全 文 ：马兜铃(Aristolochia debilis Sieb. et Zucc)为马
兜铃科(Aristolochiaceae)马兜铃属植物，其果实和
根有重要的药用价值，果实的药材名是马兜铃，为
清肺镇咳化痰药；茎的药材名为天仙藤，能祛风活
血；根的药材名为青木香，有解毒、利尿、理气止痛
的功效；故马兜铃又名青木香、天仙藤等[1]。然而，
马兜铃不含腋芽茎段不定芽的诱导
宋运贤1,2,3, 张强1,2, 杜雪玲1,2, 彭贺1, 唐润1, 张园园1, 陈耀锋3*
(1. 淮北师范大学生命科学学院， 安徽 淮北 235000； 2. 资源植物生物学安徽省重点实验室， 安徽 淮北 235000； 3. 西北农林科技大学农学院，
陕西 杨凌 712100)
摘要： 为建立马兜铃(Aristolochia debilis Sieb. et Zucc)不含腋芽茎段的不定芽诱导体系，采用正交设计方法研究植物生长调节
剂、预培养方式和 AgNO3 对不定芽诱导的影响。结果表明：植物生长调节物质对不定芽诱导的影响以 TDZ > 6-BA > IAA，其
中 TDZ 的影响极显著(P<0.01)，6-BA 的影响显著(P<0.05)。不定芽诱导的最适培养基为 MS + 0.5 mg L–1 TDZ + 0.1 mg L–1
IAA + 0.5 mg L–1 6-BA + 2 mg L–1 AgNO3 + 3% 蔗糖 + 0.6% 琼脂(pH 5.8)；预培养方式为在 MS + 0.1 mg L
–1 2,4-D + 3% 蔗糖 +
0.6% 琼脂培养基上暗培养 2 d。马兜铃不含腋芽茎段的不定芽诱导率最高可达 37.5%。
关键词： 马兜铃； 茎段； TDZ； 不定芽诱导； AgNO3
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2014.04.012
Induction of Adventitious Buds from Stems without Axillary Bud of
Aristolochia debilis Sieb. et Zucc
SONG Yun-xian1,2,3, ZHANG Qiang1,2, DU Xue-ling1,2, PENG He1, TANG Run1, ZHANG Yuan-yuan1,
CHEN Yao-feng3*
(1. College of Life Science, Huaibei Normal University, Huaibei 235000, China; 2. Anhui Key Laboratory of Plant Resources and Biology, Huaibei
235000, China; 3. College of Agronomy, Northwest Agricultural and Forestry University, Yangling 712100, China)
Abstract: In order to establish adventitious bud induction system from stem segments without axillary bud of
Aristolochia debilis Sieb. et Zucc, the effects of plant growth regulators, pre-culture pattern and AgNO3 on the
induction rate were studied by using orthogonal design method. The results showed that the effects of plant growth
regulators on adventitious bud reduction from stems were in the order of TDZ > 6-BA > IAA, in which TDZ and
6-BA had significant influence at 0.01 and 0.05 levels, respectively. The optimum medium for adventitious bud
induction was MS + 0.5 mg L–1 TDZ + 0.1 mg L–1 IAA + 0.5 mg L–1 6-BA + 2.0 mg L–1 AgNO3 + 3% sucrose +
0.6% agar (pH 5.8). After the explants were pre-cultured on MS + 0.1 mg L–1 2,4-D + 3% sucrose + 0.6% agar (pH
5.8) in dark for 2 days, and then transferred on adventitious bud induction medium, the rate of adventitious bud
induction could reach to 37.5%.
