全 文 ：热带 亚 热带 植物 学报 2002，10(3)：229-234
Journa／of Tropicol and Subtropical Botany
杜氏藻属 四个种的核型分析
曹 毅 蒋 彦 乔代蓉 陈 英 杨 滔 4
(1．四川大学 生命科 学学院草原生物 工程 国家实验 室。四川 成都 610064；2．四川农业大学 ，四川 雅安 625014；
3．成都华神集团股份有限公司 ，四川 成都 610070；4．四川川大 光耀生物工程有限公司 ，四川 成都 610064)
摘 要：采用染 色体分带方法对杜 氏藻 属(Dunaliella)4个种的核型进行 分析。经过 25~C 12 h d。。
的光周期 诱导 。杜 氏藻属 4个种 出现 同步 化生长 。用 0．05％秋水仙素处理 ，再经低渗 、固定和高
位 (60 cm)滴片 ，获得杜 氏藻 属 4个 种的核型。结果表明 ：杜 氏藻属 4个种都是单倍体 ，其染色
体大多为短杆状 、极小 。染色体数分别是 ：D．salina n=13，D．primolecta n=20，D．bardawil n 10，
D．parva n=16。它们大都可见较明显的初级缢痕 ，且都在染色体的 中部 。
关键词 ：杜 氏藻属；核 型；染色体数 目；藻类
中图分类号 ：Q943 文献标识码 ：A 文章编号 ：1005—3395(2002)03-0229-06
The Karyotypes of Four Dunaliella Species(Algae)
CAO Yi1 JIANG Yan ，。 QIAO Dai—rong CHEN Ying YANG Tao
(1．National Lab．for Grassland Biotechnology，Sichuan University，Chengdu 610064，China；2．Swhuan
Agricultural University。Ya’an 625014，Chma；3．Chengdu Hoist lnc．，LTD．，Chengdu 610070，China；
4．Kaiya Biotechnological Corporation of Sichuan University，Chengdu 610064，China)
Abstract： The karyotypes of four species of Dunaliella were analyzed using Giemsa staining
method．Th e organ isms were cultured in Ben—Amotz medium with 1．5 mol／L NaCl at 25 oC in
a 1 2／1 2 h light—dark cycle for three days to induce synchr onous growth of the algae． The
karyotypes were observed after a series of treatments including pretreatment with 0．05％
colchicine for 1 2—1 6 h，hypoosmotic shock，fixation，and dropping from 60 cm high to glass
slide for breaking the surface coat of Dunaliella cells． AIl species observ ed are haploid with
short an d bacillifcIrrn chr omosomes． The chromosome numbers of Dunaliella species are
n=1 3 in D．salina，n=20 in D．primolecta， n=l0 D．bardawil，an d n l 6 D． parva．All the
chromosomes are wim median centromere．an d the primary constrictions were obvious．
Key words：Dunaliella；Karyotype；Chromosome number；Alga
杜 氏藻属属于绿藻门 、绿藻纲 、团藻 目、多毛藻科【 一1。美 国国立卫生研究院生物技术
信 息 中心 (NCBI)的数 据 库[31将杜 氏藻 单列 为一 科一杜 氏藻科 (Dunalielaceae)，其 中
收稿 日期 ：2001—10—12 接受日期：2002-01-28
基金项目：国家转基因植物及产业化专项(JO0L_A—oo8—09)；国家自然科学基金(39780018)；四川省重点项目的资助
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230 热 带 亚热带 植物 学报 第 1O卷
Dunaliella salina，D．sp．，D．bardawil，D．parva，D．bioculata 5种均归 于杜 氏藻属 ，但 D．
primolecta并未被收录 。杜氏藻属的细胞形态像衣藻(Clamydomonas)，通常为卵圆形 ，当外
