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第 2期 易润华等 ：广东省水稻纹枯病菌遗传多样性与致病力分化的研究 163
表 1菌株的采集地及采集时间 (1999年)
Table I Sampling sites and date ofthe isolates ofRhizoctonia flani AG_I IA(1999)
菌株编号 采集地 采集时间 菌株编号 采集地 采集时间 菌株编号 采集地 采集时间
Code of Sampling Sampling Code of Sampling Sampling Code of Sampling Sampling
isolates site date(M／D) isolates site date(M／D) isolates site date(M／D)
。Y--- 磊咖 肿 NX-15 N南雄anx g ⋯
DY-17 肿 NX-17 N南雄
anx g
⋯
DY-20
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肿 ⋯ ⋯
DY-23
种
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7／7 QJ-22
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7，l7 SY-25
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gzh。 7／8
GZ-12
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g
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G
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， Q瑚 肿 sY一 ，s
GZ．6 州 ． 7／7 JX．1l 7／l6 ZJ．10 江 一 7／6
Uaozhou Jlexi Zhanltang
Nx．1 粤雄． 7／l9 JX-14 7／l6 7_J．17 江． 7／6
Nanxiong Jlexi Zhanjtang I
Nx-l l 粤雄．
一
7／l9 Jx-l7 7／l6 一2l 湛
Zh
江
anj． 7／6Nanxi
ong Jlexi anjtang
l
NX．1 3 尊雄． 7／l9 JX．20 7／l6 ZJ．2 江一 7／6 l
NanXIon JIeXi Z hanllan
1．3 DNA提取
用经适当改进的 McDonaldI 】方法。将菌株接种到装有 70 ml PDB(马铃薯 200 g，葡
萄糖 20 g，水 1 000 m1)培养基的 250 ml三角瓶 内，25c静置培 养 2—4 d，在 菌核形成前
收集菌丝 ，经灭菌水冲洗 2—3次，用 灭菌滤纸挤压吸干 。(1)取 0．1—0．2 g吸干 的新鲜菌
丝 在研钵 中加少 许石 英砂 、800 u l CTAB(十 六烷 基三 乙基 溴化 铵)提 取 缓冲 液 (含
0．7 mol／L NaCI，lO0 mmol／L Tris-HCI pH 8．0， 20 mmol／L EDTA，1．0％ PVP-360(w／v)，
2．0％ CTAB(w／v))，0．1％ 13-巯基 乙醇 ，研 磨充分后转入 1．5 ml Eppendorf管中 65c保
温 30—60 min，保温期间轻摇 3—4次。(2)冷却至室温加等体积氯仿 ：异戊醇 (24：1)，充分
混匀，5 000 X g离心 5 min。(3)取上清液重复(2)一次。 (4)取上清液加等体积的 CTAB沉淀
液(1％ CTAB(w／v)，50 mmol／L Tris-HCI，pH8．0，l0 mmol／L EDTA)充分摇匀 ，5 000 xg离心
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热带 热 带植物 学报 第 l0卷
5 min弃上清 液 ，加 l mol／L NaCI 300 la l重 新溶 解 ，3 u ll0 g L’RNase液 ，37~C保温
40 min降解 RNA。(5)加等体 积氯 仿 ：异 戊 醇充 分混 匀 ，静置 10 min，8 000 xg离 心
