全 文 ：云南莲瓣兰主栽品种SSR指纹图谱的构建和遗传差
异分析
黄永艺1a*, 唐敏1a*, 张志荣2, 李枝林1a, 毕玉芬1b**
(1. 云南农业大学， a. 园林园艺学院； b. 动物科学技术学院， 昆明 650201； 2. 中国科学院昆明植物研究所西南野生生物种质资源库，昆明 650204)
摘要： 为了解云南莲瓣兰(Cymbidium tortisepalum)的遗传多样性，利用 SSR 技术对 32 个莲瓣兰主栽品种进行遗传变异分析，
并构建莲瓣兰栽培品种的指纹图谱。结果表明，筛选出的 12 对多态性高、稳定性好的引物共检测到 95 个等位基因，每对引物
检测到 4~18 个等位基因，有效等位基因数(NE)为 61.489，平均有效等位基因数(NA)为 5.124，Shannon 信息指数(I)和多态性信
息含量(PIC)分别为 0.806~2.624 和 0.789~ 0.953。12 对引物中，以引物 SSR03 的等位基因数、NE、观测杂合度、I 和 PIC 最高。
32 个品种在 12 对引物上都具有不同的特异性条带，可以彼此区别。从 12 对引物中筛选出 3 对核心引物 SSR02、SSR03 和
SSR12 构建了莲瓣兰主栽品种 SSR 分子指纹图谱，这 3 对核心引物组合即可鉴定 32 个莲瓣兰栽培品种。这为莲瓣兰的品种
鉴定、遗传多样性分析和分子育种研究提供理论基础和技术支持。
关键词： 莲瓣兰； 遗传多样性； SSR； 指纹图谱
doi: 10.11926/j.issn.1005–3395.2015.03.002
Construction of SSR Fingerprint and Genetic Variance Analysis on
Cymbidium tortisepalum Cultivars in Yunnan Province
HUANG Yong-yi1a*, TANG Min1a*, ZHANG Zhi-rong2, LI Zhi-lin1a, BI Yu-fen1b**
(1a. College of Horticulture and Landscape; 1b. College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;
2. Germplasm Bank of Wild Species in Southwest China, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204, China)
Abstract: In order to understand the genetic diversity of Cymbidium tortisepulum, the fingerprints of 32 C. tortisepulum
cultivars were constructed by SSR. The results showed that there were 95 alleles were detected by selected 12
pairs of primers, the number of alleles selected by one primers ranged from 4 to 18, and the number of mean
alleles (NA) and effective alleles (NE) were 61.489 and 5.124, respectively. The Shannon information index (I) and
polymorphism information content values (PIC) of 32 cultivars ranged from 0.806 to 2.624, and 0.789 to 0.953,
respectively. Among 12 paris of primer, the primer SSR03 was the highest in NA, NE, observed heterozygosity (HO),
I and PIC. All of 32 cultivars had different specific bands by 12 pairs of primer. The SSR molecular fingerprints of
32 cultivars were built by 3 core pairs of primers, including SSR02, SSR03 and SSR12. All of 32 cultivars could
be distinguished each other by combined primers of SSR02 + SSR03 + SSR123. These would provide theoretical
热带亚热带植物学报　2015， 23(3)： 236 ~ 244
Journal of Tropical and Subtropical Botany
收稿日期： 2014–09–28　　　　接受日期： 2015–01–14
基金项目： 国家自然科学基金项目(31260487)资助
作者简介： 黄永艺(1986~ )，男，在读硕士，主要从事观赏植物资源利用与创新。E-mail: huangyongyi_2008@yeah.net； 唐敏(1979~ )，女，在读博
　士，主要从事植物种质资源研究工作。E-mail: tangminyn@163.com
* 对本文贡献等同，并列第一作者
** 通信作者 Corresponding author. E-mail: biyufenynnd@sina.com
第3期 237
莲瓣兰(Cymbidium tortisepalum)别名小雪兰、
卑亚兰、菅草兰[1]，是兰科(Orchidaceae)兰属植物，
兰科植物在全世界约有 730 多属 21500 余种[2–3]。
莲瓣兰、春兰(C. goeringii)、蕙兰(C. faberi)、建兰(C.
