全 文 ：核 农 学 报 ,
汤 加 彻邝君
土 一
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几种水稻联合固氮菌吸氢酶
基因的鉴定及分析
苑红丽
’ 王惠贤 尤崇构
中国农业科学院原子能利用研究所 北京
供试菌株 左 ‘ ‘ 一 , ,
·
, 了 , · 夕 切
动 。 从 均能还原 , , 一氛化三 苯基四 氮吐 , 说明它 们 含 有 吸 氮
酶 。 以 二 ￡。。 ’ 。 的 墓 因 为 探 针进行杂交的结 果表明
, 除 ·
和
· 二
,
夕卜, 其它 菌株的 与 探针具有同源性
。
, 基因位于染 色体上 ‘
·
则位于较大的一个质
粒上 。 · 和
·
的 基 因与 基 因位 于同一 复 制
子上 。 基 因不具必然的保宁性 , 因 此 异 源 基因探针不一 定都适 宜于 探 测
基因 。
关健词 联 合固氮菌 吸氮薛 基 因
前 言
固氮酶在催 化 还原 成 的过程中 , 至少有 以上的电子用于放氢 , 消耗了大量能
量 。 然而在某些固氮生物中含有吸氢酶 , 可 以 回收部分所放出的氢 〔 , 从 而 降 低 能 耗 。
的再循环使固氮活性对氧的敏感性下降 〔 。 寻找新的或构建 菌株 , 以充分 利 用 生
物能源 , 就有可能提高固氮的效率
。 年代以来
,
关于吸氢酶的研究多着重于根瘤 菌 ,
已确认氢再循环能力是质粒编码的 〔’ , ‘ , 并克隆了
· ‘ 的 基因 〔 ’ , 通 过
重组质粒的转移 , 使某些根瘤菌由 一 变成 〔 ’
。
非共生固氮体系除 二 。 汀
’ 邢 “ 外 , 其它固氮菌 基因的研究还鲜见报道 。 不同的 十 生物 , 其 基因是
否具有同源性也仍在探索中 。
木研究对几种水稻联合固氮苗的 基因进行了鉴定和分析 。
材 料 与 方 法
材料 本工作所 采用的菌种 株 和质粒如表 。
菌体培养
·
时 行 , 采用修改的 培养基 , 在 ℃下振荡培养 。 其
它固氮菌采用培养基的组成为每立升含蔗糖 , , , 柠
此文子‘ 年 月 。日收到
。 ‘ 现在中国农业科学院作物所工作
。
核 农 学 报 卷
表 菌株和质粒
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一
苗株和质粒
,
来源及参考文献
‘ 。 ”
‘ 户 ”
广东微生物所 , 本所 的
,
国际水稻所
戈 中国科学院植物生理所〔的
,
广东微生物所 , 本所〔的
, 犷
,
国际水稻所
加拿大农业部植物研究中心 〕
亡 ‘ 川 。 ” 丙 入
丫 一
中国科学院武汉病毒所〔的
二 ,
檬酸 铁 , ‘
·
,
·
, , ‘ ·
, 。 在 ℃下振荡培养
。
饭晚活性检侧 按 〔‘ “ ’法在上述无氮培养丛 中加入 】 ,
, 一 氯 化 三
苯基四氮哩 。
质粒 悦 的提取 按改进的 去〔‘“ ’。 下振荡培养至 。。。为 一 日」
·
收集
菌体 。 用 缓冲液 , , 洗涤一次 , 然后将 湿 菌
休悬浮于 中 , 加入 溶菌液 , ,
· ,
, 搅拌混合 秒后 , 在 ℃下保温 一 溶菌 , 待温度降至室温后 , 再
加入 缓冲液 进行中和
, 搅拌 , 混匀后 一入
至最终浓度为 , 室温放置 后 , 加入等体积 饱不酚 , 搅才平混合
秒后 , 再用 混合 , 离心 , 取上清液加入 一 体 积
混匀 , 加入 休积无水 乙醇
, 一 ℃过夜 , 离心收集沉淀 , 真空干燥后溶于
中
。
卜 印迹杂交 参照 法 〔‘ 制备总
。 用缺日 翻译法标记的质 粒
作为探针 放射性活度为 一 工。 件
。 总 经限制性内切酶消
解后 , 在 , 琼脂糖凝胶 浪化乙锭含量 林 时 上分离 , 电泳缓冲浓为 , 紫 外
几种水稻联合固氮菌吸氢酶 基因的鉴足 及分析
灯 一 观察照像
。
质粒 凝胶需在短波灯下继续照 时 〔‘“ 」
。
电泳胶经碱变性 , 中和
后转移到俏酸纤维素膜上
。 ℃ 真空干燥 小时
。 ℃预杂交 一 小时 , 杂交 小时
。
在室
温 一 使膜干燥 , 压片 讨间为 一 天
。
主要化学试剂 限制性 内切酶 , 和 , 琼脂糖 华美生物工程公司 ,
, , 酶 , 聚合酶 , 酶 , 蛋 白酶 ,
, 溶 菌酶 上海禽类蛋品公司 , 一“ “ 福瑞公司 , 其它为国产分析
纯试剂
。
结 果 与 讨 论
一 质粒 的提取及 电泳检测
试验于 改进 ’勺 法提取供试 女株 ,勺质粒 , 图 饭 为 匕泳 险测止, 月去。 与前文 ‘“ 」报 道
」、己, 洪试菌株除
· 二 才。。 外 , 都携 了
’
质粒
。 其 中 、
·
此 沁 ,
·
和
·
,‘ ‘ 少毛有 一 个人质粒
。
图版 质拉 的琼脂 糖凝胶 电泳
一 三
一