Key words: Aristolochia debillis; Stem; TDZ; Adventitious bud induction; AgNO3
热带亚热带植物学报　2014， 22(4)： 406 ~ 412
Journal of Tropical and Subtropical Botany
收稿日期： 2013–11–18　　　　接受日期： 2014–01–03
基金项目： 国家转基因生物新品种培育项目(2009ZX08002008B)；安徽省教育厅重点项目(KJ2013A232)；资源植物生物学安徽省重点实验室项
　目(ZYZWSW2014009, ZYZWSW2014004)资助
作者简介： 宋运贤(1976~ )，男，硕士，副教授 , 研究方向为农业生物技术。E-mail: songyunxian@aliyun.com
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: chenyf3828@126.com
第4期 407
临床上出现的马兜铃酸肾毒性现象和潜在的致癌
作用引起了国际医药界的高度重视，因此，国家食
品药品监督管理局于 2004 年 8 月取消了青木香药
用标准，凡国家药品标准处方中含有青木香的中成
药品种应替换为土木香[2–3]。但是，有研究表明，土
木香在植物来源、亲缘关系、功效主治、化学成分、
药理作用和临床应用等方面与青木香有很大差异，
因此，二者不应相互替代[4]。
在明确马兜铃酸药效和作用机理的基础上运
用现代基因工程手段对其进行定点改造，以消除其
肾毒性是解决这一问题的有效途径。而建立高频
率的离体再生体系是遗传转化获得成功的前提和
基础。目前，国内外对马兜铃的研究主要集中于成
分分析、药理作用、肾毒性作用、栽培措施、快速繁
殖等方面[3–10]，对再生体系的研究报道主要涉及通
过愈伤组织阶段的再生[11–12]，而无腋芽茎段直接诱
导不定芽再生植株还未见报道。本文以马兜铃不
含腋芽的茎段为材料，通过研究不同植物生长调节
剂的配比和不同预处理方式对不定芽诱导的影响，
以期建立高效的马兜铃茎段再生体系，为开展马兜
铃遗传转化的研究奠定技术基础。
1 材料和方法
1.1 材料
马兜铃无菌组培苗经西北农林科技大学农学
院陈耀锋教授鉴定为马兜铃科马兜铃属马兜铃
(Aristolochia debilis Sieb. et Zucc)。 选 取 大 小 基
本一致的马兜铃组培苗，切取两腋芽之间的无腋
芽茎段，修剪成 1 cm 左右的长度，横放接种于培
养基中。
1.2 植物生长调节剂的影响
采用 L9(3
4)正交设计，研究 6-BA、IAA 和 TDZ
对马兜铃茎段不定芽诱导的影响(表 1)。以 MS 为
基本培养基，所有培养基均含30 g L–1 蔗糖和6 g L–1
琼脂，pH 调至 5.8。
1.3 AgNO3的影响
以 MS + 0.5 mg L–1 6-BA + 0.1 mg L–1 IAA +
0.5 mg L–1 TDZ + 3% 蔗糖 + 0.6% 琼脂为不定芽诱
导培养基，分别添加 0.5、2.0、5.0、10.0 和 20.0 mg L–1
的 AgNO3。
1.4 预培养方式的影响
采用双因素设计研究 2,4-D 和黑暗预培养时
间对马兜铃不含腋芽茎段不定芽诱导的影响。茎
段预培养以 MS 为基本培养基，2,4-D 设置 0、0.1、
0.5、1.0 和 2.0 mg L–1 共 5 个水平；黑暗预培养时
间设置 0、2、4、6 和 8 d。诱导培养基为 MS +
0.5 mg L–1 6-BA + 0.1 mg L–1 IAA + 0.5 mg L–1 TDZ +
3% 蔗糖 + 0.6% 琼脂，pH 5.8。
宋运贤等：马兜铃不含腋芽茎段不定芽的诱导
表 1 植物生长调节剂对不定芽诱导的影响
Table 1 Effects of plant growth regulators on adventitious bud induction
6-BA
(mg L–1)
IAA
(mg L–1)
TDZ
(mg L–1)
外植体数
Number of explants
诱导不定芽数
Number of adventitious buds induced
不定芽诱导率
Rate of adventitious bud (%)
1 0.5 0.1 0.5 100 22 22.00±0.54
2 0.5 0.5 1.0 104 4 3.85±0.32
3 0.5 1.0 1.5 78 6 7.69±0.75
4 1.5 0.1 1.0 96 4 4.17±0.43
5 1.5 0.5 1.5 110 2 1.82±1.28
6 1.5 1.0 0.5 116 22 18.97±0.59
7 2.5 0.1 1.5 94 2 2.13±1.46
8 2.5 0.5 0.5 108 10 9.26±0.15
9 2.5 1.0 1.0 144 2 1.39±0.93
K1 11.18a 9.43a 16.74a
K2 8.32a 4.98a 3.13b
K3 4.26b 9.35a 3.88b
R 6.92 4.46 13.61
408 第22卷热带亚热带植物学报
表 2 植物生长调节剂对不定芽诱导的方差分析
Table 2 Variance analysis of plant growth regulators on adventitious bud induction
因素 Factor 自由度 Degree of freedom 平方和 Sum of squares 均方 Mean squares F P
6-BA 2 72.55 36.275 20.75 0.046*
IAA 2 38.995 19.497 11.15 0.082
TDZ 2 351.159 175.580 100.44 0.010**
误差 Error 2 3.496 1.748
合计 Total 8 466.200
表 3 AgNO3 对马兜铃不定芽诱导的影响
Table 3 Effect of AgNO3 on adventitious bud induction of Aristolochia debilis
AgNO3
(mg L–1)
接种外植体数
Number of explants
诱导的不定芽数
Number of adventitious bud induced
不定芽诱导率 (%)
Rate of adventitious bud induction
0 98 14 14.29±0.46C
0.5 104 18 17.31±2.39B
2.0 94 27 28.72±0.77A
5.0 100 8 8.00±0.84D
10.0 90 4 4.44±0.66E
20.0 120 1 0.83±0.72F
数据后不同大写字母表示差异极显著(采用 LSD 法 , α = 0.01)。
Data followed different capital letters indicate significant differences at 0.01 level by LSD test.
