全 文 ：核 农 学 报 。
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生宁
单克隆抗体孕酮放射免疫分析的研究
汪俊强 陈子元 陈传群 吴美文
浙江农业大学核农所 杭州
一
应用抗孕酮单克隆杭体 , 建立 了单克隆抗体的孕酮放针 兔疚分析法 。 试脸确 定
了单 克隆杭体的稀释度
、 最适 配比 、 最佳温育条件和 闪烁液中样品抽 提 达 平
衡所需的时间 。 两 条标准曲线 的回 归方程分别为 一 、
一 。 和 一 , 一 鉴定结果表明 , 方
法灵敏度 为 , 可浏 范围为 一 , 批内与批间变异 系数 分 别 为 和
通认魂 。 甲 回收率分别为拍 ‘ 土 和 士 , 。 样品 棒
释试验表明 , 浏 定方法 的乎行性较好
’ ‘
夹健词 单克隆抗体 放封 充疫分析 孕酮
前 言
乍
孕酮是由性腺及肾上腺分泌的一种类固醇激素 , ’仑在母性生殖和妊娠维持过程中起着重
要作用 。 体液孕酮含量的检测在家畜的迪证研吮和生产实践上具有重要意 义 〔、一 , 使用抗
血清的传统放射免疫分析法难于实现标准化 由 和 “ 于 年 创 导的 , 通
过杂交瘤生产单克隆抗体
几
的生物技术 · 可 以制备大量毕均一的抗体供所有实验室使用
, 为
建立标准化的放射免疫分析法创造了基础【。 ’· 本试验采用抗孕酮单克隆抗体 , 对 孕酮的放
射免疫分析作了研究 , 以促进方法的标准化
, 探索单克隆抗体应用于放射免疫分析的途径
·
材 料 与 设 备
试验材料 孕酮单克隆抗体 与 北京医科大学提供 , 孕酮标准品 中
国科学院动物所提供 , , , , 一名 一孕酮 比活度 , 上海核子所产品
试验设备 一 液体闪烁计数仪 , 一 巧 一 酶标测定仪 。
方 法 与 结 果
一 单克隆抗休的稀释试验及效价侧定
此文于 年 月 日收到
。
台仑 核 农 学 报 卷
将单克隆抗体 与 作 一 。。。口的连续稀释 , 然后谏各种稀释度的抗体
与标记孕酮 约 。。。 反应 , 按孕酮放射免疫测定步骤 , 测定各种抗体稀释 度 下 , 标
记抗原抗体复合物的放射性占总放射性活度的百分比 , 求出结合率 , 绘制抗体的 稀 释 曲 线
图 , 根据该曲线 , 可知抗体的 效 价为 。 , 因此选择 的稀释度 作 为单克
隆抗体工作稀释度 ,
二 翻 摘农活性炭 。 优化砚比试验
卜,
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气
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采用不同配比的活性炭 与葡聚糟作为游
离孕酮的吸附剂分离 与 。 在各种配比下 ,
测定特异结合管 管 和非特 异 结 合管
管 的结合百分率 , 结果 表 表明 ,
葡聚糖与活性炭以 较好 , 活性炭 浓 度
以 较佳 , 此时 管的结合率较小 , 而
管的结合率较大 。
三 反应派度与时间的选择试验
采用三种温育条件 ℃、
「
℃、 ℃
进行对 比试验 , 结果 图 表明 , 在 ℃条
件下 , 反应抗原抗体的结合率较高 , 但反应
时间较长 。 随着反应温度的升高 , 反应速度
加快 , 反应达到平衡所需时间较短 , 但抗原抗
体的结合率较低 试验结果还显示温度低时
能增加试验灵敏度 , 据此 , 实际应用时的温
育条件以 ℃反应 小时以上较为合适
。
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图 单克隆抗体稀释曲线
一 ”
四 样品放射性在闪烁液中建立平衡铸要的时间
国外文献报道很不一致 , 有的 小时 ” , 有的过夜 〔“ 等 。 本试验取 管和 管样 品 加
表 不同比率与浓度的 对 , 和 管结合率的形响
葡聚塘 活性炭
活性炭浓度
肠
, 篮
管结合率 。
肠 峨
管结合率
” 七
肠 忿 只
落 姗 单克隆抗休孕网放射免疚分析的研尧
入闪烁液中 , 在不同时间测定其计数率 结果如图 所示
, 对 管样品需要 小时才能达到 平
衡 , 对 。管需要近 小时才能达到平衡
。
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反应温度对结合串和平衡时间的影响
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五 孕砚含 标准曲线的建立
根据 以上选择的条件及选配的试剂 , 分别用单克隆抗体 与 制作孕酮含量 标
准曲线 , 各种试剂及其用量列于表
。 ‘
