全 文 ：热带亚热带植物学报 2005，13(2)：143—148
Journa／ofTropical and Subtropical Botany
云南穗花杉的遗传多样性研究
王德莲，李忠超，葛学军
(中国科学院华南植物园，广州510650)
摘要：采用随机扩增多态 DNA(RAPD)方法对云南穗花杉 mentotaxus yunnanens~)4个居群和台湾穗花杉
nt。taxus form~s帆0)1个居群共 104个个体进行了遗传多样性分析。9个随机引物共扩增出清晰谱带143条。云南
穗花杉在物种水平上遗传多样性较高(多态位点百分率 P为 79．0％，基因多样性指数 He为 0．2718)，但云南穗花杉和
台湾穗花杉居群内遗传多样性均较低 (P为 18．0％、6．9％；He为0．0688、0．0198)。云南穗花杉居群间遗传分化强烈
(AMOVA，G 和 Shannon多样性指数分别为 0．7611，0．7503和 0．7526)。据推测，第四纪冰川引起的瓶颈效应，小规
模居群引起的遗传漂变及幼苗成活率低等因素都加剧了居群间的遗传分化。建议对所研究的云南穗花杉全部居群予
以保护，特别是对云南西畴和贵州兴义市七舍两个具有相对较高遗传多样性的居群应该优先建立就地保护点，以达到
最大限度保存云南穗花杉遗传多样性的目的。
关键词：云南穗花杉；遗传多样性；1La．PD
中图分类号：Q16 文献标识码：A 文章编号：1005—3395(2005)02—0143—06
Genetic Diversity of the Relict Plant Amentotaxus yunnanensis
WANG De．1 ian， LI Zhong-chao， GE Xue—jun
(South China Botanical Garden,the Chinese Academy ofSciences，Guangzhou 510650，China)
Abstract：A mentotaxus yunnanensis Li(Taxaceae)is a rare and relict species with limited distribution．1LAPD
markers were used to determine the genetic variation within and among 4 populations ofA．yunnanensis and one
population ofA． 删 ．Although high level ofgenetic diversity was found inA． yunnanensis at the species
level(Percentage of polymorphic loci：79．0％，Nei’S genetic diversity：0．27 1 8)，there existed much lower genetic
variation within populations(Percentage ofpolymorphic loci：18．0％and 6．9％：Nei’S genetic diversity：．0．0688 and
0．0 1 98，for A．yunnanensis and A． r，nos帆0，respectively)．A high degree of diferentiation among populations
was detected in A．yunnanensis(0．76 ll，0．7503 and 0．7526 for AMOVA，Nei’S coe伍cient of diferentiation(GsT)
and Shannon inform ation index，respectively)．It is suggested that the historical factors，including severe botleneck
and subsequent genetic drift during Quatemary glaciations and fragmentation in postglaciation，smal population
sizeandlow seedlingestablishmentwouldhavecontributedto suchapopulationgenetic structurein A．yunrumens／s．
Based on these results，strategies are proposed for the genetic conservation and management ofA．yunnanensis．
Key words：A mentotaxus yunnanensis；Genetic diversity；1LAPD
遗传多样性是指地球上所有生物携带的遗传
信息的总和，是一切多样性的基础和最重要的成
分，是生物进化的本质【”。近年来的研究表明，遗传
多样性的丧失将对物种生存带来不利影响『2】。对濒
危植物遗传多样性研究不仅能了解物种的进化历