ensifolium)、墨兰(C. sinense)、寒兰(C. kanran)、春剑
(C. goeringii var. longibracteatum)被称为七大中国
兰[4]。莲瓣兰作为传统滇兰主栽品种，在滇西北一
带有近半个世纪多的栽培驯化历史[5]，具有独特的
观赏价值。莲瓣兰栽培品种繁多，由于育种原始材
料遗传基础局限于已存在的品种资源中，加之其异
花授粉和长期的选择育种，造成品种间形态差异微
小，同种异名现象较严重，在市场交易中受到很多
困扰和造成经济纠纷。目前莲瓣兰栽培品种主要
通过叶鞘、叶宽、花部主要特征等表观性状进行鉴
定，而其形态表现易受环境、栽培基质等因素影响，
且在开花时期才能进行有效鉴定，故鉴定周期长，
辨别困难，因此亟需快速有效的鉴定方法。
SSR 简单重复序列(Simple sequence repeat)，又
称为微卫星(Microsatellite)，是指在真核生物基因组
中存在 1~6 个碱基可变次数的串联重复 DNA 序
列[6]。SSR 标记具有数量丰富，分辨率高，稳定性和
重复性好的特点，且其数据分析自动化程度高，扩
增产物片段易判读及赋值，满足品种 SSR 指纹图
谱构建工作的要求[7]，因此，被国际植物新品种权保
护联盟(International Union for the Protection of New
Varieties of Plants, UPOV)指定为构建品种 DNA 指
纹数据库的首选标记[8–9]。
近年来，基于分子标记技术对国兰的遗传多样
性分析及 DNA 指纹图谱构建的研究已有报道[10–12]，
但利用 SSR 标记技术构建莲瓣兰品种 DNA 指纹
图谱及应用研究尚未见报道。本研究从自行开发
的春兰[13]及莲瓣兰[14]引物中筛选出 12 对稳定性
好、多态性丰富的 SSR 引物，构建莲瓣兰主栽品种
SSR 分子指纹图谱，旨在为莲瓣兰品种的分子快速
鉴定、亲缘关系分析提供技术支持，为构建国产莲
瓣兰主栽品种的 DNA 指纹数据库奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
2011 年至 2012 年采集 32 个具有较高经济价
值的莲瓣兰(Cymbidium tortisepalum)主要栽培品种
(表 1)，采集地点在大理兰国花业有限责任公司温
室内。采集的莲瓣兰嫩叶用保鲜袋封存后置于硅
胶干燥盒中带回中国科学院昆明植物研究所西南
野生生物种质资源库标本馆 –80℃冷贮保存待用。
1.2 叶片总DNA的提取
参照改良的 CTAB 法[15]提取莲瓣兰的基因组
DNA。将新鲜叶片材料剪碎用液氮冷却后快速研
磨，在研磨时加入适量 PVP(抗氧化)，然后加入预热
的 4×CTAB 提取液在 65℃温浴 60 min，用等体积
的氯仿-异戊醇(24：1)抽提 2 次，上清液加 70% 体
积的异丙醇沉降 DNA。提取的 DNA 在 1×TAE 缓
冲液下用 1.0% 的琼脂糖凝胶(加溴化乙锭，EB)进
行电泳和检测。
1.3 PCR-SSR反应扩增
筛选的 12 对 SSR 引物信息见表 2。PCR 反应
体系为 20 µL，包括 9.2 µL 双蒸水，9.2 µL 2×mix
反 应 体 系，0.3 µL 的 双 向 引 物，0.8 µL 的 模 板
DNA；反应条件为：95℃预变性3 min；然后94℃40 s，
53℃~59℃40 s，72℃60 s，共 35 个循环；最后 72℃
延伸 7 min。
1.4 毛细管电泳检测
PCR产物利用QIAxcel全自动电泳系统(QIAgen
Inc., USA)，选择参数 OM700-3.5s 进行毛细管电泳
分型。电泳结果输出后在 QIAxcel Biocalculator 进
行片段长度读取和预处理，然后将片段长度数据输
出到 Excel。
1.5 数据分析
SSR 数 据 在 Excel 中 编 辑 为 GenAlEx 6.41[16]
basis and technical support for studying in the identification of C. tortisepalum cultivars, genetic diversity analysis
and molecular breeding.
Key words: Cymbidium tortisepalum; Genetic diversity; SSR; Fingerprint
黄永艺等：云南莲瓣兰主栽品种SSR指纹图谱的构建和遗传差异分析
238 第23卷热带亚热带植物学报
表 1 供试材料
Table 1 List of materials tested
编号
No.
