基因组，结果表明其在 A、B 染色
体组上的分布都是相似的，这种染色体特异性结合
的模式可以用于花生染色体的鉴定，并且这类转座
子并不是随机分布在基因组上而是倾向于分布在
类似抗性基因的周围[60]。目前虽然找到了许多物
种的转座子序列用以研究物种的进化，但是专门用
来分析多倍体基因组进化的转座子序列还相对较
少，有待进一步加强。
4.1.2 rDNA 序列
rDNA，即核糖体 DNA，可以转录形成 rRNA，
然后结合成核糖体的大小两个亚基并在细胞质中
与 mRNA 结合形成核糖体。由于 rDNA 有一定
的保守性，所以常被用于鉴定物种的同源性。通
过 PCR 技术和荧光染色技术相结合能准确定位
rDNA 在染色体上的位置，通过杂交信号能得知
rDNA 的位点数与染色上的位置，作为判定物种同
源性的证据。
这种方法也被用于鉴定多倍体基因组的进化，
将多倍体与潜在二倍体亲本的 rDNA 位点与数目
进行对比可以清楚显示出由多倍体化导致的基因
组组成上的变化，如用 rDNA 序列作为标记，对异
源多倍体变色鸢尾(Iris versicolor)基因组进行 FISH
研究，结果表明其所有的 18S-26S rDNA 单元都来
自于同一个祖先 I. virginica，而 5S rDNA 位点的单
元却来自于两个祖先，有两个应该来自于 I. setosa
祖先的 5S rDNA 位点缺失了，因此推断，18S-26S
第3期 319
rDNA 位点与其中一个祖先相似暗示了染色体二
倍化的第一个阶段[29]。通过 FISH，以 45S rDNA 为
标记，分别与四倍体细弱剪股颖(Agrostis capillaris)
(A1A1A2A2)和 四 倍 体 匍 茎 剪 股 颖(A. stolonifera)
(A2A2A3A3)的染色体进行杂交，结果表明，与二倍体
相比，该位点在这两种多倍体中的分布都有变异，
说明该属在进化的过程中基因组发生了改变[61]。
人参属包含 3 种植物：人参(Panax ginseng)、西洋
参(P. quinquefolius)和三七(P. notoginseng)，以 45S
rDNA 和 5S rDNA 为探针进行 FISH 研究，结果二
倍体三七和四倍体人参的杂交信号都聚集于 1 个
位点，但是位于不同染色上，而西洋参有 2 个 5S
rDNA 位点和 1 个 45S rDNA 位点。用其他物种
的 DNA 作为标记进行 GISH 研究，结果表明，染色
体上的杂交信号很少。这些可以推断人参和西洋
参的同源性最高，并且这些种是近几年才开始分
化[62]。以 45S rDNA 为探针，分别与现代月季(Rosa
chinensis)的 5 个四倍体品种(‘和平’、‘粉和平’、‘奇
异玫瑰’、‘红双喜’和‘蜜糖’)进行荧光原位杂交研
究，结果表明杂交位点数量均为 3 个，与 Ma[63]报道
的 4 个不同，其原因有可能是在人工选择的多倍体
进化过程中染色体发生了不等交换和转座，或者是
倾向于向某一亲本的 45S rDNA 进化，源于另一方
亲本的 45S rDNA 基因表达受到了抑制[64]。
4.2 染色体数量变异
多倍体形成后其染色体数目并不完全是两个
亲本 2n 型配子染色体数目的总和，在一些多倍体
后代中往往会存在非整倍体，即比预期的染色体
数量少几条或多出几条，如通过 FISH 研究，异源
多倍体假韭(Nothoscordum gracile)的核型有两种：
2n = 18 (14M + 4A)和 2n = 19 (13M + 6A)，而其二
倍体的核型为： 2n = 10 (6M + 4A)，正常的四倍体
应该为 2n = 20 (12M + 8A)，结合一些 FISH 标记的
rDNA 位点信息和染色体配对情况，推断 2n = 19
(13M + 6A)这种情况是两条 A 染色体通过着丝粒
融合形成的，并且这种非整倍性会在多倍体后代中
稳定的延续下去[65]。Grant[1]认为植物细胞的兼容
性是很大的，所以才有稳定的非整倍体出现，如有
报道吉尼亚春美草(Claytonia virginica)非整倍体的
染色体数目从 12 ~ 191 条不等[66]。有人认为非整
倍体的植物能存活主要是受到了基因组加倍的保
护，所以由非整倍性在二倍体中所造成的危害在多
倍体中被减轻了。最近的一项研究也同样表明多
倍体后代会产生一系列的非整倍体植株，利用基因
组特异性标记序列对人工合成的异源多倍体拟南
芥后 8 代进行 FISH 研究，若后代中染色体数目正
常则应该含有来自亲本 A. suecica 和 A. thaliana 的
20 个绿色标记，16 个红色标记，结果后代含有的