收稿 日期：2004—06—02 接受日期：2004—10—14
基金项目：国家自然科学基金项目(30170070)资助
通讯作者 Coresponding author
史以及导致物种稀有或濒危的机制，而且关系到能
否采取科学有效的措施来保护濒危物种，是保护生
物学研究的核心之一【 。
目前，用于遗传多样性研究的分子标记主要有
等位酶、随机扩增多态 DNA(RAPD)、简单重复序
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热带亚热带植物学报 第 13卷
列 (SSR)、简单重复序列区间(ISSR)和扩增长度
片段多态(AFLP)等技术。其中RAPD技术由于其具
有简便、快速、经济、DNA用量少、多态性好等特点
已经广泛应用于遗传多样性检测、基因定位、品系
鉴定、医学诊断、遗传图谱构建和系统学研究等诸
多领域I4]。最近研究表明，RAPD和 AFLP一样，可以
作为可靠的分子标记使用同。
云南穗花杉 mentotaxus yunnanensis Li)分布
于云南和贵州的部分地区，越南北部也有分布，是
国家二级保护植物【叼。台湾穗花杉 ．厂0删 os帆口Li)
仅见于台湾南部，生于海拔 850—1 000 m的山地林
中，为国家一级保护植物【7】。目前对云南穗花杉的研
究仅限于形态学、分类学和生态学方面。Wang等[81
曾对台湾穗花杉的遗传多样性做过等位酶和
RAPD分析，为了深入了解云南穗花杉遗传结构及
其形成的原因，本研究选取了一个台湾穗花杉居群
作为对照，采用RAPD方法对云南穗花杉 4个居群
和台湾穗花杉 1个居群遗传多样性进行分析，检测
云南穗花杉居群的遗传结构，为有效保护云南穗花
杉提供科学的取样策略。
1材料和方法
1-1材料采集
云南穗花杉材料取自云南麻栗坡，西畴和贵州
兴义市七舍，安龙县石盘共4个天然居群。台湾穗
花杉材料取自台湾浸水营 1个居群。根据居群大
小，每个居群各取 20—21株个体的新鲜叶片，分别用
硅胶进行快速干燥固定带回实验室于室温下保存备
用。5个居群的地理位置和取样个体数详见表1。
表 1云南穗花杉和台湾穗花杉居群的地理位置和取样个体数
Table 1 Localities and numberofsamplesfrom A．yunnanens／s
andA．
．加rm0sn， populations
⋯ A誉ltiude N umbe ro
1．2 DNA的制备和 PCR扩增
采用 CTAB法【9]提取基因组 DNA，通过 1％的
琼脂糖电泳检测DNA质量，．20~(2保存备用。从上海
生工 RAPD引物中筛选出9个能获得清晰条带且
反应稳定的引物fS26，$29，$30，$32，$37，$39，S106，
S140，S186)用于 5个居群的 PCR扩增。每个
RAPD—PCR反应体系为20 l，其中包括20 ng的模板
DNA，1 0 mmol／L Tris—HC1(I)H 9．0)，50 mmol／L KCL
0．1％ Triton X一100， 2．7 mmol／L MgC12，0．1 mmol／L
dNTPs，2％ formamide，200 nmol／L primer及 1．5 U
Taq酶。每个引物均设一个空白对照反应以排除系
统误差。反应在 PTC一100型 PCR反应仪上进行。反
应程序为首先94~C预变性4 min，接着进行以下45
个循环：94℃ 15 S，35—38℃ 45 S，72℃75 s；最后
72℃延伸7 min。反应产物在含溴化乙锭 (ethidium
bromide，0．1 g ml )的 1．5％琼脂糖凝胶中，以0．5x
TBE为电泳缓冲液电泳分离，最后用紫外成像系统
LabWorks Software Version 3．0(vvP，Upland，CA
91786，USA)成像，用 100 bp的DNA ladder作为分
子量标准。
1．3数据分析
同一位点的产物按扩增有 (1)无 (0)记录电
泳带谱，形成 RAPD表型数据矩阵用于进一步分
析。采用PoPGENE v1．31软件【 Ol计算多态位点百分
率(P)、Nei’S居群水平基因多样性指数(He)、Nei’s
物种水平基因多样性指数(H0、遗传分化系数(GsT)、
Nei’S遗传距离(D)及遗传一致度(D ”】。用NTSYSpc
2．0【。习中的SHAN程序对两种穗花杉的遗传距离进行
UPGMA聚类。由于ISSR为显性分子标记，因此我们
也计算了Shannon’S多样性指数Ho=一∑p og 。
Ho分别在居群水平(Hpop)和物种水平(Hsp)上计
算，居群间分化采用 (nsp—npop)msp估计。采用
AMOVAprep1．0t 】和AMOVA1．55软件【 4]分析遗传
变异在居群间及种间的分布情况，同时用Mantel
test㈣检测云南穗花杉4个居群的空间距离和遗传
距离之间的相关性。
2结果
2．1遗传多样性
9个RAPD引物共扩增出清晰谱带 143条，两
个种共有的有71条谱带(47．33％)。云南穗花杉4个
居群扩增出 138条谱带，多态谱带 113条，台湾穗
