全 文 ：热带亚热带植物学报 2005，l3(3)：229—232
Journal ofTropical and Subtropical Botany
‘乌龙岭’龙眼胚胎发育时期特异性蛋白质的变化
梁文裕 ，陈 伟 ，宋瑞锋2，张 凤2
(1．宁夏大学生命科学学院，银川750021；2．福建农林大学生命科学学院，福州350002)
摘要：应用IEF．SDS．PAGE技术分析龙眼胚胎分化发育过程中蛋白质组分的变化。结果表明，在各发育阶段大多数蛋
白质组分的电泳图谱基本一致，但也有变化。其中花后 38 d存在TE (27．1 l【【)、p，7．3)，TE：(17．5 kD、pl8．2)2个特异蛋
白，45 d存在 TE (11．4 kD、pl 7．6)，TE (13．2 kD、pl 9．9)2个特异蛋白，52 d存在 TE (22．6 kD、pl 7．2)，TE6(18．6 kD、
p，8．3)，TE，(23．5 kD、pl3．6)3个特异蛋白。31 d胚胎电泳图谱中的蛋白质点数相对较多，表明此时蛋白质旺盛合成与
积累，这与蛋白含量的变化基本一致。龙眼胚胎发育过程中特异蛋白的出现或消失，对胚胎的分化发育具有重要作用。
关键词：龙眼；胚胎发育；双向电泳；特异蛋白
中图分类号：Q946．1 文献标识码：A 文章编号：l005—3395(2005)03—0229—04
Changes in Specific Proteins in Embryos of Longan
at Diferent Development Stages
LIANG Wen-yu ， CHEN Wei ， SONG Rui．feng ， ZHANG Feng
(1．College ofLife Science，Ningxia University，Yinchuan 750021，China；
2．Colege ofLife Science，阿 Agricultural and Foresty University，Fuzhou 350002，China)
Abstract：IEF—SDS—PAGE(isoelectric focusing electrophoresis—sodium dodecyl sulfate—polyacrylamigel electro—
phoresis)technique was applied to comparing and analyzing the changes in protein component during embryo
differentiation and development of longan (Dimocarpus longan Lout．CV．Wulongling)．The results showed that
major components of proteins were generaly similar at diferent development stages，but some changes also took
place． The 7 new specific proteins were observed at different stages of the embryo development
． They were TEl
(27．1 kD，pl 7_3)，TE2(17．5 kD，pl 8．2)on 38 days after anthesis(DAA)；TE3(11．4 kD，pl 7．6)，TE4(13．2 kD，
pl 9．9)on 45 DAA；TEs(22．6 kD，pl 7．2)，TE6(18．6 kD，pl 8．3)，TE7(23．5 kD，pl 3．6)on 52 DAA．These
specific proteins showed good repeatability in the experiments．The number of protein points were comparatively
higher on 3 I DAA gel electrophoretogram． which indicated that rich synthesis and accumulation of proteins
appeared at the stage of 3 1 DAA， and coincided with the results of the protein contents determined
．
The