品种
Variety
花型
Flower type
花部特征
Flower characteristics
C01 中意蝶 Zhongyidie 蝶花 Butterfly 副瓣蝶化 Butterfly lateral calyx
C02 天姿梅 Tianzimei 瓣型花 Petaline 梅瓣花 Plum blossom flap
C03 万寿锦荷 Wanshoujinhe 瓣型花 Petaline 荷瓣花 Lotus flap
C04 梁祝 Liangzhu 蝶花 Butterfly 捧瓣全蝶 Fully-butterfly lateral petal
C05 满江红 Manjianghong 蝶花 Butterfly 捧瓣全蝶 Fully-butterfly lateral petal
C06 云鹤梅 Yunhemei 瓣型花 Petaline 梅瓣花 Plum blossom flap
C07 恨天高 Hentiangao 瓣型花 Petaline 荷瓣花 Lotus flap
C08 碧龙奇蝶 Bilongqiqie 蝶花 Butterfly 捧瓣内蝶 Inner butterfly lateral petal
C09 黄金海岸 Huangjinhaian 奇花 Peculiar 多舌 Multi-tongue
C10 滇荷 Dianhe 瓣型花 Petaline 荷瓣花 Lotus flap
C11 滇梅 Dianmei 瓣型花 Petaline 梅瓣花 Plum blossom flap
C12 奇花素 Qihuasu 奇花 Peculiar 六出 Six flaps
C13 红舌头 Hongshetou 色花 Colorful 红舌 Red tongue
C14 高品素 Gaopingsu 色花 Colorful 白花素心 White-flower pure heart
C15 太白素 Taibaisu 素花 Pure 白花素心 White-flower pure heart
C16 白雪公主 Baixuegongzhu 素花 Pure 白花素心 White-flower pure heart
C17 云溪蝶 Yunxidie 蝶花 Butterfly 捧瓣全蝶 Fully-butterfly lateral petal
C18 碧玉素 Biyusu 素花 Pure 绿花素心 Green-flower pure heart
C19 玉兔 Yutu 蝶花 Butterfly 捧瓣全蝶 Fully-butterfly lateral petal
C20 朱丝玉荷 Zhusiyuhe 瓣型花 Petaline 荷瓣花 Lotus flap
C21 翠晶红轮 Cuijinhonglun 色花 Colorful 复色花 Complex color
C22 馨海蝶 Xinghaidie 蝶花 Butterfly 捧瓣全蝶 Fully-butterfly lateral petal
C23 雁南飞 Yannanfei 奇花 Peculiar 少瓣奇花 Lake flap peculiar
C24 心心相印 Xinxinxiangyin 色花 Colorful 红舌 Red tongue
C25 赵氏梅 Zhaoshimei 瓣型花 Petaline 梅瓣花 Plum blossom flap
C26 映山红 Yingshanhong 色花 Colorful 红花 Red flower
C27 粉荷 Fenhe 瓣型花 Petaline 荷瓣花 Lotus flap
C28 汗血宝马 Hanxuebaoma 蝶花 Butterfly 捧瓣全蝶 Fully-butterfly lateral petal
C29 天女散花 Tiannüsanhua 奇花 Peculiar 树形奇花 Tree type peculiar
C30 荷之冠 Hezhiguan 瓣型花 Petaline 荷瓣花 Lotus flap
C31 国色天香 Guosetianxiang 奇花 Peculiar 牡丹瓣 Peony flap
C32 大唐凤羽 Datangfengyu 蝶花 Butterfly 捧瓣全蝶 Fully-butterfly lateral petal
输入格式，导入或打开宏文件进行数据分析和格式
转换，统计每个位点的等位基因数(Number of allels,
NA)、有 效 等 位 基 因 数(Effective number of alleles,
NE)、观 察 杂 合 度(Observed heterozygosity, HO)、期
