全 文 ：兰科(Orchidaceae)是种子植物的一大家族，约
有 800 属 25000~30000 种[1]。目前，所有的野生兰
花均被列入 《野生动植物濒危物种国际贸易公约》
(CITES)，对于重点保护的珍稀濒危兰花种类，急需
了解其生物学和生态学特性[2]。兰科植物的种子
数量巨大，一个蒴果内包含上万粒粉尘状的种子，
然而兰花的种子胚发育不完全，没有胚乳，在自然
条件下种子必须有特定真菌为其提供营养才能成
功萌发，随后建立稳定的共生关系，直到发育成植
株[3–4]。目前，许多兰科植物的种子建立了成熟的无
带叶兜兰种子原地共生萌发及有效菌根真菌的分
离与鉴定
孙晓颖, 张武凡, 刘红霞*
(北京林业大学林学院，北京 100083)
摘要： 为获得带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimum)种子萌发的共生真菌，采用原地共生萌发技术获得了 2 株自然萌发的小幼
苗，并分离和筛选出了有效的种子萌发共生菌——瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)。为验证分离菌株对带叶兜兰种子萌发的有效性，
将 Phs34 号菌株与带叶兜兰种子在灭菌后的原生境基质上进行室内共生萌发试验，结果表明，经过 6 周的培养，对照组没有观
察到种子的萌发；接菌的种子胚明显膨大，突破种皮，形成原球茎，平均萌发率为(58.35±3.41)%。这表明分离得到的瘤菌根菌
能促进带叶兜兰的种子萌发。
关键词： 带叶兜兰； 种子原地共生萌发； 共生真菌； 瘤菌根菌属
doi: 10.11926/j.issn.1005–3395.2015.01.009
In situ Symbiotic Seed Germination, Isolation and Identification of Effec-
tive Mycorrhizal Fungus in Paphiopedilum hirsutissimum (Orchidaceae)
SUN Xiao-ying, ZHANG Wu-fan, LIU Hong-xia*
(College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)
Abstract: The aim was to obtain the compatible mycorrhizal fungi of lithophytic Paphiopedilum hirsutissimum
using in situ seed baiting technique. Two natural small seedlings were harvested after in situ seed germination. The
effective symbiotic fungi of genus Epulorhiza were isolated from these developed seedlings. In order to verify the
effect of the isolated fungal strains on seed germination, one of strains, Phs34, was used to the in vitro symbiotic seed
germination of P. hirsutissimum on the sterile habitat substrate. After cultured for 6 weeks, seeds inoculated with
Phs34 started to develop into protocorms and average germination rate was (58.35±3.41)%, whereas seeds without
the fungus failed to germinate. These indicated that the fungal strain Phs34 was compatible mycorrhizal fungus of P.
hirsutissimum, and it will be helpful in seedling production and orchid conservation of P. hirsutissimum.
Key words: Paphiopedilum hirsutissimum; In situ symbiotic seed germination; Symbiotic fungi; Epulorhiza
收稿日期： 2014–04–11　　　　接受日期： 2014–05–07
基金项目： 国家科技支持计划项目(2008BAC39b05)；广西科学研究与技术开发计划主席基金项目(09203-04)资助
作者简介： 孙晓颖(1986~ )，女，博士研究生 , 研究方向为兰科植物菌根生物学。E-mail: sunxiaoying121@163.com