10 min。(6)将上 清液加 入 2．5体积 的冷 冻无水 乙醇 ，待 DNA析 出后 ，8 000 xg离心
5 min，弃 上 清 夜 。(7)70％酒 精 洗 2—3次 ，弃 70％酒 精 ，晾 干 。 用 100 u l 11三(含
10 mmol／L Tris—HCI，l mmol／L EDTA pH 8．0)缓冲液充分溶解 ，_20~C保存备用 。
1．4 引物筛选
从 100个 l0 bp的寡聚核苷酸随机 引物 (SanGon公司 )中筛选 出了扩增 图带数多且
清晰的 l0个引物用于 RAPD扩增 ，进行 DNA遗传标记和 DNA指纹图谱分析(表 2)。
表 2所选引物及其序列
Table 2 Primers used in the study and their sequence
1．5 PCR扩增程序
PCR反应在 PCR仪 (Perkin Elmer 2400)上进 行。反应体系总体积 20 u l，工作液含
50 mmol／L KCI，10 mmol／L Tris-HCI，0．1％ Triton X 100，3．0 mmol／L MgC12
， Taq DNA 聚
合酶 1．0 U(华美生物工程公司)，1 pmol／L的随机引物，6 ng la l 左右 DNA模板。
PCR扩增经 94~C预变性 2．5 min后进入循环 ，94~C变性 l min，36~C复性 1 min，72~C
延伸 3 min， 38个循环 72℃延伸 15 min。 PCR产物在 lxTBE缓冲液 (89 mmol／L Tris
碱，89 mmol／L硼酸 ，2 mmol／L乙二胺 四乙酸，pH 8．0)下经 1．5％琼脂糖凝胶 电泳和溴化
乙锭染色后 ，用凝胶成像系统拍照 ，打印。
1．6 数据分析
电泳后根据 入DNA各酶切片段大小估计扩增出的片段大小。DNA指纹 图谱 中的每
一 条 RAPD谱 带均为一个分子标记，并代表引物结合位 点，根据分子量大小及带的有 无
分别记为 1或 0，有 DNA扩增条带记为 1，没有记为 0，弱带或 强带均记为 1。根据 Lynch
和 Miligan[14l方法计算基因多样度和群体遗传分化系数 。以 NeiI·51公式计算两菌株 间的
遗传一致度 ，用非加权配对 算术平均法(UPGMA)聚类 ，用 Popgene 1．32软 件161分析 O／l
矩阵，生成菌株遗传分化树形图。
。 熹i
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2 结果和分析
2．1 致病 力测 定
在温室(25—28oc)下 ，各菌株都产生典型的纹枯病病症。发病初期 ，在近水面的叶鞘上出
现水渍状 ，暗绿色，边缘不清楚的小斑点 。以后逐渐扩大形成椭 圆形或云纹状斑块 。病斑中央
灰绿色至灰褐色 ，或草黄色或灰白色，边缘暗褐色，有的病斑 中心半透明。病斑多时互相连接
形成大的不规则云纹斑，病斑长的达 8．2 cm。有的菌株在水稻茎秆上形成菌核 ，有的在茎秆
间形成白色的菌丝网。
所有菌株对水稻品种 Tetep都有致病性 ，未发现无毒性菌株的存在。菌株在 Tetep上的
致病力差异显著( =0．05)，病情指数范围在 0．73一l8．7之间(表 3)，大部分菌株表现为中等致
病力，菌株的平均病情指数为 5．24。从东源采集的菌株 DY-9毒性最强 ，病情指数为 l8．7，而
菌株 DY．17和菌株 NX．17的致病力最弱 ，病情指数为 0．73。致病力与地理来源的相关性不
明显，但从揭西采集的菌株致病力比其它地方强些，平均病情指数为 6．77。
表 3 水稻纹枯病菌株病情指数
Table 3 Disease index of rice variety Tetep infected by Rhizoctonia sohmi AG-I IA
Duncan新复极差测验，均数间具有相同字母表示差异 显著。Means in a each column followed by the same
leter are not signifcantly diferent according to Duncan’S test fd=0．05)．
2．2 RAPD扩增结果
利用筛选好的 l0条 随机引物对 48个菌株进行 RAPD分子标记 ，获得 了大量的清晰
可重复的 DNA指纹图谱 (图 1)。单个 引物所标记的 DNA片段大小在 200—2 000 bp之
间，每条引物对水稻纹枯病菌扩增 的 DNA 条带数 不同，在 7一l3条之 间 ，多态性 片段 带