以上各种处理均重复 3 次，培养温度为(25±2)℃，
光照强度为 25 μmol m–2s–1，光照时间 14 h d–1。
1.5 数据处理和统计
培养 35 d 后统计不定芽诱导率。不定芽诱导
率=诱导不定芽的茎段数 / 接种的茎段数 ×100%。
运用 SPSS 对试验数据进行方差分析，多重比较采
用 LSD 法。
2 结果和分析
2.1 植物生长调节剂的影响
将马兜铃不带腋芽的茎段接种在诱导培养基
上，培养 5 d 后茎段的两端开始膨大，9 d 后在茎段
伤口处开始有愈伤组织长出，15 d 时愈伤组织继
续长大并开始变绿，25 d 后茎段上开始分化出不
定芽。由表 1 可知，植物生长调节剂对马兜铃不含
腋芽茎段的不定芽诱导率的影响以 TDZ > 6-BA >
IAA；且 在 6-BA (0.5 mg L–1)、IAA (0.1 mg L–1)、
TDZ (0.5 mg L–1)的 配 比 下，不 定 芽 的 诱 导 率 达
22.0%。方差分析(表 2)表明：TDZ 对马兜铃不含腋
芽茎段的不定芽诱导率有极显著影响(P<0.01)，6-BA
有显著影响(P<0.05)，而 IAA 无显著影响(P>0.05)。
综上分析，马兜铃不含腋芽茎段的不定芽诱导
的最适培养基为 MS + 0.5 mg L–1 6-BA + 0.1 mg L–1
IAA + 0.5 mg L–1 TDZ，pH 调至 5.8。
2.2 AgNO3的影响
由 表 3 可 知，在 培 养 基 中 添 加 不 同 浓 度 的
AgNO3，马兜铃不含腋芽茎段的不定芽诱导率不
同。添加 2.0 mg L–1 AgNO3 的不定芽诱导率达到
最大，为 28.72%，而不添加 AgNO3 的不定芽诱导率
仅为 14.29%，两者之间的差异显著。随着 AgNO3
浓度的增加，马兜铃茎段诱导的愈伤组织也逐渐减
少，在添加 20.0 mg L–1AgNO3 培养基中，马兜铃茎
段几乎不能诱导出愈伤组织，也几乎不能诱导出不
定芽。
2.3 预培养的影响
将马兜铃不含腋芽茎段先接种在含不同浓度
的 2,4-D 培养基上，并在黑暗下预培养一定时间。
结 果 表 明，预 培 养 基 中 添 加 0.1 mg L–1 2,4-D 有
第4期 409
利于不定芽的诱导(表 4，图 1)，较高浓度的 2,4-D
(1~2 mg L–1)会抑制不定芽的诱导，与对照差异显
著，甚至部分茎段还分化出不定根(图 1)。黑暗预
培养时间以 2 d 为宜，时间延长使不定芽诱导率呈
下降趋势。马兜铃不含腋芽茎段在添加 0.1 mg L–1
2,4-D 培养基上黑暗预培养 2 d，不定芽诱导率可达
图 1 预培养对不定芽诱导的影响。A: 2,4-D 0.1 mg L–1，预培养 2 d；B: 2,4-D 1 mg L–1，预培养 8 d。
Fig. 1 Effect of pre-culture on adventitious bud induction. A: Pre-cultured for 2 days with 0.1 mg L–1 2,4-D; B: Pre-cultured for 8 days with 1 mg L–1 2,4-D.