望 杂 合 度(Expected heterozygosity, HE)和 Shannon
信 息 指 数(Shnnon’s information index, I)[17]，SSR
位 点 多 态 性 信 息 含 量(Polymorphism information
content, PIC)，采用 Anderson 等[18]的简化公式计算：
1–∑Pij
2， Pij
2 表示为标记 i 的第 j 个带型出现的频率。
1.6 SSR指纹图谱构建
以所分析的 SSR 引物名称为前缀，该标记在某
第3期 239
样品上扩增带的分子量为后缀，得到每个样品在某
个标记的带型编号。将产生的引物带型编号进行
综合排序，串联各个带型编号，构建该品种的 SSR
指纹图谱。
2 结果和分析
2.1 莲瓣兰基因组DNA的提取
使用改良的 CTAB 法提取莲瓣兰栽培品种的
基因组 DNA，用 Nanodrop 紫外分光光度计检测
OD260 和 OD280，其 OD260/OD280 均在 1.8 左右，表明
所提取的 DNA 纯度较高。经 TE 溶液溶解，用 0.8%
琼脂糖凝胶电泳检测，可见 DNA 的主带清晰，条带
整齐，无降解及明显的拖尾现象(图 1)。这表明所
提取的 DNA 的质量、纯度较高，完全满足后续的
SSR-PCR 反应的要求。
2.2 SSR位点多态性分析
利用 12 对引物对 32 个莲瓣兰栽培品种基因
组 DNA 进行扩增，结果表明，12 对引物共扩增
出 95 个等位基因(表 3)，单个引物的等位基因数为
3~18 个，引物的平均等位基因数为 7.917，有效等位
表 2 SSR 引物
Table 2 SSR primers tested
引物
Primer
正向引物 (5′~3′)
Forward primer
反向引物 (5′~3′)
Reverse primer
重复单元
Repeat motif
GenBank 登录号
GenBank Accession No.
SSR01* TCTGTCGCTTGCCTACTTT GCCCTATGCTGGTCTACG (AG)22 JNO54646
SSR02* TTGGGAGACGAGTAGGTG CTGTGAGATCGGCTGAAT (AG)12 KJ636209
SSR03* GGGCTGCTCTTCCACTTC CGCCACCGTTACCTTCAT (AG)22 KJ636210
SSR04* GTGTTCCATGTTAGCTGGTC TGCTACAATCCCACTCCC (AG)16 JN054648
SSR05* GGAACAAGTGGGCTTCAC CCTTGCCAGCTTAGTCTCC (AG)4AA(AG)13 JN054656
SSR06* GCTCTGCTCATTCCCTCT GTAACCAAGAATTTCAACAT (AC)10 JN054642
SSR07* GTCTTCTCCTTCTCCCTC CTTCTGGCTCTTCTTCACT (CT)14 JN054647
SSR08# GAACCGCAATCTCATACT ATTCGCCAGTTGTTATTC (CT)16 HM161448
SSR09# CCGTCGCTTTCTTGCTTC GCCGCTGATTCTGGTGTT (AG)11 HM161442
SSR10# GAGTAAGCAGGGATGTCG AGCGGGAACTATTGAAGG (TC)13(GT)8 HM161446
SSR11* TAATGGAATGATGCGTAG CAGTAATTGGACCCTAAC (GA)10(CA)7(AC)6 JN054639
SSR12* CTGAGCATCGACCAGTCA GTGGAGGAATACAACAGACA (CA)8TA(CA)11 KJ636211
#: 来自春兰； *: 来自莲瓣兰。
#: From Cymbidium goeringii; *: From C. tortisepalum.
图 1 莲瓣兰栽培品种基因组 DNA 的琼脂糖凝胶电泳。M: 标准分子量； 1~20 代表表 1 中的 C01~C20。
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of DNA in Cymbidium tortisepalum cultivars. M: DL 1000 standard Marker; 1–20 present C01–C20 in Table 1.