数在 6一l2条(表 2)，l0个 引物总共扩增出 98条 DNA指纹带 ，多态性 图带数为 88条 ，
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热带 亚热 带植物 学报 第 l0卷
多态性测率为 89．90％，表明不同菌株之间表现出丰富的遗传多样性 。
tOOObp
600bp
图 1引物 S163和 s143对部分水稻纹枯病菌菌株扩增的 RAPD指纹图谱
Fig．1 RAPD banding patterns of Rhizoctonia ．~olani AG·1 IA with primer S163 and S143
泳道 1—6为引物 s163 PCR扩增结果，7—13为引物 S143 PCR扩增结果，M 为 kDNA
标准分了量 Lanes 1 to 6 show amplifed DNA bands with prime S163，and lanes
7to 13 with S143．M ．100bp hDNA marker．
DNA指纹 图谱表明没有特异性扩增片段与菌株的地理来源有关，即与菌株 的来源
无直接 的相关性。用 同一引物对水稻纹枯病菌菌株进行扩增，所标记 的指纹 图谱在地区
内及地 区间的菌株均表现 出较大差异。10条引物扩增出的 DNA谱带不能将不同地理来
源 的菌株区分开来 ，许 多引物扩增 出的 DNA 片段为所有菌株共 有 ，这些 片段在进化 上
也许属于保守序列，是否可以用来作为检测水稻纹枯病菌 的分子标记需要进一步研 究。
2．3 菌株 的聚类分析
从 Nei’S遗传距离生成的树形 图(图 2)可 以看 出，在相似性 系数 为 0．7时 ，48个水稻
纹枯病菌明显聚成 A、B、C、D、E 5个类群。类群 A 的菌株地理来源复杂，包括 东源菌株
7个，南雄菌株 3个 ，揭西和湛江菌株各 2个 ，高州菌株 1个。类群 B包括 曲江菌株 6个 ，
广州和南雄菌株各 1个 。类群 C包括揭西和南雄菌株 各 5个 ，湛江和高州菌株各 2个 。
类群 D基本上 由广州菌株聚集而成 ，包括 8个广州菌株和 1个 曲江菌株。类群 E仅 由 2
个高州菌株聚类 组成。
水稻纹枯病菌菌株 间系统聚类 比较 复杂 。同一地 区的菌株分属 多个不 同的 RAPD
聚类组群 ，但 以 1—2个 RAPD聚类组群 为优势群 ，在每个组群中同一地理 来源 的菌株先
聚类在一起 。从树形图中可见，广州市水稻纹枯病菌分别聚类于组群 B和 D，以组群 D
为主要的组群，其 中 SY一24聚类在 B组群中。曲江菌株 以组群 B为优势群，而 QJ．1聚类
在组群 D时明显偏离该组 的广州菌株 。这表 明具有相同遗传背景的 RAPD遗传聚类群
主要集中在 1—2个地 区，这可能是 同一地区的菌株在相 同的气候和 自然环境 下，自然选
择的频率和强度基本相 同，使菌株间的亲缘关系 比较近 。
2．4 群体遗传分化
对广东省 7个县市菌株的扩增产物 的 DNA指纹 图谱进行分析 ，得出菌株 间的平均
基因多样性指数如表 4，从表中可以看 出各县市 内菌株 问的基 因多样性指数( )范 围为
0．181—0．228。各县市 内菌株间平均基 因多样性指数 )为 0．204，各县市群 体问基 因多
一 霸匦 — 阴 ■
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l68 热 带亚热 带植物 学 报 第 10卷
理来源 的菌株间的亲缘关系较远 (平均基 因多样性指数为 0．282)。Jinm 利用 同工酶技
术分析 了 21个水稻纹枯病菌 的遗传多样性 ，认为来源较近 的菌株具有高的遗 传相似性
系数，相似性系数在 49％一100％。我们 的结论与此一致 。
表 4不同地理 来源水 稻纹枯病菌群体 问基 因多样性 指数 (日 )和群体 内菌株 间基 因多样性指 数( )
Table 4 Gene diversity indexes of interpopulations(H )and intrapopulation(日 )of Rhizoctonia s,hmi
AG-I IA from diferent geographical locations
·对角线括号 内的数字表示 同一县市水稻纹枯病菌群体 内菌株平均基 因多样性 指数 。 Numbers