﹡通信作者 Corresponding author. E-mail: hongxia@bjfu.edu.cn
热带亚热带植物学报　2015， 23(1)： 59 ~ 64
Journal of Tropical and Subtropical Botany
60 第23卷热带亚热带植物学报
菌萌发技术，但无菌幼苗出瓶后的成活率低，易感
病，难以用于野外回归和规模化人工繁育；而通过
种子与合适真菌共生萌发得到带菌幼苗，具有很好
的环境适应性。因此，获得种子萌发阶段的有效共
生真菌，是兰科植物菌根研究与兰花保育的关键环
节[5]。
为了获得兰科植物种子萌发阶段的共生真
菌，Rasmussen 等[6]发明了兰科植物种子原地共生
萌发技术(in situ seed baiting technique)，他们将兰
花种子装入尼龙膜制成的袋子中，埋于兰科植物
原生境，一段时间后，观察种子袋内的种子是否萌
发，随后可从萌发的原球茎或小幼苗中分离得到共
生真菌，这项技术可应用于兰花种子的生物学和
种子共生真菌的研究。在国际上，该项技术已成
为兰科菌根真菌研究及兰花保育中的一项常用技
术[2]。然而，在国内，该项技术只成功应用于铁皮石
斛(Dendrobium officinale)和 金 钗 石 斛(Dendrobium
nobile)[7]及兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)[8]。
兜 兰 属(Paphiopedilum)植 物，又 称 为“拖 鞋
兰”，在园艺界负有盛名。兜兰作为兰科植物中最
诱人的花卉之一，深受世界各地人们的喜爱。由于
自然生境的破坏和人为过度采集，野生兜兰种群受
到巨大威胁。所有的野生兜兰都列为 CITES 附录
1 中[9]。目前，全世界共有兜兰属植物 79 种，中国
是全球兜兰种类最多的国家，达 27 种。然而，中国
学者对兜兰植物的研究起步很晚，20 世纪 40 年代
才开始比较正式地研究兜兰植物[10]。有关兜兰菌
根的研究报道较少，主要针对成年兜兰植物菌根内
生真菌的分离与鉴定[11–13]。
本文以雅长兰科植物自然保护区分布的带叶
兜兰(P. hirsutissimum)为研究对象，利用种子原地
共生萌发技术诱导种子萌发，获得原球茎( 或小幼
苗)，分离其中的共生真菌，将分离得到的真菌和兰
花种子在灭菌后的原生境基质上进行室内共生萌
发试验，筛选出对带叶兜兰种子萌发有促进作用的
共生真菌，为带叶兜兰菌根研究和保育奠定基础，
也为其它兰科植物的综合保护和人工繁育提供理
论依据与技术参考。
1 材料和方法
1.1 研究地点和材料
研究地点为兰科植物种质基因园，位于广西西
北部乐业县的雅长兰科植物自然保护区(24°85′ N，
106°38′ E)内，属桂西中亚热带季风气候区[14]。兰
科植物种质基因园是自然与半自然状态相结合的
野生兰科植物原地与迁地保护园，有原生地野生兰
花 22 属 41 种，其中野生带叶兜兰居群数量巨大。
带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimum)为兜兰
属地生或石上附生兰，广泛分布于云南东南部、贵
州西南部、广西西北部；印度东北部、老挝、缅甸、泰
国北部和越南北部等地，生于石灰岩地区岩石缝隙
基质中[10]。在雅长兰科植物自然保护区，带叶兜兰
花期为 4–5 月(图 1: A)，果实成熟期为 10–11 月(图
1: B)。2010 年 10 月下旬采集自然授粉结实，发育
良好，未开裂的带叶兜兰蒴果。随机取 1 个果荚，
用 75% 酒精反复擦拭果实表面，切开果荚取出种
子，经 TTC (2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色法[15]检
测，带叶兜兰的种子活力在 60% 以上(图 1: C)。其
余蒴果在 4℃下干燥保存备用。
同时收集带叶兜兰原生境的腐殖质及枯枝落
叶，用于分离真菌对种子萌发的有效性检测时的培
养基质。
马铃薯燕麦(POA)双抗培养基：马铃薯 50 g，燕
麦 8 g，琼脂 17 g，蒸馏水 1 L，pH 自然。依照常规
生物学试验方法，配制分离培养基，121℃高压湿
热灭菌 20 min，待培养基冷却至 45℃左右，加入青
霉素(50 μg mL–1)和链霉素(50 μg mL–1)，摇匀迅速
制备平板，每个平板约 35 mL 培养基，用 9 mm 的
打孔器在平板上挨个打孔，用灭菌牙签将打好的小
块培养基放入灭菌的空培养皿中，每皿 10~20 个，
一个平板(9 cm)约可以制作 60 块小培养基块。
1.2 种子的原地共生萌发
选择孔径为 50 μm (300 目)的尼龙膜，采用热
封处理的方法制成种子袋。这种尼龙膜可以将种
子保留在膜内，而且真菌菌丝可以穿透生长。先
将尼龙膜剪裁成 10 cm 宽的长条，对折后，每间隔
3 cm 热封，做成 3 个小室相连的种子袋，每个种子
袋约为 3 cm×5 cm，在种子袋的左上边缘系上标签
(图 1: D)。取低温干燥保存的带叶兜兰蒴果 1 个，