appearance or disappearance of the specifc proteins might play an important role in longan’S embryo
differentiation and development．
Key words：Longan；Embryo development；Two—dimensional gel electrophoresis；Specific protein
植物胚胎分化发育的过程是基因在机体内外
因素作用下，在时间和空间上顺序表达的过程，其
表达的方式以合成某种蛋白质为主。由于这些蛋白
质很可能是胚胎发育时期特异基因表达的产物，与
该时期细胞的功能或组织的形态建成及机体的生
理生化变化密切相关，因此作为一种重要的分子标
记，特异蛋白为研究胚胎分化过程的基因表达调控
提供了物质基础，对认识胚胎分化发育的分子本质
有重要意义。近年来，利用双向电泳技术研究在植
物胚胎发育中的特异蛋白有不少报道，但大多集中
在草本作物，如大麦[1】、水稻[2】、黄瓜[3】、胡萝 卜体细胞
胚[41、玉米[5】等，在木本植物中仅见荔枝有相关特异
收稿日期：2004-07—13 接受日期：2004—10—18
基金项目：国家自然科学基金(3O37O999)；福建省自然基金(co41OO13)资助
通讯作者Coresponding author
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蛋白的研究报道[61。至于龙眼胚胎发育时期特异蛋
白的研究，至今尚未见报道【7J。本研究应用改进的双
向电泳技术[81分析龙眼胚胎发育过程中蛋白质的动
态变化，为分离纯化与胚胎发育相关的蛋白质，进
而克隆相关基因，为实现龙眼胚胎分化发育的分子
调控奠定基础。
1材料和方法
1．1材料
龙眼(Dimocarpus longan Lour．)品种为 ‘乌龙
岭’(胚胎发育正常)，种植在福建省农业科学院果
树研究所龙眼品种园。选用约 l5 a生，生长发育结
果正常的植株 3株，在花期一致的果穗上，于谢花
后 3l d、38 d、45 d、52 d、59 d采集正常果实用冰壶
带回实验室，剥离胚胎后，样品立即贮藏于一2O℃冰
箱备用。试验于 2001—2002年进行。两年重复。
1．2蛋白质提取
称取样品 I．0 g，加入 10倍体积 一20℃预冷内酮
[含 lO％三氯乙酸(TCA)和0．7％p一巯基乙醇(13一Me)]
研磨成匀浆，涡旋后静置于一2O℃l h沉淀蛋广]质，
随后 4~C，l5 000xg离心 20 min，弃上清液，重复处
理 2次。最后 1次沉淀置于一2O℃下 36h，使-内酮完
全挥发。准确称取蛋白丙酮干粉 25 mg，加 0．5 ml样
品裂解液(9．5 mol／L尿素，2％乙基苯基聚 乙二醇
(NP一40)，0．2％两性电解质载体安福灵(Ampholine)
pH 3．5—10．0，0．4％安福灵pH 5-7和 0．4％安福灵 pH
6—8，5％13-Me)于 37℃水浴 2 h。常温下 15 000xg离
心 l0 min，取上清液用于蛋白质电泳分析。
1．3双向电泳
第 一向等 电聚 焦 电泳(isoelectric focusing
electrophoresis，IEF)：胶长 l1 cm，内径 1．5 mm。胶浓
度为4％，10 ml胶中含尿素 5．5 g，双蒸水 1．97 ml，
1 0％ NP一40 2 ml，30％ Acr—Bis(Acr 28．38％：Bis
1．62％)母液 1．33 ml，3种 pH梯度的两性电解质载
体(pH 5—7 200 Ixl，pH 6—8 200 Ixl，pH 3．5—10．0
100 1)，10％过硫酸铵 1O l，N，N，N ，N 一四甲基乙
二胺(TEMED)4 l。上样量为 25 l蛋白提取液(约
含5O g蛋白)。预 电泳 为 200 V，15 min；300 V，
30 min；400 V，1 h。正式电泳为 600 V，12 h：800 V，
2 h；1 000 V，2 h。电泳后胶条先用 12．5％TCA固定
10 min， f平衡液 (5％甘油，2．1％ f‘二烷基硫酸钠
(SDS)，0．1 mol／L Tris—HCI，2％B—Me，pH 6．8)中平衡
10 min，直接进行第_I向电泳或 一2O℃冰冻保存。
第二向 SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直板 电泳
(sodium dodecyl sulfate—polyacrylamigel electro—
phoresis．SDS—PAGE)：垂直板规格为20 cm~20 cm，