黄永艺等：云南莲瓣兰主栽品种SSR指纹图谱的构建和遗传差异分析
240 第23卷热带亚热带植物学报
基因数是 1.954~11.571，平均为 5.124，这表明 12 对
引物均具有较好的扩增效果。引物 SSR03 扩增的
等位基因数最多，达 18 个，等位基因数位点最少的
引物是 SSR11，只有 3 个。扩增的有效等位基因数
最多的是引物 SSR12，多达 11.571 个，最少的是引
物 SSR06，为 1.954。观测杂合度和期望杂合度分
别为 0.094~0.774 和 0.488~0.914，平均分别为 0.379
和 0.732。Shannon 信息指数和多态性信息含量分
别 为 0.806~2.624 和 0.789~0.953。12 对 引 物 中，
引物 SSR03 的等位基因数、有效等位基因数、观测
杂合度、Shannon 信息指数和多态性信息含量值最
高，而引物 SSR06 和 SSR11 的最低。
2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳及毛细管电泳分析
莲瓣兰 PCR 扩增产物经琼脂糖电泳初步检测
后，再经过聚丙烯酰胺凝胶电泳，拍照留像后选择
条带清晰，杂带少的扩增产物进行毛细管电泳。从
图 2 和图 3 可知，引物 SSR03 的扩增效率高，扩增
表 3 12 对 SSR 引物扩增信息
Table 3 Amplification by 12 pairs of primer
引物 Primer TM (℃) 长度 Length (bp) n NA NE HO HE I PIC
SSR01 57 186~218 25 7 5.411 0.160 0.815 1.805 0.888
SSR02 65 177~233 32 14 7.728 0.750 0.871 2.272 0.943
SSR03 63 103~151 31 18 11.174 0.774 0.911 2.624 0.953
SSR04 60 179~223 30 7 4.489 0.300 0.777 1.636 0.894
SSR05 63 137~181 32 7 4.511 0.625 0.778 1.667 0.899
SSR06 54 187~205 30 4 1.954 0.100 0.488 0.866 0.819
SSR07 58 138~178 30 5 3.333 0.267 0.700 1.387 0.863
SSR08 54 224~280 32 6 2.663 0.313 0.625 1.245 0.874
SSR09 59 310~336 32 4 3.205 0.469 0.688 1.225 0.849
SSR10 55 127~139 31 6 3.343 0.290 0.701 1.412 0.879
SSR11 58 185~233 32 3 2.107 0.094 0.525 0.806 0.789
SSR12 61 150~206 27 14 11.571 0.407 0.914 2.545 0.939
合计 Total 364 95 61.489 4.549 8.793 19.490 10.589
平均 Mean 30.333 7.917 5.124 0.379 0.732 1.624 0.882
TM: 退火温度； n: 样本数； NA: 等位基因数； NE: 有效等位基因数； HO: 观察杂合度； HE: 期望杂合度； I: Shannon 信息指数； PIC: SSR 位点多态
性信息含量。
TM: Annealing temperature; n: Number of samples; NA: Number of allels; NE: Effective number of alleles; HO: Observed heterozygosity; HE: Expected
heterozygosity; I: Shnnon’s information index; PIC: Polymorphism information content.
图 2 引物 SSR03 对莲瓣兰栽培品种的 PCR 扩增产物。M：标准分子量； 1~16 为 C1~C16 品种。
Fig. 2 PCR amplification of Cymbidium tortisepalum cultivars by primer SSR03. M: DL 1000 standard Marker; 1–16 are cultivars from C1 to C16.
第3期 241
图 3 引物 SSR03 对 12 个莲瓣兰栽培品种 PCR 扩增产物的电泳分型图。E01~E12 代表品种 C21~ C32。
Fig. 3 Electrophoresis classification of PCR amplified products of 12 Cymbidium tortisepalum cultivars by primer SSR03. E01–E12 stand for cultivars C21–C32.
表 4 莲瓣兰主栽品种的特征引物及其带型
Table 4 Specific primers and bands of Cymbidium tortisepalum cultivars
品种
Cultivar
特征引物
Specific primer
特异性条带
Specific bands
品种
Cultivar
特征引物
Specific primer
特异性条带
Specific bands
品种
Cultivar
特征引物
Specific primer
特异性条带
Specific bands
C1 SSR01 210,218 C12 SSR03 127,141 C22 SSR08 234,234
SSR09 320,324 SSR13 164,164 C23 SSR02 197,205
SSR10 185,195 C13 SSR02 203,233 　 SSR03 105,105
SSR12 168,176 SSR03 117,129 　 SSR06 197,197
C2 SSR02 189,205 SSR05 145,165 　 SSR08 256,280
SSR05 153,171 SSR10 185,203 C24 SSR02 197,207
C3 SSR03 129,131 C14 SSR01 206,210 　 SSR03 111,131