用 75% 酒精擦拭果荚表面，打开果实，将种子洒入
0.3% 的糊状水琼脂中，用小药勺轻轻将种子分散，
混合均匀，制成种子悬浮液(图 1: E)，均匀涂抹于
种子袋内，种子袋每个小室内约涂抹 300 粒种子。
2011 年 5 月，将制作好的种子袋埋于广西雅长兰
第1期 61
科植物自然保护区兰科植物种质基因园野生成年
带叶兜兰根部附近(图 1: F)，以周围的腐殖质覆盖。
共选取 7 个样点，每个样点埋放 10 个种子袋，共计
70 个种子袋。12 个月后，对种子袋进行检查与回
收。野外带叶兜兰种子的萌发率≈萌发的原球茎(或
小幼苗)/(回收的种子袋数×3×300)。
1.3 共生真菌的分离
原地萌发的带叶兜兰原球茎(或小幼苗)，同种
子袋一并装入自封袋或小心装入 5 mL 离心管，以
原地腐殖质或苔藓等填充保护，尽快带回实验室。
在自来水下清洗，用柔软的毛笔小心除去原球
茎(或小幼苗)表面的土壤及杂质。在超净工作台上，
原球茎(或小幼苗)用 75% 的酒精浸泡 20~30 s，再
用 1% 的 NaClO 灭菌 4 min，无菌水清洗 3~4 次。
在无菌空皿里加 500 μL 无菌水，一手用无菌
镊子夹住已消毒的原球茎(或小幼苗)，一手用无菌
手术刀尖轻轻地将其刮碎，越细越好，使菌丝团充分
释放出来，如果是小幼苗只需处理根部。用 200 μL
移液枪将菌丝团悬浮液转移至 1.5 mL 离心管中，
再向培养皿中加少量无菌水冲洗，将剩余的菌丝团
悬浮液全部转移至离心管。转移时利用枪头的阻
挡，尽量不要吸取较大的植物组织。
上下摇动离心管，混匀菌丝团悬浮液，用 10 μL
移液枪吸取 5~8 μL 菌丝团悬浮液滴于每小块 POA
双抗培养基上。以最后一次漂洗原球茎(或小幼苗)
的水作为对照，用封口膜密封培养皿，标明分离信
息，置于 25℃培养箱中培养。每隔 3 d 观察 1 次，
待小块培养基上长出菌丝后，将小培养基块转移至
POA 培养基平板上进行纯化培养，纯化后的菌株以
POA 试管斜面 4℃保存备用。
1.4 真菌对种子萌发的有效性检测
在带叶兜兰原生境收集的枯枝落叶和腐殖质，
自然风干，用燕麦水饱和后，121℃高压灭菌 1.5 h
(图 1: H)，将基质分装于培养皿内，接入从原球茎
(或小幼苗)分离到的真菌菌株(编号为 Phs34)，培养
1 周后菌丝长满基质(图 1: I)。
取带叶兜兰未开裂的蒴果，用 75% 酒精反复
擦拭蒴果表面以除去果皮绒毛，在超净工作台上，
用 75% 的酒精浸泡 30 s，再用 4.5% 的 NaClO 灭菌
8 min，无菌水清洗 3~4 次。将蒴果置于事先放置
无菌滤纸的培养皿内，一只手用镊子夹住蒴果，另
一只手用解剖刀纵切果实，取出种子。在上述长满
菌丝的基质上铺合适大小的无菌滤纸，在滤纸上播
撒带叶兜兰种子(图 1: J)，用封口膜密封培养皿，标
明信息，置于 25℃下黑暗培养。以不接种真菌的基
质上播撒带叶兜兰种子作为对照，每种处理重复 4
个平板。共生培养 6 周左右统计萌发率。
1.5 真菌种类的分子鉴定
挑取燕麦液体培养基培养的 Phs34 号菌株的
菌丝球，用无菌滤纸吸干多余水分，使用普通植
物 基 因 提 取 试 剂 盒(TIANGEN, China)提 取 菌 株
的 rDNA。利用 ITS1/ITS4 对真菌 rDNA 上的 ITS
区域进行 PCR 扩增。扩增反应体系(25 μL)包括：
16.25 μL ddH2O，2.5 μL 10×PCR buffer，2.5 μL
dNTP (2.5 mmol L–1)，1 μL ITS1 (10 mmol L–1)，
1 μL ITS4 (10 mmol L–1)，0.25 μL Taq 聚合酶，1.5 μL
DNA。PCR 扩增反应程序为：95℃预变性 5 min，
然后 95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，共 30 个循环，
最后 72℃延伸 10 min。取 4 μL 扩增产物用 1.2%
琼脂糖凝胶电泳检测，有明亮单一条带的扩增产物
送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。
得到的真菌正反两条序列用 DNAMAN 软件中的
“Sequence assembly”程序拼接成一条 ITS 序列，如
果拼接时碱基不匹配，根据峰值图，进行人工校对。
登录 GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行
在线比对。
2 结果和分析
2.1 带叶兜兰种子的原地共生萌发
2012 年 5 月，种子袋埋放 12 个月后进行检查
与回收。7 个样点中种子袋都有不同程度的丢失，
共回收 59 个种子袋，其中 3 号和 4 号样点各有 1
个种子袋的 1 个小室有种子萌发形成小幼苗(图 1:
G)。野外带叶兜兰种子的萌发率约为 3.8×10–5。
2.2 共生真菌的分离
约 1200 μL 菌丝团悬浮液滴加到 150 个小块
POA 双抗培养基，经过一个月的不断纯化，有 94 个
