全 文 ：核 农 学 报 一
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鱼类乳酸脱氢酶同工酶 性质的研究
夏德全 吴婷婷
中国水科院淡水渔业研究中心 无锡
薛国雄 张燕生
’
杨 靖 赵淑慧
中国科学院发育生物学研究所 北京 。
本文报道草鱼 。 。 ” 。 骨骼肌中纯化 的 乳 酸脱氮酶同
工薛 一 , 的理化性质 , 并利 用 ‘ 的杭体 时 儿种 鱼 的组
织和器官的 进行免疫化学分析 , 利用生化遗传指标鉴定鱼类 墓 因产物 的表
达情况 。
关健饲 乳酸脱氮酶同工酶 免疫化 学反应
前 言
哺乳动物 同工酶 由 、 两个基因组成 , 电 泳 图 上分成 条规则的带 、 , 、
、 和 。 ‘迁移慢 , 近阴极端 , ‘迁移快 , 向阳极端
。 在一些特定的组织 , 如鸟类
和哺乳类的精巢中 , 还有 基因的存在 仁。 , ’, 它也能和
、 基因组成不同的四聚体 鱼 灸
酶带要复杂得多 , 虽然它也是由 、 、 个基因组成 , 但其酶带并不总是 条 , 有 的
只有 条或 条 , 即使在具有 条酶带的鱼类中 , 约有 的种 , 其电泳酶谱上 ‘和 迁 移 正
好与哺乳类动物相反 , 即 ‘迁移快 , 向阳极端 ‘迁移慢 , 近阴 极 并 且 基 因 并 不 特
定在精巢中表达 , 在肝 、 肾 、 脾 、 眼中均有 基因的产物 研究表明 , 鱼类基因产物的这 种
变化 , 反映了鱼类种群由低等向高等进化的规律 一 ’产 。
鱼类 的表达尽管有其不规则性和 基因的广泛分布 , 但是只要是同一基因表达的产
物 , 它们在免疫化学性质上却十分相似 , 所以用免疫吸附的方法来准确地鉴定酶谱 , 并且可
以利用鱼类个体和群体的酶谱变化规律来确定种群在分类上的地 位 。 目 前 , 研 究 鱼 类
同工酶较为普遍 , 但在酶谱分析上 , 应用免疫化学方法来准确判断还不多 , 特别 是 国
内 , 尚无这方面报道
。 本文进行了这方面研究 。
材 料 和 方 法
取新鲜成休草鱼骨骼肌
,
于 缓冲液中匀浆 缓冲淮为 , 筑基
乙醇 。 氟化苯甲基磺酸胺 , , 匀浆液用 层纱布 过 滤 , 离 心幼 , 取
此文于 年 月 日收到
核 农 学 报 卷
上清 液直接加 在事先平衡过的 亲和柱上 〔‘ 。
, “ ’ , 待上 清 液
流完后 , 用 述缓冲液 以不小于 的流速洗脱 , 直至流出液在 的 吸收 值 小 宁
倪 , 再用 倍床体积的洗脱缓冲液 , 乳 酸 锉 , ,
琉基 乙醇 , 以 的流速洗脱 , 这样可除去 一 ‘和含 亚基的 杂 聚 体 ,
然后用 倍床休积的 , 琉基 乙醇 , 缓冲液洗脱 , 以除去残 留 在 柱
内的 十 和乳酸锉 , 最后用 , , 琉 基 乙 醇 , 的
缓冲液洗脱 一 ‘ , 收集含 活性的流出液 , 并加饱和硫 酸按至 浓度 , ℃过夜 ,
第 夭用 离心 , 沉淀用少量缓冲液溶解并透析 , 得 粗制品 。
将粗制品 加到 一 一 离子交换 柱 上 柱 为 , 用
, 琉基 乙醇 , , 洗脱 , 边洗脱边测定活性 , 直至流出液小 于 。
为止
。 合并 活性部分 , 并加饱和硫 酸铰至 浓度 , 取沉淀经透析后 即为纯 化 的
一 ‘ , 冰箱中保存备用 。
用纯化的 一 ‘ 免疫大耳 白兔 , 按常规方法制取 一 抗血清 , 并提取抗 体 ,
用它和各种组织和器官提取的 进行抗原抗体吸附反应 , 抗 原 和 抗 休 以 或
一 的 比例混合 体积 比 , 浓度为 , 保温 , 一 离心 , 取
上清液进行淀粉凝胶 电泳 。
结 果
一 一 的理化性质
纯化的 一 ‘经 电泳测定 , 只有 条 ‘带 图版 , 电泳测定 , 其分 子 量为
道尔顿 。
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一
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黔 图版 纯化前后草鱼骨骼肌的 图谱
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、 一
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采用 酚方法对上述 一 酶制品中蛋 白质浓度 测 定为
。
叱骨骼
肌可得到 一 含酶活性蛋 白 , 每 活性蛋 白酶活单位为 单位
。
采用 一 双倒数作图测定米氏常数 值 , 当底物丙酮酸钠浓度在
一 之间 , 酶浓度为 又 一 “ 时 , 值为 一 “ “ 〕
。