SSR12 164,186 SSR02 203,207 　 SSR05 171,177
C4 SSR03 111,127 SSR03 121,131 　 SSR08 266,266
SSR12 186,200 SSR05 135,153 C25 SSR03 105,145
C5 SSR02 195,203 SSR09 320,336 C26 SSR12 162,168
SSR03 113,125 SSR12 154,186 C27 SSR03 123,127
SSR12 206,206 C15 SSR02 199,203 　 SSR07 150,170
C6 SSR03 113,121 SSR03 111,135 　 SSR12 200,200
SSR09 324,336 SSR12 154,162 C28 SSR02 201,201
C7 SSR02 197,203 C16 SSR03 111,135 　 SSR03 117,139
SSR03 111,111 　 SSR04 181,209 　 SSR07 138,144
C8 SSR03 103,129 C17 SSR02 211,211 C29 SSR02 207,211
SSR06 193,197 C18 SSR02 203,213 　 SSR03 113,129
SSR07 158,170 　 SSR03 111,115 　 SSR10 211,233
SSR12 168,182 C19 SSR02 207,207 　 SSR12 186,190
C9 SSR02 189,207 　 SSR03 111,151 C30 SSR02 207,217
SSR03 113,141 　 SSR05 135,135 　 SSR03 119,129
SSR12 154,154 　 SSR09 330,336 　 SSR12 178,186
C10 SSR03 117,127 C20 SSR04 223,223 C31 SSR03 129,141
SSR06 178,197 　 SSR05 145,145 　 SSR07 138,138
SSR08 278,278 　 SSR12 176,176 　 SSR10 185,233
SSR11 216,218 C21 SSR02 193,199 C32 SSR03 129,145
SSR12 176,182 　 SSR03 103,103 　 SSR04 201,209
C11 SSR03 117,117 C22 SSR03 113,139 　 SSR05 135,159
　 SSR12 190,200 　 SSR07 144,144 　 SSR07 170,170
黄永艺等：云南莲瓣兰主栽品种SSR指纹图谱的构建和遗传差异分析
242 第23卷热带亚热带植物学报
表 5 32 个莲瓣兰栽培品种的 SSR 指纹图谱
Table 5 Fingerprint of 32 Cymbidium tortisepalum cultivars based on SSR markers
品种
Cultivar
指纹图谱
Fingerprint
品种
Cultivar
指纹图谱
Fingerprint
C1 SSR02-203,209/SSR03-111,121/SSR12-168,176 C17 SSR02-211,211/SSR03-127,127/SSR12-178,178
C2 SSR02-189,205/SSR03-129,129/SSR12-178,178 C18 SSR02-203,213/SSR03-111,115/SSR12-186,186
C3 SSR02-205,213/SSR03-129,131/SSR12-164,186 C19 SSR02-207,207/SSR03-111,151/NULL
C4 SSR02-205,205/SSR03-111,127/SSR12-186,200 C20 SSR02-207,213/SSR03-129,129/SSR12-176,176
C5 SSR02-195,203/SSR03-113,125/SSR12-206,206 C21 SSR02-193,199/SSR03-103,103/SSR12-150,150
C6 SSR02-201,211/SSR03-113,121/NULL C22 SSR02-203,209/SSR03-113,139/SSR12-186,186
C7 SSR02-197,203/SSR03-111,111/SSR12-156,156 C23 SSR02-197,205/SSR03-105,105/SSR12-150,150
C8 SSR02-205,213/SSR03-103,129/SSR12-168,182 C24 SSR02-197,207/SSR03-111,131/SSR12-156,156
C9 SSR02-189,207/SSR03-113,141/SSR12-154,154 C25 SSR02-205,205/SSR03-105,145/SSR12-172,172
C10 SSR02-203,203/SSR03-117,127/SSR12-176,182 C26 SSR02-203,211/NULL/SSR12-162,168
C11 SSR02-205,213/SSR03-117,117/SSR12-190,200 C27 SSR02-203,211/SSR03-123,127/SSR12-200,200
C12 SSR02-205,205/SSR03-127,141/SSR12-164,164 C28 SSR02-201,201/SSR03-117,139/NULL
C13 SSR02-203,233/SSR03-117,129/SSR12-172,172 C29 SSR02-207,211/SSR03-113,129/SSR12-186,190
C14 SSR02-203,207/SSR03-121,131/SSR12-154,186 C30 SSR02-207,217/SSR03-119,129/SSR12-178,186
C15 SSR02-199,203/SSR03-111,135/SSR12-154,162 C31 SSR02-205,213/SSR03-129,141/SSR12-168,168
C16 SSR02-201,211/SSR03-113,135/NULL C32 SSR02-205,205/SSR03-129,145/NULL
NULL: 无扩增。
NULL: No amplification.