小块培养基长出菌丝，所有真菌菌株在 POA 平板
上，形态特征相同，呈奶白色或淡黄色，菌丝稀薄，
气生菌丝不发达，有特殊的芳香气味(图 1: K)；光学
显微镜下观察，无孢子，菌丝有隔，呈直角分支，有
孙晓颖等：带叶兜兰种子原地共生萌发及有效菌根真菌的分离与鉴定
62 第23卷热带亚热带植物学报
图 1 带叶兜兰种子原地共生萌发及有效菌根真菌的分离与鉴定。A: 带叶兜兰的花； B: 带叶兜兰的蒴果； C: TTC 染色的种子； D: 三联种子袋；
E: 种子悬浮液； F: 种子袋的埋放； G: 带叶兜兰种子原地共生萌发 1 年的小幼苗； H: 用于种子室内共生萌发的灭菌基质； I: 接种真菌； J: 播散
种子； K: 分离菌株的菌落形态； L: 呈直角分支的菌丝和念珠状细胞； M: 种子室内共生萌发的对照处理； N: 接入 Phs34 菌株 6 周后，种子膨大
萌发。
Fig. 1 In situ symbiotic seed germination, isolation and identification of effective mycorrhizal fungus in Paphiopedilum hirsutissimum. A: Flowers of
Paphiopedilum hirsutissimum; B: Capsule of P. hirsutissimum; C: Seeds stained with triphenyl terazolium chloride (TTC); D: Triple packet; E: Seed
suspension; F: Place of seed packet; G: Seedling of P. hirsutissimum after in situ symbiotic seed germination for 1 year; H: Sterilized substrates used
In vitro symbiotic seed germination; I: Inoculation of fungal isolate; J: Sowing of orchid seeds; K: Colony morphology of fungal isolates; L: The right-
angle branching mycelia and chains of swollen monilioid cells; M: Control of symbiotic seed germination; N: Germination of seeds inoculated fungal
isolate Phs34 after 6 weeks of sowing.
第1期 63
念珠状菌丝(图 1: L)。
2.3 真菌对种子萌发的有效性检测
带叶兜兰种子室内萌发培养 6 周后，不接菌
的对照组没有观察到萌发的种子(图 1: M)；接入
Phs34 号菌株的种子胚明显膨大，突破种皮，形成原
球茎(图 1: N)，平均萌发率为(58.35±3.41)%。
2.4 真菌种类的分子鉴定
菌株 Phs34 测序后，得到的 ITS 片段经过 Blast
对比分析，与登录号为 FJ613228 的瘤菌根菌属真
菌(Epulorhiza sp.)最为相似，最大相似度为 99%。
根据菌株形态和分子特征以及能促进带叶兜兰种
子萌发等特性，可以判定以 Phs34 号为代表的从带
叶兜兰小幼苗根部分离到的真菌为带叶兜兰的菌
根真菌。
3 讨论
获得兰科植物种子萌发阶段的有效共生真菌，
是兰科植物菌根研究与兰花保育的关键环节，以种
子袋为基础开展的兰科植物种子原地共生萌发技
术是兰科植物种子的生物学和种子共生真菌研究
的有效方法。兰科植物种子数量巨大，但自然萌发
率极低，通过本研究带叶兜兰种子自然萌发率约为
3.8×10–5。如何从数量有限且体积较小的原球茎(或
小幼苗)中分离得到共生真菌，分离方法和分离培
养基是关键因素。菌丝团(Peloton)是兰科菌根真菌
在兰科植物原球茎或植物根部细胞内形成的特殊
结构[16]。本研究参考从成年兰科植物根部分离菌
根真菌的“菌丝团分离法”并加以改进[17–19]，成功从
自然萌发的小幼苗中分离得到种类单一且对种子
萌发有促进作用的共生真菌。
长期以来，兰科植物种子室内共生萌发多是使
用人工配制的燕麦培养基[20–22]作为共生培养基，也
有用壳斗科(Fagaceae)植物叶片[23]或栎树(Quercus
sp.)树皮[24]作为共生基质。本研究中，我们使用灭
菌后的原生境腐殖质及枯枝落叶作为分离菌株与
带叶兜兰种子共生萌发的培养基质，带叶兜兰的种
子能成功萌发，这为今后室内共生萌发又提供了一
种可参考的共生培养基质。
本研究利用种子原地共生萌发技术成功获得
带叶兜兰的小幼苗，并从中分离出能促进带叶兜兰
种子萌发的共生真菌，为进一步开展带叶兜兰菌根
真菌研究及其保育工作奠定基础，同时也为我国兰
科植物的综合保护与利用提供可参考的研究案例。
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