绿色标记为 17 ~ 22 不等，红色标记为 15 ~ 17 不等，
这说明染色体数目在多倍体后代的变异很大。学
者们认为这种改变也许与新表型的产生有关，从而
能在自然选择中占有优势，不仅促进了单一物种的
形成，还促进了一系列新物种的形成[67]。
4.3 染色体结构变异
由于新形成的多倍体会受到“杂合性”和“多倍
性”所带来的基因组冲击(Genomic shock)，为了抵
抗这种冲击而得以繁衍，其基因组会作出一系列的
适应性反应，这些变化直接关系到新形成的异源多
倍体物种基因组的稳定和进化。在多倍性形成的
早期会发生广泛的基因组构成和基因表达水平的
变化，对内让异源的基因组能相互容纳，对外产生
适应环境的表型变异。在基因组构成上的变化主
要是染色体组重排，而在表达上的变化主要有基因
沉默和表达量上的变化。通过 GISH 与 FISH 能有
效探测到多倍体基因组的互换与染色体易位等结
构变异。
在鉴别染色体的结构变异中，最开始采用的
是银染联会复合体(Ag-SC)的电镜观察法，这种方
法可准确定位易位的断点，但识别易位染色体十分
困难。分带技术在一些植物中可准确识别易位染
色体，但难确定易位的断点。运用原位杂交技术可
以很好地克服上述方法的不足，可以通过杂交信号
在染色体上的分布来识别染色结构的改变。通过
GISH，以四倍体细弱剪股颖(A1A1A2A2)和匍茎剪
股颖(A2A2A3A3)为实验对象，用假定的一个二倍体
祖先种普通剪股颖(A1A1)的基因组为标记，结果在
一些染色体只有部分有杂交信号，这可能是由于异
源染色体之间的互换导致的[60]。Barba-Gonzalez[68]
通过 GISH 研究表明，百合属(Lilium)人工合成的
F1 代多倍体中存在 A 与 O 基因组重组的现象，并
且验证了这种重组对回交一代遗传多样性的影响。
通过 FISH 实验，利用分布在小麦 4A 染色体上的
Acc-2 标记与小麦染色体进行杂交探测出了在 5A
染色体上也有杂交信号，说明了 4A 与 5A 染色体
付文炎等：荧光原位杂交技术在植物多倍体起源与进化研究中的应用
320 第22卷热带亚热带植物学报
的易位，并且在一些近源的二倍体和多倍体物种中
也都有类似易位现象的存在，说明它们起源于同一
个 A 基因组祖先种[69]。通过 GISH 对异源四倍体
烟草(Nicotiana tabacum)的后代进行研究，结果在
三代以前的个体中基本都能观察到明显的染色体
易位位点，三代以后则很少出现染色体易位现象，
在其他近缘的异源多倍体上没有明显的易位位点，
这说明染色体易位在烟草属多倍体中并不是一个
广泛存在的现象，并且染色体易位出现在多倍体形
成的初期，以后趋于稳定，因此推断这种现象有可
能是由核质互作(Nucleocytoplasmic interaction)引
起的，以提高细胞对异源染色体的耐受性[70]。
目前有关核质互作导致的染色体易位现象的
研究已有不少，但很少涉及到环境对多倍体产生与
进化的影响。在最近的一项研究中，以不同生境中
的梭罗草(Kengyilia thoroldiana)为实验对象，通过
GISH 观察其染色体重组情况，结果表明在寒冷的
草原和高原上生长的居群比湖盆山谷生长的居群
的染色体重组率更高一些，其遗传多样性也更高一
些，这说明在恶劣的气候条件下更容易促使多倍体
染色体的重组，以产生适应环境的新表型，从而促
进多倍体的进化和新物种的形成[71]。
5 展望
荧光原位杂交技术已被广泛用于多倍体基因
组起源与进化的研究中，与传统方法相比，其优势
在于能更精确更高效地探测基因组的组成，指示特
异性序列在染色体上的分布位置和数量，但其劣势
在于不能定量去研究基因组变异的程度，只能通过
杂交信号的强弱对比在不同物种中目的片段拷贝
数的多少，这一点可以通过与 PCR 技术相结合而
得以实现。目前 GISH 与 FISH 主要运用在多倍体
基因组识别、杂交种亲本鉴定、多倍体复合群体起
源、物种形成以及多倍体形成后基因组改变的研究
上，如染色体重组、重复序列变异等。该项技术不
仅可以对多倍体基因组进行一些描述性分析，还可
以用于研究多倍体形成的机制，例如与环境互作、
适应性进化等。同时 FISH 探针的选择大多用的是
rDNA，而利用转座子这一广泛散布在植物基因组
的序列来研究多倍体基因组组成与进化的报道相
对较少，所以在以后的研究中可以进一步利用基因
组串联重复序列和转座子开发更多新类型的探针
去描述与鉴别多倍体基因组，并且运用到多倍体形
成与适应性进化相关机制的研究当中，使该项技术
得到更加广泛和深入的运用。
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