胶厚 l ITln。分离胶和浓缩胶浓度分别为 l2％和
4％。用O．5％琼脂糖(电极缓冲液配制)封闭胶条，电
泳条件为每板20 mA，6 h或 15 mA，8 h。银染法染
色[91。等电点及分子量测定参照陈伟等【81方法。每样
品3次重复。
1．4图像采集与分析
利用 BIO—RAD Gel Doc2000凝胶成像系统对
凝胶扫描成像并进行分析[91。
1．5蛋白质含量的测定
参照Lowr# Ol方法测定。每样品3次重复。
2结果和分析
2．1胚胎蛋白质含量的变化
从图 l可见，乌龙岭龙眼胚胎蛋白质在花后
3l d含量最高，38 d含量略有下降，但仍维持在较
高水平；花后 45 d有一个较明显的降低，随后平缓
下降。这一结果从蛋白质水平上反映出了胚胎发育
在38 d前的新陈代谢要比后期旺盛，说明这一时期
基因表达十分活跃，蛋白质大量合成，而随后蛋 白
质的含量下降，表明 38 d后基因表达趋缓，蛋白质
合成减弱，同时随着胚胎的进一步发育，胚内储藏
性物质逐渐积累，蛋白质含量相对降低。
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图 1小同发育时期龙眼胚胎蛋 1质含量变化
Fig．1 Changes in protein content in longan emb~os
during diferent development stages
2．2胚胎发育的特异蛋白
图2显示龙眼胚胎发育过程f1l从花后 31 d至
59 d的蛋白质电泳图谱。总体来讲，各时期的主要蛋
白质组分没有变化，体现了胚胎蛋白质组分的稳定
性，但也存在差异(表 1)。花后 31 d胚胎中 14．8 kD、
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消失，但 13．9 kD、p，4．1，13．8 kD、p，7．7等 2个蛋白
点出现。其中 13．9 kD、pI4．1蛋白点表达量大，十分
清晰(图2 E)。这显示了龙眼胚胎发育过程中蛋白质
组分的变化，反映了龙眼胚胎发育过程中基因表达
的特点。
表 1 龙眼胚胎不同发育时期特异蛋白的变化
Table l Changes in specifc proteins in longan embryos
during different development stages
括号前为分子量 Oct)，括号内为等电点 (PJ『)．Databefore
parentheses ale molecular weight (kD)； in the parentheses are
isoelectric point(pJ『)．
3讨论
蛋白质是基因表达的产物，生物体的性状是由
蛋白质体现的。从双向电泳图谱可见：龙眼胚胎在
发育过程中(花后 31—59 d)绝大多数蛋白质基本不
变，少数蛋白质在数量、分子量、等电点及延续时问
的长短等性质上存在差异，具有发育阶段的特异
性，表明它们与组织或细胞在该时期的特定生理功
能有关，这些特异蛋白为研究龙眼胚胎发育的基因
调控及分子机理提供了有价值的参考资料。同时，从
实验结果可以看出，龙眼谢花后31 d胚胎双向电泳
图谱中蛋白质点数相对较多，提示蛋白质的旺盛合
成与积累在3l d的胚胎期或更早，与我们测定的蛋
白质含量结果基本一致，也与缪国华等对水稻的研
究【“】和陈伟等对荔枝的研究结果[甸基本上是一致
的。表明胚胎基因在前期表达活跃，与胚胎所处的
生理状态相一致。
陈伟等[甸指出：胚胎发育过程中特异性蛋白质
的出现和消失，与胚胎分化发育密切相关，一些发
育阶段特异性蛋白质的变化是胚胎分化发育的良
好标志。在38—52 d胚胎期共出现了TE。、TE 、TE 、
TE 、TE 、TE 、TE 等 7个特异蛋白，其中有些表达
量大，蛋白点清晰，而其他一些蛋白质只持续一段
时间，这些特异蛋白具有发育阶段的特异性，可以
作为一种分子标记，标示龙眼胚胎发育的过程和阶
段，但还需从解剖学和生理学方面加以证实。另外，
在 31—59 d的发育中，有许多蛋白点消失或逐渐消
失，说明这些蛋白质已降解失去活性，可能表明其
生物学功能已经结束。
胚胎发育是植物最重要的发育过程之一，与此
相关的基因常常是其生命过程中必不可少的。对本
研究观察到的7个特异性蛋白质 TE。 进行进一步
的研究，进而筛选出与龙眼胚胎发育相关的基因，
将对研究该基因的生物学功能及其对龙眼胚胎发
育的调控机理具有重要意义。
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