当酶浓度为 “ 吕 , 反应缓冲液为磷酸缓冲浓 , , 温度 ℃时 , 最适底物
丙酮酸钠浓度为 。 。
, 当酶浓度为 , 一 ‘ , 浓度为 甲 , 丙酮酸钠浓度 为 , 温 度
鱼类乳酸脱氢酶同工降人 性质的研究
℃ , 反应缓冲液磷酸缓冲液 时 , 最适 为 士 。
反应条件和 相同 , 仅改变温度测定酶活性 , 在 土 ℃时酶活性最高 。
反应条件和 相向 , 当尿素浓度从 一 时 , 可见到酶活从 开 始 降 低 , 至 时仍
呈下降趋势 , 说明在尿素解聚作用下使四 聚体解聚成单体亚基 , 从而失去活性
用 氨基酸自动分析系统测定氨基酸的组成 , 按 一 四聚体分子量为
道尔顿计算 , 取 次测定的平均值 , 结果见表 , 表中数字为氨基酸的数 目
。
表 草鱼 一 ‘的氮鑫曦组成
一 ‘
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任 。
。
东
。
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二 免咬化学反应结果
用几种鱼的不同组织和器官的 和抗 一 ‘抗体 进行免疫吸附反应 。 结果 见
图版 一 。 从图版 一平中看到 , 经抗体 吸附后仅留下 条 不 含 任 何 一 亚 基 的
旧
。 板卿心和眼的 经吸附后却留下 条 一 ‘
。
讨 论
一 鉴定 同工酶酶谱以 电泳分析为主 。 哺乳类动物的 一 ‘总是偏向阴 极 ,
总是偏 向阳极 。 鱼类的 却不是如此 , 鱼类 一 ‘的碱性基团并不 显 著 , 从 电泳
迁移率来看有时比 ‘还小 卜 因此鉴定鱼类酶谱时 , 需要用免疫吸附来确证 。 在 鱼 类 , 我 们
用草鱼的 一 。抗体 就能对所有淡水鱼的 一亚基进行免疫吸附
, 这种结构上的
保守性 , 作为生化遗传标记对研究鱼类分类和进化的关系极其有利 。
二 草鱼
、
团头妨
、
白鳞的大多数器官一般只有 、 个基因组成的四 聚体 , 条带 。
纯化的 一 ‘抗体 邑不能吸附 ‘
, 但对含 亚基的杂聚体均能吸附 国外 曾 报 道
‘
,
某些鱼的某些器官的 杂聚体不易被吸附 〔’吕 」, 我们也观察到了这种情况 , 可能是
四 兼体的 和 亚基结合相当均一和相当牢固所致 , 但究竟是什么原因尚待进一步研究
三 从 图版 中看到 , 板娜的心肌和眼不像一般二倍体鱼那样是 由 、 个亚基组成
的 条带 , 心肌有 条甚至更多的带 , 板娜和其它卿鱼一样 , 染色体数 目 , , 比草鱼 的
核 农 学 报 卷
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图版 白鳞器官 和 抗体 免疫吸附图
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图版 草鱼器官 和 抗体 免疫吸附图
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图版万 团头纺器官 和 杭休地 免疫吸附图 图版 板螂器官 和 抗体 免疫吸附图
一 。 。 。 。
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。
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,
。
条染色体多 倍
。 现 已证明银螂是三倍体鱼 , 有报道金鱼是四倍体鱼 〔‘ ’
。 因此板卿可能也
是一种多倍体鱼 , 它的谱带多 , 可能与基因加倍和染 色体加倍有关 。 我们观察到板卿 心 肌
条带经 一 ‘抗体吸附后 留下 条 一 , 也证明其基 因加倍的可能性
。
四 我们在草鱼眼的 图谱巾 图版 班的 和 观察到 和 。之间 有 条
伽花 脚心帕如 舀如如 , 二, 忿 , , ,
一
誉 明显的谱带 ,
基 因的产物
它不被 一 ‘抗体吸附 。 据文献报道 〔‘
, ‘ ,
,
,
, 我们也是这样 的看法 , 但尚需进一步确证
。
一 今 考 文
爬 做
它不是 基因的产物 , 推测是
卜
〔 〕薛国雄 乳酸脱氢酶同工酶 。 生物科学动态 , , 一
〔 〕‘薛国雄 从 同工酶看基因进化 。 生物科学动态 , , 均别 一
〕张龙翔等 , 生化实验技术和方法 。 人民教育出版社 ,
〔 〕罗莉中 , 王春 元 金 鱼同工酶发生遗传学研究 遗传学报 , , 一 。
〔 〕吴力钊 , 王祖熊 草鱼同工酶发育遗传学研究 。 遗传学报 , , 了 一 。
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