花杉扩增出83条谱带，多态谱带为 10条(表2)。
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第2期 王德莲等：云南穗花杉的遗传多样性研究 145
表 2 RAPD引物序列及其扩增情况
Table 2 Sequences ofRAPD primer and description ofamplifcation
No·
Primer Sequence ～ ta
o
a
f
⋯ 一
云南穗花杉A．yunnanensis 台湾穗花杉A．formasana
单态位点
Monomorphic
loci
多态位点
Polymorphic
loci
单态位点
Monomorphic
loci
多态位点
Polymorphic
loci
GGTCCCTGAC
GGGTAAcGCC
GTGATCGCAG
TCGGCGATAG
GACCGCTTGT
CAAACGTCGG
ACGCATcGCA
GGTCTAGAGG
GATACCTCGG
云南穗花杉 4个居群中，单个居群的多态位点
百分率( 为 16．8％一18．9％，平均为 18．0％；Nei’s
基因多样性指数(He)为0．0593—0．0724，平均0．075；
Shannon多样性指数(Hpop)值为0．0892—0．1064，平
均为0．1006。以兴义市七舍和西畴两个居群具有最
高的遗传变异fP：18．9％，18．9％；He：0．0716，0．0724；
Hpop：0．1061，0．1064)(表 3)。物种水平上，多态位点
百分率(P)为79．0％，基因多样性指数(HT)为0．2718，
Shannon多样性指数(HsP)为0．4066。与云南穗花杉
4个居群相比，台湾穗花杉居群遗传多样性最低，多
态位点百分率仅为6．9％；物种多态位点百分率为
1 2．0％ 。 ．
2．2遗传结构
AMOVA分析表明，云南穗花杉和台湾穗花杉
种间的遗传分化很小，两个种种间区别引起的变异
只占0．21％，而种内居群间和居群内变异却分别占
82．27％和 17．53％。在云南穗花杉内，大部分遗传变
异存在于居群间而非居群内(居群间：76．11％)(表
4)。Nei’s遗传分化系数(G盯)和Shanon多样性指
数f分别为 0．7503和 0．7526)均验证 了在云南穗花
杉内存在极大的遗传分化。
云南穗花杉4个居群中，遗传距离从0．2266到
0．4203，平均为0．347。西畴和安龙之间的遗传距离
最高(D：0．4203)，兴义市七舍和麻栗坡之间的遗传
距离最低(D=0．2266)。四个居群间的遗传一致度(I)
为 0．6569-0．7973，平均为 0．708(表 5)。Mantel test
检测表明，遗传距离和空间距离不显著相关(r=0．775，
P<0．05)。根据遗传距离进行的UPGMA聚类分析显
示(图 1)，云南穗花杉4个居群聚在一起，和台湾穗
花杉分为对应的 2组。
表 3 居群内的遗传多样性
Table 3 Genetic variability within populationsA．yunnanensi
He：居群水平基因多样性指数 Nei’S gene diversityindex at populationlevel；HT：物种水平基因多样性指
数 Nei’Sgene diversityindex at species1evel Gsr：Nei’S基因分化系数 Nei’S coeficient ofgene diferemiation；
Hpop：居群内Shannon多样性指数 Shannon information index within population level；Hsp：物种水平 Shannon
多样性指数Shannon information index at species leve1．
1 l l l 0 4 O 0 2
8 7 8 8 7 7 “ 8
¨ 9 M 9 " H
7 5 8 3 0 6 O 8 6
6 9 0 2 7 9
％ 加
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l46 热带亚热带植物学报 第 l3卷
表 4 分子方差(AMOVA)分析
Table 4 Analysis ofmolecular variance(AMOVA)
表 5 云南穗花杉和台湾穗花杉的遗传一致度(对角线上)
和遗传距离(对角线下)
Table 5 Nei’S genetic identity(above diagona1)and genetic
distance(below diagona1)among populations
ofA．yunnanens／~andA．fo／7nO$O／／A~
Xingyi
Malipo
Anlong
Xichou
Taiwan
0．O0 0．20 0．40 0．60
Nei’s遗传距 离 Nei’s genetic distanc e
图1云南穗花杉和台湾穗花杉居群间
Nei’S遗传距离 UPGMA聚类图
Fig．1 UPGMA dendrogram based on Nei’S genetic distance