谱带具有比较好的多态性，杂带条数少，可用于后
续的指纹图谱构建分析。
2.4 SSR指纹图谱分析
采用 12 对 SSR 引物对 32 个莲瓣兰主栽品种
进行指纹分析，结果表明，所采用的引物均为特征
引物，32 个品种在 12 对引物中都具有不同的特
异性条带(表 4)，以特征引物的特异性条带可与其
他品种区分开。特征引物 SSR02 在天姿梅(C02)、
满江红(C05)、黄金海岸(C09)等 16 个品种有特异
条带。SSR03 在万寿锦荷(C03)、梁祝(C04)、满江
红(C05)等 26 个品种上都具有特异性条带。SSR12
在中意蝶(C01)、万寿锦荷(C03)、梁祝(C04)等 15 个
品种上都具有特异性条带。C17 (云溪蝶)、C25 (赵
氏 梅)、C26 (映 山 红)等 3 个 品 种 分 别 在 SSR02、
SSR03、SSR12 引物上扩增出唯一的特异性条带，
条带值分别为 211/211、105/145、162/186。可见，
这 3 对引物扩增的多态性丰富且特异性条带较多，
涵盖了 32 个莲瓣兰主栽品种，在品种指纹图谱鉴
定中可优先选择。
2.5 指纹图谱构建
根据各对引物扩增的等位基因数、扩增谱带及
特异性条带，最终从 12 对引物中筛选出 3 对多态
性丰富的核心引物。将这 3 对核心引物组合后进
行鉴定，构建莲瓣兰主栽品种的 SSR 分子指纹图
谱(表 5)，仅用引物 SSR03 可以区分万寿锦荷(C03)、
梁 祝(C04)、满 江 红(C05)等 27 个 品 种，增 加 引 物
SSR02，则可鉴别 29 个品种。但中意蝶(C01)、朱丝
玉荷(C20)、映山红(C26)等 3 个品种用引物 SSR03
和 SSR02 不 能 区 分，但 SSR12 引 物 能 扩 增 出 不
同的特异性带型，即采用 3 对引物组合(SSR02 +
SSR03 + SSR12)可将 32 个莲瓣兰品种完全区分开
(表 5)。
第3期 243
3 讨论
3.1 莲瓣兰栽培品种的遗传多样性
在 筛 选 出 的 12 对 SSR 引 物 中，3 对 引 物
(SSR02、SSR03、SSR12)扩增出的等位基因数均
大于或等于 14 个。从期望杂合度、Shannon 信息
指数、多态性信息含量来看，云南莲瓣兰栽培品种
具有较高的遗传分化和遗传多样性。这可能是因
为云南莲瓣兰的栽培和利用历史悠久，引种实践极
为频繁，造成育种材料和种质资源的遗传基础复
杂；莲瓣兰是异花授粉植物，选择变异与无性扩繁
是新品种选育的主要途径，导致其品种具有较大的
异质性。这也与贾琳等[19]的研究结果一致，即莲瓣
兰的遗传变异主要来自于居群内部，且具有丰富的
遗传多样性。
3.2 莲瓣兰种质资源指纹库的构建
本研究中，32 个莲瓣兰栽培品种都能够扩增
出特异性谱带。但是随着品种数量的增多，原来在
某一对引物上具有特异性条带的品种，有可能不是
唯一的，即其它的品种在该引物上同样具有相同的
特异性条带。这是因为特异性条带是相对的，只对
于固定的有限的样品有效[20]。因此，需要进行大量
的引物筛选工作，应用更多的多态引物构建莲瓣兰
种质资源指纹库。
3.3 SSR标准指纹图谱可用于品种的鉴定
用核心引物组合法[21]构建植物的 SSR 标准指
纹图谱，已被广泛用于植物的品种鉴定，并可实现
准确快速鉴定[22]。本研究采用核心引物组合法构
建了莲瓣兰 SSR 标准指纹图谱，不但将 32 个莲瓣
兰栽培品种区分开来，还为莲瓣兰主栽品种的准确
快速鉴定提供了条件。对规范莲瓣兰市场行为和
资源的保护提供了技术支撑。但由于本研究参试
的品种和引物数量有限，还需要进一步增加品种材
料及引物数量，并引入标准验证体系，不断完善莲
瓣兰品种快速鉴定指纹图谱模型。
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