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核 农 学 报
, 一 。
滩‘扭 匆由 份 油 翻映
鱼类乳酸脱氢酶同工酶 性质的研究
薛国雄 张燕生 官 平 杨 靖 赵淑慧
中国科学院发育生物学研究所 北京 。。。
刘爱知 夏德全 吴婷婷
中国水科院淡水渔业研究中心 无锡
·
本文报道草鱼 户入 。 ‘ ·二 月凡乳酸脱 氮酶 同 工 酶 一
的理化性质
, 并利用 的杭体 对 几种 鱼 的组 织 和 器官 进 行
了兔疫化 学分析 , 从 而 确 定 了这 几种 鱼 中 基 因产物 的表达情况
。
关键词 乳 酸脱氮晦同工晦 免疫化 学反应
前 玉日
研究鱼类的同工酶使我们能了解鱼类种群变化和进化的关系 〔‘
, “ ’ , 从而开辟新的生化
遗传指标分类方法 。
与哺 乳类一样 , 鱼类也有
、 、 种基因 , 但 比 ’砚乳类要复杂得多
。 一般认为鱼类的
基因是 由 基因进化而来 〔’
· “ ’ , 是在进化过程中形成的有别于 基因的特化基因 ,
‘
它 们 的
基因产物 ‘和 ‘ 既有共性又有特异性 。 对人和某些哺 乳类 的
、 、 基因 已经能 够 克
隆 ‘ , “ , 但对鱼类尚未见报道 , 而且 在纯化过程 中较难和 分开 , 开展这个领域 的 工
作对准确鉴定 同工酶酶诺十分重要
。
材 料 与 方 法
取草鱼新鲜心肌 叱在 缓冲液中匀浆 缓冲 液为 , 筑 基 乙 醇
,
氟化苯 甲基磺酞胺 , , 匀浆液经多层纱布过滤后 , 离心 ,
。 取 上
清液直接力在事先经过 平衡的 ‘ 亲和柱上 柱 , 活化的
和 偶联 。 待上清 液流完柱后 , 用平衡瞬冲 液
, 琉基
乙醇 , 洗至 一 为 以下 , 然后用线性洗脱液 和乳酸埋浓 度 从
至 抢 , 溶于 拍 、 筑基 乙醇中 , 洗脱 , 按 一 管 收 集 洗
脱液 , 在 一 叮 测定 特异活性峰
。 在洗脱 时
‘
,
,
、 、 均能被 洗 脱
下来 , 所 以洗脱过程 中要不断进行 电泳检查 , 收集那些富含 ‘ 的组分 , 合并后用 饱 和 硫 酸
按加至 饱和度 , 置 ℃冰箱中过夜 , 离心后沉淀用少量平衡缓冲液溶解 再用相 同 的 攀
护尽文于 ’ 年 月“ 日收至
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核 农 学 报 卷
冲液透析至无钱离子为止 , 即为 一 ‘样 品 〔“
, 」。
免疫抗体的制备是将 一 ‘样况注射到大耳 自兔 的脚趾和背部皮下 多
浏汽 注 射 ,
每 星期 次 , 星期后按常规 方法提取抗休 , 的最后浓度为 、 进行免 疫 化 学
反应时 , 抗原和抗体的 比例为
‘
至 体积比 , 抗原和抗休混 合 后 在 ℃保 温
,
一
离心 , 取上清液进行淀粉凝胶 电泳
。
结 果
一 一 ‘ 的理化性质
纯化后的 一 ‘经 电泳测定表明 , 只有 条 ‘带 图版
。 电泳 测 定 , 其 亚
基分子量与 一 ‘ 一样为 道尔顿
。
其理化性质的测定结果如下
图版 工 纯化前后草鱼心肌的 图谱
纯化前 纯化后
。
,
,
表
·
草鱼 一 ‘和 日一 ‘的氨基酸组成
‘ 一 ‘
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采用 一 双倒数作图测定米 氏常数 值 当底物乳酸钠浓度为 一
、
酶浓度为 一 时 , 值为 一 “ 。
底物浓度对酶反应的影响 当酶浓度为 。一
、
反应缓冲液为 磷 酸 缓 冲
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期 鱼类乳酸脱氢酶同工酶 性质的研究
液 、 温度 时 , 最适底物乳酸钠浓度为连 。
对酶促反应的影响 当酶浓度为 一 “
、 、 乳 酸钠 时 ,
则最适 为 士
。
温度的影响 测定结 果表明 , 当温度为 士 ℃时 , 酶活性最高 。
尿素的影 响 当尿素浓度大于 时
,
酶促反应急剧下降 , 说明在 尿素解聚 作 用 下 ,
被解聚成无活性的单体亚基
。
用 测定草鱼 一 ‘和 一 的氨基酸组成 以 和 四 聚 体 的分 子量为
道尔顿计算 , 其测定结果如表 , 表内数字为氨基酸数 目 。
上述测定结果表明 , 这些性质完全符合 田 的性质