界渗透压发生改变时 ，可变为球形至纺锤形 ，具有两条等长的鞭毛和一个杯状叶绿体【 _6】。
在盐生杜 氏盐藻 (D．salina)、双杜氏盐藻(D．bioculata)等种类中，叶绿体 的外缘可 累积大
量的 p一胡萝 『、素 ，使细胞呈红 色，而不是绿色【 · 。杜氏藻属的繁殖有营养繁殖和有性生
殖两种。营养繁殖为纵裂 ，一定条件下也可形成胶群体 。由于杜氏藻属细胞外有一层坚
韧的以糖蛋白为主的弹性 外被 ，使得细胞不易破碎 ，也成 为对该物种进行核型分析 的一
个难点。 目前 ，关于杜 氏藻属核型的研 究报道较少 ，游兰英等对杜 氏藻的同步化生长及
核型进 行过分析【 。本文选择了杜 氏藻属的 4个种进行核型分析 ，为下一步进行基 因定
位做准备 。
l 材料和方法
藻种 杜 氏藻属 4个种为 D．salina，D．bardawil，D．primolecta，D．parva，由本试验
室保存 。
藻体培 养 采用 Ben—Amotzt 的 1．5 mol／L NaC1培养基 ，pH为 7．5，温 度 25c，光
强2 000 lx，光 ／暗周期 12 h／12 h。采用血球计数板每隔 8 h取样 统计藻细胞个数 ，每次
每个样品 6个重复 ，取其平均值 。
处理和制备 当出现同步化生长且浓度达到一定值(2×1O 个 ml )后，再光照 10 h，
离心浓缩一次 ，加入秋水仙素母液至终浓度 O．05％，处理 12—16 h，离心得藻沉淀 。以 1％
柠檬酸钠制成藻悬液 ，室温下低渗 3 h，滴加少许固定液 (甲醇 ：冰乙酸 ：3：1)，摇匀 ，静置
片刻后离心。以新鲜固定液处理 2-3次 (每次 6 h)。取 已固定藻液从 60 cm高度滴在预
冷载玻片上 ，火焰干燥 ，Giemsa染色 ，晾干后在 日产 Olympus显微镜下观察 ，拍照并进行
放大 、测量 ，分别计算各藻种染色体的相对长度 。
染色体计数 对每个藻种随机计数 50—100个染色体组 ，以确定杜 氏藻属各个种
的染色体数 目。
核型分析 染色体按 从大到小的顺序排 列 ，相同长度的染色体 ，以短臂长的在
前 ，各染色体短臂向上 ，端部着丝点染色体的着丝点向上。依据臂率将染色体分为 ：端部
着丝点染色体(ot)，次端部着丝点染色体(st)，中部着丝点染 色体(M)，次中部 着丝点染色
体(sm)，染色体编号按 1，2，3⋯⋯顺序进行。
2 结果和讨论
2．1 细 胞 浓度
每隔 8 h对杜氏藻属 4个种的细胞进行计数 ，细胞浓度变化见图 1。从图中可以看
出 ：杜氏藻属 4个种细胞的生长呈 “S”形曲线 ，其中 D．salina、D．primolecta和 D．parva
在接种的第 3天进入对数生长期 ，第 6天进入稳定期 ，细胞量分别达到 3．73x10 个 ml～、
3．01x10 个 ml～、2．55x10 个 ml～。而 D．bardawil的生长相对较弱 ，在接种的第 4天才进
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第 3期 曹毅等：杜 氏藻属四个种的核型分析 231
入对数期，细胞量为 1．72x 10 个 ml。。
4种盐藻的细胞浓度均达到进行核
型分析的要求。
2．2 藻种生长的同步化处理
细 胞 同步 化 是 指 在 自然 过 程 中
发生 的 ，或 经人 为 处理 造 成 的 细胞
周期同步化 。为了深入研 究细胞周
期各时相 发生的变化及调控机 理 ，
常需对细胞周期的不同时相进行生
化 、形态或其他生物学 的分析研究 。
对藻类的核型分析必须获得大量有
丝分裂 中期的细胞。因为杜氏藻是
光能 自养生物 ，需要光合作用合成
×
5
型
器
图 1杜氏藻属 4个种 的细胞浓度变化
Fig．1 Cell concentration of four Dunaliella species
at growth duration
4．D．sdina；● D．primolecta；AD．bardawil；■ D．parva
葡萄糖 ，用以生长和繁殖 。本试验采用光周期诱导的方法使杜 氏藻 的生长实现同步化 ，
当进入暗周期时 ，细胞 由于不能进行光合作用 ，缺乏足够的能量 ，致使有丝分裂停止 ，但
进入光周期时 ，细胞重新恢复分裂 。如此反复 多次 ，可使杜 氏藻属 4个种的生长实现同
步化 。
从图 1可 见，在细胞生长进 入对数生长期前的缓慢生长阶段 ，光周期对于细胞生长
的影响不大 ，而在进入对数生长期后，在光照阶段的前 8 h中，生长曲线迅速上升 。在光
照阶段 的后 4 h和黑 暗阶段的头 4 h中，生长继续上升 ，但到了黑暗阶段的后 8 h，细胞
生长则缓慢下来 ，亦即 ，细胞经过 12 h光照和 12 h暗处理 的光周期诱导 ，在第 3天进入
同步生长。说明杜 氏藻属的 4个种已被成功地诱导了同步化生长。由于在生长的延滞期
就开始了光周期调控 ，对细胞进行同步化诱导 ，因此在进入指数生长期 ，表现出了“z”形
的同步化生长特征，达到了核型分析需要大量有丝分裂 中期的同步化细胞的要求 。
2．3 关 于预 处理
秋水仙素处理时间 秋水仙素的作用是使染色体缩短变粗 ，阻止有丝分裂时纺锤