in parentheses along diagonal are meBBS of gene diversity indexes of intrapopulations in the same county．
我们从广东省 7个气候条件差异明显的地 区采集 的菌株分别代表广 东省不同的气
候 条件和农 田生态系统 ，南雄和 曲江位于粤北高 山地 区，土壤 相对贫瘠 ，属于 内陆性气
候 ，夏秋高温炎热 ，冬天干燥 寒冷 ，早造种植迟 ；湛江和 高州位 于粤西地区 ，受台风气候
的影响，雨水较多，气候炎热 ，冬季温暖 ，早造种植 比较早 ：揭西和东源属于粤东，气温 比
粤西稍低，海洋性气候 ，土壤肥沃 ：广州市属于珠江三角洲是冲积地 ，土壤肥沃 ，气候温
和。这些环境条件对水稻纹枯病菌基 因型的分布具有一定的选择作用 ，造成不同地菌株
的遗传分化程度高，同一地 区的菌株面临环境选择 的压力相 同，因而分化程度低 。由于
地区间环境条件 的差异导致基因型在空间分布的差异【18】，使相同地理来源 菌株 间亲缘关
系近 ，而不同地理来源 的菌株间遗传差异大。
广东省水稻纹枯病菌群体存在着遗传分化程度不同的 5个 RAPD遗传聚类群，各遗
传聚类群的分布主要受地理条件和环境因素的影响，以镶嵌式分布在广东各地 。LiuI 认
为水稻纹枯病菌至少存在两种不 同类型的菌株 ，TuI驯报道在 日本存在有 6个生理小种 ，
Nandi和 ChakravartiI ’ 用 9个水稻 品种鉴定 出 4个致病型 。RosewichI。 利用 7个单拷 贝
AFLPs标记分析德克萨斯州水稻纹枯病菌的群体遗传结构 ，鉴定 出 36个 多位 点 RFLP
基因型，发现来 自相同采样 点菌株 的多位 点 RFLP基 因型基本相 同，而 不同采样 点菌株
往往不同。与我们发现来 自同一地 区的菌株基本属于同一 RAPD遗传聚类群 的结果一
致 。相同遗传类 群的分布 以一地区为主，其 它的地 区也有少量分布，这可能是 由于基 因
流 引起 的。
水稻纹枯病菌 的致病力与 RAPD遗传聚类组群 、地理来源 的相关性不 明显 ，聚类在
相 同的 RAPD组群 和相 同的地理来源 的菌株的致病力变化 比较大 ，病情指数差异显 著
(t：l=0．05)。植物病原菌的毒性与 DNA多态性之间的关系比较复杂。Levy等l 】利用稻瘟
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第2期 易润华等：广东省水稻纹枯病菌遗传多样性与致病力分化的研究 169
病菌中度重 复序列 MGR586作探针 ，对美国稻瘟病菌进行 DNA指纹分析 ，发现 以 DNA
指纹 图谱划分的谱系与毒性特征间存在着密切的关系，Roelfs[231报道小麦茎秆锈病菌
(Puccinia graminis f．sp．tritici)的毒性与同工酶 多态性有 相关性 ，Kolmert’4】报道小麦 叶
锈病菌 (尸．recondita f sp．tritici)的 DNA 多态性与毒性 的相关性 比较低 。关 于水稻纹
枯病菌的致病力与分子多态性 的关系至今未见文献报道，我们研究 的水稻纹枯病菌的致
病力与 RAPD组群 的相关性不明显。从东源采集的菌株表现 出最强和最弱两种毒性，它
们都聚集在 RAPD组群 A 内。Baker和 Martinson[ 1认为 R．solani的野生型菌株产 生担
孢子能提高菌株 间基 因重组的频率，在产 生的新基因型中可能有很高程度 的毒性变异 。
水稻纹枯病菌细胞多核 ，菌株之间容易发生菌丝融合 的现象，菌株间的遗传变 异可以通
过重组或突变来实现 ：水稻纹枯病菌在 自然和人工诱导条件下很少产 生担孢子 ，但其对
菌株 的遗传变异可能起到十分重要的作用 。
利用分子标记找到与植物病原菌致病性连锁 的标记，了解致病型的地理分布 、毒性基
因漂流 (迁移 )的方式和途径、毒性基 因发生遗 传变异的机制对植物 病害的防治 、抗病
育种工作以及品种基 因型的布局具有十分重要的指导意义 。水稻品种 的抗病性 是由寄主
和病原菌相互作用的结果 ，利用 DNA分子标记技术更有利于 了解寄主与病原菌之 间的
互作本质。不同水稻品种上纹枯病菌的群体遗传分化及致病力差异如何还需要进一步研究。
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硼匿 1f 垂 _
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