万 , , 户 ,
夕 一 八 户人
, ,
· ·
⋯
,
二 基 因 同源性鉴定及其定位
吸氢酶活性 俭测 吸 氢酶催化 成为质 卜 , 大汉化还原染料 可作为 电 二又 体 而
变 色 。
,
卞试验用 为 电 子受体 , 万叮以通过 观察菌落部位培养基颜 色变化作出判断 , 结 果
见 图版 。 表明供试 菌株都含有吸氢酶
。 已 报 道
· 。“ 。 ’ 含 有 吸氢酶 ’“ 」,
·
也有吸氢现象 末鸿遇 , 个人通讯
。
木工作的结果 与之相符 。
垫因同源性鉴定 以携有 了夕。 , 堪 囚的质粒 为探 针 , 与供试
菌株 呵 进行杂交 , 结果如图版 职沂示
。 · 。 和
· 。二 无杂交 信
号 , 其它呈阳性反应 , 这 说明它与
·
了夕。 。沁 。 丛囚具同源性 , 韭囚的限定性分
祈见表 。
将 重组质粒月于互补研兀的结果表明 , 丛因以闭」当 人的韭囚簇 组 成 〔 ’ 」
。 不 司
来源 的 基 囚是否具同惊性
,
汀还缺 三生 化
、
遗 传方 向的证据
。
我们试 讨异源探 计鉴 定
基 月 , 结果表川 , 刃
·
不「
· 二 的 基因 与
·
户。 。 ,
基 因不具同源性
。 因此 , 异源 基因探针并不一定都适于探 测 基 因
。
序列达到何等程度的同源才 能应用 吸印和杂交法俭测 出 , 这 个 问 题 至
核 表 学 报 卷
图版 供试菌株对 的还原作用
万 已 。 ,
劣夕 户
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图版 几种联合固氮菌总 与 探针杂交结果
〕 「 、 上
比 。 。 〔‘夕。 , 二
、 经 消化 的 经 消化的
· “ 。。八〔‘。 , 喃 , ‘
经
一
消化的
·
经 圣肖化的刃
· 。 、
人 一 分别经
、 消化的兀
· “ 。 。。 。 经 五 消化的
·
一 代表杂交后相应的放射自显影结采 。 入, 入 经 川肖化共片段大小以 农示
·
· 。。人
·
刃 · 召
· 。 。
· 劣 夕
入,
今尚不清楚 , 有待进一步研究 。
基因定位 将
·
二 ,
·
注。 琼脂糖凝胶 上
电泳分离后 转移到硝酸纤维素膜上 , 与 基 因探 针 杂交 , 其结果见 图版 。 表明
过
·
’ 的同源片段位于染色体上 , 万
· 。 、则位于一个较大的质粒上 。
期 几种水稻联合固氮菌吸氢酶 基因的鉴定及分析
几种联合固氮菌 基 因的限定分析
了
酶 困 株 探针 玉
”才 叭厂 ,
,
,
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旨缝
图版
· 。。 。 生 , 刀
· 。 。。“ 。 与 基 因探钊为要交
开 ,
一
, 班 ·
· ·
。 。 。
二 , 二
我们的工作已证明 ,
·
训 巧 及
· 。二郎 的 丛囚分别位 于染 色体
和质粒 匕〔‘ 。 」, 故可 以认为 , 丛 囚与 基囚泣于 同一复制 子上
。
应用 诱变手段研究
吸 氢与固氮作用的关系 证明 , 巴西固氮螺菌中 十 丛 囚和 从 囚在遗 传上有连锁关系 〔 ’
对 十 固氮菌的研究表明 ,
、 丛囚位 于同一复制 广上 。 木工作得出 了相 司的结呆 。
参 考 文 献
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〔 〕宋鸿遇等 氢酶与固氮酶在细菌光合固氮中的联系
。 植物生理学报 , , 玺 了 一 。
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〔的 王子芳等 固氮螺菌氢代谢与固氮作用的关系
。 微生物学报 , 一
。
〔的 丘元盛等 水稻根际固氮细菌的研究 科学通报 , , 。
〔 〕 一 ”
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〔日 尤崇构等 粪产碱菌的培养及其生理特性 。 原子能农业应用 , , 一
。
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〔 〕 一 一
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〔一。〕 , 、 。 。
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。
〔 〕王惠贤等 水稻联合固氮菌质粒的鉴定及固氮 墓因定位 。 核农学报 , , 比一 即
自了〕王子芳等 固氮微生物的氢酶与固氮作用 。 微生物学通报 , , 一
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