3讨论
3．1遗传多样性
目前用 RAPD研究裸子植物遗传多样性的资
料比较多，但是不同物种之间遗传多样性差异较
大。李晓东 峒对水杉的 RAPD分析显示各居群多
态位点百分率差异显著(10．53％一33．33％)；汪小全
等【 7】对银杉的分析表明各居群多态位点百分率为
32％；而葛永奇等【 8】的分析显示银杏的遗传多样性
水平较高fP：68％)。Hamrick＆Godt ltgl根据等位酶
研究结果总结了55种裸子植物的遗传多样性，显
示这些裸子植物的多态位点百分率(P)平均为
70．9％。本研究中云南穗花杉虽然在物种水平上遗
传多样性不低(P：79．0％)，但是在居群水平上，多态
位点百分率fP)仅为 18．0％，台湾穗花杉更低。Wang
等【8]对台湾穗花杉 Tawu和 Tsatsayalai两个居群共
45个个体的研究显示，它们的多态位点百分率为
20．87％。在本研究中，台湾穗花杉浸水营居群的多
态位点百分率也只有 12．0％。这种差别可能一方面
是研究的居群不同，另一方面可能使用的引物不同
造成的。可见，台湾穗花杉遗传多样性偏低。
物种的遗传多样性和其分布范围有很大关系，
与广布种相比，狭域分布种容易受到遗传漂变的作
用从而遗传多样性通常较低【 9]。云南穗花杉分布狭
窄，仅分布于云南和贵州的少数地区，且居群规模
小，容易受到遗传漂变的作用，降低居群的遗传多
样性水平。此外，物种的遗传多样性还受物种进化
过程中历史事件的影响。据化石记载，穗花杉属
mentotaxus)自晚白垩纪以来曾广泛分布于北美[硼
和欧洲[21]的中纬度地区，第四纪冰川使得穗花杉属
的分布区急剧缩小，大量的穗花杉属植物因为不能
抵御冰川的作用而灭绝，因此现代自然分布区大为
缩小，并且呈零星分布【 。最终保存下来的居群代表
保存了原始穗花杉属的部分基因型。有可能在这个
进化历史过程中云南穗花杉经历了严重的瓶颈效
应，导致遗传多样性大大降低。
生活史特征被认为是影响遗传多样性水平和
分化的主要因素【 。长寿命、远交、风媒传粉的裸子
植物居群间的遗传分化应该较低 。然而，越来越多
的研究显示，一些具有此特点的裸子植物具有较高
的居群间遗传分化[24】。云南穗花杉 的遗传分化在
75％左右，表明云南穗花杉居群间的分化十分强烈。
云南穗花杉的G 值明显高于其它具有相似生态特
征的木本植物(热带分布树种 G ：0．119；异交风媒
树种 Gsr：0．077；重力传播种子树种 G ：0．131) 。
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第2期 王德莲等：云南穗花杉的遗传多样性研究 147
本研究结果表明，尽管在种的水平上，云南穗花杉
有较高的遗传多样性，但是这种多样性分布在各个
居群间，每个居群的遗传变异都很少。
植物群体的遗传变异水平和群体遗传结构是
其进化历史、分布范围、繁育方式、种子散布机制等
各种不同因素综合作用的结果 。在影响物种遗传
结构的各个生活史特征中，物种的繁育系统对其遗
传多样性高低和结构影响较大。尽管云南穗花杉为
风媒传粉、雌雄异株植物，但是由于居群规模小，一
方面易于引起遗传漂变，另一方面容易导致后代的
自交，从而导致遗传多样性的降低和遗传分化的加
剧 。另外，基因流的强弱对居群分化具有重要影
响。在植物中，花粉和种子的扩散和传播是基因流
的两种最主要形式。云南穗花杉种子较大，不利于
传播，而且易被动物取食；种子发芽率低，幼苗成活
率低，这些因素都会限制居群间的基因交流，加剧
居群间的遗传分化。
云南穗花杉和台湾穗花杉的区别仅在于前者
叶较宽，雄球花通常四穗以上集生，较台湾穗花杉
长 5—10 cm[z7]。近来有学者认为它们应该属于 1个
种 。在本研究的5个居群中，遗传变异主要存在于
居群之间，云南穗花杉和台湾穗花杉之间的遗传差
异很小，但是台湾居群又可以和大陆居群通过聚类
分析分开，因此我们支持周其兴 将它们合并为一
个种，并将云南穗花杉和台湾穗花杉分别作为种下
的不同变种的处理。
3．2保护策略
物种的遗传多样性水平和遗传结构与其适应
性和进化潜力密切相关，故检测物种的遗传变异水
平和空间结构关系到物种保护和复壮的策略和措
施的制定 。尤其是针对稀有和濒危的物种以及受
人类直接干扰和破坏的物种，在缺乏基本的遗传学
信息的情况下很难制定科学合理的保护和抢救措
施。在对物种实施保护计划的过程中，就地保护地
点的选择和迁地保护的采样策略都需要遗传学资
料作为基础 。云南穗花杉的居群规模都较小，且居
群间存在着较大的遗传分化，因此每个居群都应该
得到保护。考虑到云南西畴和贵州兴义市七舍两个
居群具有最高的遗传多样性，因此建议首先对这两
个居群进行就地保护。在迁地保护时，鉴于居群间
分化较大，应该从所有居群进行采集样本，尽可能
多地保存遗传资源。
致谢 贵州省黔西南州林科所邓朝义，吴迎福，
昆明植物研究所龚洵，台湾成功大学蒋镇宇等协助
进行野外采集，在此表示衷心感谢。
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