操作程序 于试管中加入抗体 、 标准品 、 、 ’ 一孕酮 约 。。 , 浪匀 ” ℃
温育 小时以上 , 于冰水溶中加入 边加边搅拌 混匀叶静置 分 钟 , 离 心 分 钟
。印 , 上清液倒入盛有 闪烁液的测样瓶中、平衡时 间 小时 , 测量放射性 强度
参 裹 刹作孕砚含皿标准曲线的试翻及用
盛
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标准孕酮
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核 农 学 报 卷
表 一 一 标准曲线得分表
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比率范围 走
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得 分
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零标准管结合率
取 代 比 率
百 分 精 确 度
肠
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样品放射性在闪嫉液中达到平衡所需时间
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图 孕酮含量标准曲线
一
,
以标准孕酮含量为横坐标 , 相对结合率为纵坐标作图 , 即得孕酮的剂 鼠反应曲 线 图
。 将数据作 一 转换 , 以 代表孕酮含量 为横坐标 , 代 表相对
结合率 为纵坐标 , 即可得标准 曲 线 图 一 。一
犷牛
。 令
、 二 , 可求出 对 的回归方程
一
二 一 一
一 一
据此 , 只要测出未知样品的结合率
, 就能方便地通过这一关系求出未知样品的孕酮含量
。
六 方法学簇定
期 单克隆抗体孕酮放射免疫分析的研究
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图 讨 。 孕酮标准曲线
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奶 样 稀 释 度 口 筱 王 冬 由 ,
图 奶样稀释曲线
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灵敏度 与可测范 以 法计算灵敏度为 ,
一
可测范围为 一
。
情确度 批内变异系数 为氏 , 批间变异系数为
。
准确度 通过测定 印次率
一
与平行性试验检验 。 添加法测 回收率 〔” 在试管中加
入不同 鼠的标准孕酮 , 再加乳样 充分混 合 , 平衡后测定孕酮含员 , 计算结果 , 回收率分
别 为 ‘眨 士 了 “。 和 盯 士 二“。
。 平行性试验 取一乳样倍
比稀释成 入
、 、 的不同浓度 , 然后测定其中孕酮含量 , 测定结果基 本 上
在一条直线 仁 图 , 说明方法的平行性较好 , 测 定 结果不会因样品稀释度的改变而发生
显著变化 , 可 以通过标准曲线来检测被测物 的孕酮含量 。
,
非特异性结合率 为 , 为 。
结 论
、
对
·
的配制 , 反应温度与温育时间 , 以及闪烁滚中样品放射性平衡时 间的试 验 研 究
表明 , 使用 单克隆抗休与多克隆抗血清具有相似的结果
。 采用 ℃温育 小时
、 ℃温育 小
时 、 ℃温育 小时 以 , 均能获到较为满意的结果 , 低温孵育抗原抗体的结合 比较充分 , 但平衡
时间较长 。 温度高可使平衡时 间缩短 , 但降低了抗原抗休结合率 , 对灵敏度有一定影 响 综
合考虑结果 , 以 ℃条件温有最为合适
。
对标准曲线的质量评价 , 目前国 内外多采用 月 ’等人提出的 “ 效点系统 ” 。
一 一 评分法 , 对零标准管结合率
、
取代比幸 、 百分精确度
’、 百分准确 度 和
灵敏度等五个指标进行评分 , 以总分超过 分作为较优方法的标准
。
木试验作出的两条标准
曲线分别获得 和 分 表 , 其中标准 曲线的准确度与精确度在 。
’
”效点系统 ” 巾
均获较高分数 。 说明该方法具有较好的稳定性和重现性
。
使用单克隆抗体作放射免疫分析
, 在方法标准化方面具有较为明显的优点 方法学鉴定
结果也表明 , 一 一 具有较好的准确性
、
精密度和特异性 。 但测定的灵敏度偏 低 ,
为了提高测定灵钦度 , 可通过筛选高亲和力的单克隆抗休和提离标记化合物 比活度来解次 ,
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