, 特别是有较高的耐热性和能在
高 下进行反应的能力 ,’更是 一 ‘的特点 。
二 免痊化学反应结果
从图版 一 中我们可以看到 , 各种鱼的不同组织和器官经 ‘抗体 吸附后 , 仅留下
或 ‘
, 证明鱼类的 同工酶 , 只要是同一基因的产物 , 其抗原和抗休都能进行免疫化
学反应 〔“
· 。 , 这是一种 酶分子之间的免疫 同源性 。
图版 不同种鱼的不同器官 免疫化学反应后的 电泳图谱
,
草鱼白肌的 白肌样品 时 川抗 ‘的工 。 团头妨白肌的
白肌样品 林 卜 白肌样品 林 林 。 白蛀白肌的
白肌样品 林 林 白肌样品 林 林 。 螂鱼白肌的
白肌样品 林 林 白肌样品 川 林 弓
。
娜鱼心肌的
心肌样品 灿 协 。 团头鱿眼的 眼样品 林 林
一 眼样品 林 林
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比 一 肚 林
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五 协 林 扛
林
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林
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图版 不同种鱼的不同器官 免疫化学反应后的电泳图谱
”
团头鱿心肌的 心肌样品 川 闪 草鱼肾脏的
肾脏样品 林 林 肾脏样品 林 林 一 草鱼眼的
月氏样品 林 肚 眼样品 林 林 。 眼样品 川 林
草鱼脑的 脑样品 协 林 脑样品 林 肚
生 团头妨脾的 脾样品 林 脾样品 林 协
一 肚 牡
又 林 林 林
林 。
林 林 、 卜 协
。 林 林
一 八 卜 价 林 一 协 讯
林
卜 林 , 几 。 林
, 一 ,
图版 白继 种器官 免疫吸附图
心肌 心肌样品 仁 林
脑 脑样品 林 仁 脑样品 卜 林 。
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鱼类乳酸脱氢酶同工酶 ‘性质的研究
肾 肾样品 林 肚
肝 肝样品 扛 林
件 拌
“ 林 卜 卜 林
“ 林
林 林
民
图版 草鱼 种器官 ‘抗体坛 免疫吸附图
, 一
草鱼肌肉 肌肉样品十 抗体
草鱼心脏 心脏样品十 抗体坛
草鱼眼 眼样品 ‘抗体
一 一
一 一
一 二
讨 论
一 哺 乳类除了在精巢中有 基因的表达外 , 均为 和 基因 , 而且酶 谱 的 分布非常
有规律 。 在鱼类却不 同 , 目前的资料表明 , 鱼类只有 品种的 同工酶 酶 谱 呈 规律排
列 , 其余的 品种呈不规则排列 。 这种不规则包括酶谱排列的倒置及 、 、 种 基因产物组
成的四聚体混合排列
。 此外 , 鱼类 基因的产物并不特定的出现在一种组织 。 我们 的实验也
证明 , 多种鱼的肾
、 脾 、 肝和眼中都有 基 因或含有 基因产物的复合四聚体 , 这 种 情况说
明 , 鱼类的 比起哺乳类 来说 , 还处在不稳定的进化过程中 , 因此 , 分析 的不同
基因产物的酶谱 , 则可探讨鱼类的分类和种群的进化程度 。
二 从图版 中 , 我们可以看到一些不规则的酶带 如箭头所示 , 不少研究者认为 , 这
是 基因的产物 。 我们用 一 ‘抗体 去吸附 , 则未能被吸附掉 图版 , 而用 ‘抗体
去吸附则可 以吸附掉 图版
。 同样 , 我们用 抗体 去吸附 , 也能够吸附掉 , 可见 ,
这些多余的谱带是 ‘和 ‘的复合四聚体 。
三 我们用 纯化 , 一般说 , 它对哺乳类的各种 都 有 轻度的亲
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。
击 助成 翩必 蹄 。枷 孙加
二 ·
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和吸附能力 , 它们对哺乳类的吸附量约 占 ‘ 的 。 可是对鱼类 , 它却有着完全的亲 和吸 附
能力 , 我们用草鱼心肌做材料 , 用 来吸附 , 则可提纯含 基因的各个组分
。
参 考 文 献
薛国雄 从 同工酶看基因进化 。 生物科学动态 , , 一 。
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