体的形成 ，让尽可能 多的细胞处于有丝分裂中期 。秋水仙素的处理时间对实验结果有很
大影响 ”。处理时 间过短 ，染色体大部分还 处于染 色质状态 ，得不到清晰可 见的染 色
体 ；处理时间过长 ，造成染色体缩得过短 ，成 为极小的圆点状 ，体现 不出各染色体之间的
差异 ，无法进行核型分析。实验表明 ，这 4种藻虽然同为一属 ，但所需的秋水仙素处理时
间有所差异 。D．primolecta需要处理 15—16 h才能见到短杆状 的染色体 ，而其余 3种处
理 15—16 h时 ，染色体 已成为无法分辨的圆点状，合适的处理时间为 12—13 h。
低渗时间 低渗 的 目的是使染色体分离 ，而且让细胞处于破裂的临界点 。低渗得
好的材料是细胞不破 ，但一滴到玻片上就破 ，可使染色体散开 。低渗的好坏取 决于低渗
时间，过长会造成染色体的丢失 ，过短则染色体分不开 。试验表明 ，在 25℃下 ，3 h的低渗
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232 热带亚热带植物学报 第 10卷
时 间是 最理 想 的 。
滴片 虽然杜氏藻缺乏 细胞壁 ，但 由于对高盐等极端环境的长期适应 ，其细胞上
有一层坚韧 的由糖蛋白构成的外被[12]。采用 0、20、40 cm 的低 中位滴片都不能产生大
量的分散良好的染色体组 ，而采用 60 am的高位滴片 ，则能有效地打破其细胞 外被和核
膜 ，获得分散 良好的染色体组。
一
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量
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序 号 No
I-
9 10
J 1I l l●l I I|l t t i b i t e l··
D． 勃
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6 7
图 2 杜氏藻属 4个种的染色体和排序 (x2 500)
Fig．2 Chromosomes of Dunaliela (x2 500)
● -■ ● ●I『● ，·
8 9 10 11 12 13 14 15 lfi
D．栅
2．4 核型 分析
对杜 氏藻属 4个种的染色体核型分析发现 ，每个藻种的染色体数 目都 以某个数字 占
绝对优势 ，因而以此作为该藻的染色体数 目。对每个藻种 50—100个染色体组进行统计
分析 ，得出它们均为单倍体 ，染色体数分别为 ：D salina n=13，D primolecta n=20．D
◆
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第 3期 曹毅等 ：杜 氏藻属四个种的核型分析 233
bardawil n=10，D．parva n=l6。游 兰 英
等[91发现 D．parva, bioculata, peircei
和 minuta的染色体数 目分别为 n=16，
n=22，n=26和 n=28，其 中 D．parva的
研 究结 果 是 一致 的 。说 明杜 氏藻属 种 1可
的染色体数 目有较大差异。
由于染色体标本制备过程中 ，普遍
应用药物进行预处理 ，处理条件不同 ，
染色体缩短程度也不同 ”】。因此所测得
的同一物 种的染 色体 绝对长度 往往差
异较大 ，但是根据绝对长度计算 出的相
对长度则比较接近 ，即 同种个体间染色
体的相对长度保持稳定 。4个种的有丝
分裂中期各染色体的相对长度见表 l。
最大与最小染色体相对长度的比值分别
是 ：D．salina 2．O0，D．primolecta 2．12，
D．bardawil 2．10，D．parva 4．13，都 比较
小。这说 明每一种藻的每一条染色体长
表 1 杜氏藻属 4个种的染色体相对长度
Table l Relative length of chromosomes of Duna／／el／a species
染色体序号 里竺塑翌 室 !! !! !
No D．salina D．primolecta D．bardawil D．parva
度差别不大 。许多染色体的长度相 当接近 ，如 D．salina的第 6、7号 、第 l2、l3号染色
体 ，D．primolecta的第 2、3号、第 6、7号 、第 ll、l2号染色体 ，D．bardawil的第 7、8号染
色体 ，D．parva的第 3、4号 、第 5、6号 、第 7、8号、第 9、10号染色体等 ，由此增加了排序
的难度。也许利用染色体分带技术能够更好地进行核型分析 。
除 D．salina的 ll、l2、l3号染色体 ，D．parva的 7、l6号染色体为圆点状 ，无法辨认
出着丝点外 ，其余染色体都 为短 杆状 ，可见清晰的初级缢痕 ，且都 为中部着丝点染色体 。
所有染色体都不具随体 (图 2)。
参考 文献 ：
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234 热带 亚热 带植物 学 报 第 10卷
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