表 4 2,4-D 和黑暗预培养时间对马兜铃不定芽诱导的影响
Table 4 Effects of 2,4-D and pre-culture in dark on adventitious bud induction of Aristolochia debilis
2,4-D
(mg L–1)
黑暗预培养时间 Pre-culture
days in dark
接种外植体数
Number of explants
诱导的不定芽数
Number of adventitious buds induced
不定芽诱导率 (%)
Rate of adventitious bud induction
0 0 107 11 10.28±1.50
2 107 17 15.89±1.37
4 101 18 17.82±0.82
6 109 17 15.60±1.49
8 96 7 7.29±1.58
0.1 0 105 10 9.52±1.65
2 104 39 37.50±2.37
4 108 22 20.37±1.60
6 99 18 18.18±0.55
8 100 12 12.00±0.21
0.5 0 101 11 10.89±1.54
2 104 22 21.15±1.51
4 104 12 11.54±0.19
6 102 12 11.76±0.35
8 114 6 5.26±0.14
1.0 0 108 10 9.26±1.60
2 105 18 17.14±0.49
4 100 7 7.00±1.60
6 114 7 6.14±1.52
8 100 0 0.00±0.00
2.0 0 102 11 10.78±1.46
2 100 11 11.00±1.66
4 122 4 3.28±0.99
6 104 3 2.88±0.05
8 110 0 0.00±0.00
宋运贤等：马兜铃不含腋芽茎段不定芽的诱导
410 第22卷热带亚热带植物学报
37.5%。方差分析结果表明，2,4-D 和黑暗预培养
时间对马兜铃不含腋芽茎段不定芽诱导率有极显
著影响(P<0.01)。多重比较(表 5)的结果表明，预培
养基中添加 0.1 mg L–1 2,4-D 与对照的差异显著，黑
暗预培养 2 d 与对照的差异显著。
3 讨论
建立高效的组织培养再生体系是利用遗传
转化技术获得转基因植株的重要前提之一。近年
来 , 有关植物遗传转化的研究报道所采用的再生
体系主要有原生质体再生[13]、体细胞胚发生[14]、愈
伤组织再生[10–12]和再生苗茎段、叶的器官直接发生
等[15–16]，其中通过植株的器官直接发生的途径，较
前几种再生系统具有周期短、操作简便、培养过程
中发生的变异少的特点，是采用最多的再生系统。
迄今为止 , 建立的马兜铃再生体系多以愈伤组织
为主[10–12]，由愈伤组织再生植株过程中发生无性系
变异的可能性较大，转化的外源基因稳定性较差。
另外由于马兜铃叶片较小，取出培养瓶后易脱水卷
曲，不易切割培养。本试验以不含腋芽的茎段为材
料建立再生体系，具有操作简便、周期短、嵌合体相
对较低、遗传稳定性高等优点。通过初步探索，目
前已初步建立了较为高效的再生体系，为后续进一
步优化建立转基因受体系统打下了良好的基础。
TDZ 是一种新型的植物生长调节剂，具有很强
的细胞分裂素活性，可以促进植物不定芽的再生和
繁殖、打破芽的休眠、延缓植物衰老等[17]。TDZ 可
通过抑制叶片的脂质过氧化作用来保护细胞膜结
构的完整性、阻止叶片叶绿素的降解、延缓离体叶
片和茎段的衰老、抑制 POD 活性，从而提高再生效
率[18]。但高浓度的 TDZ 容易导致试管苗的变形、
坏死、褐变，从而不利于芽或根的发生[19]。崔波等[15]
的研究表明，TDZ 在火龙果(Hylocereus undulatus)
茎段再生过程中起着重要的作用，0.4 mg L–1 TDZ
有利于植株的再生。黄芩(Scutellaria baicalensis)
茎段的诱导研究也表明，TDZ 诱导不定芽的能力
优于其它植物生长调节剂。本研究结果也表明，
TDZ 是促进马兜铃不含腋芽茎段不定芽诱导的主
要因子，较低浓度对不定芽的诱导有很好的促进
作用，随着浓度的升高，不定芽诱导率迅速下降。
Heutteman 等[20]的研究表明，高浓度的 TDZ 促进了
木本植物愈伤组织的形成。本研究结果也表明，高
浓度的 TDZ 会导致茎段切口边缘部位产生较多的
愈伤组织，进而降低了不定芽的诱导率。
外植体切口部位的细胞会产生大量自身保护
物质乙烯。有研究指出，在组织培养中外植体产生
的高含量乙烯会引起外植体褐化死亡和植株畸形
发育；Beyer 认为 Ag+ 是一种较好的乙烯活性抑制
剂[21]，对许多单子叶和双子叶植物离体形态发生有
促进作用，可以使植株再生率显著提高。Radke[22]
等报道，分化培养基中添加 AgNO3，可以促进芽原
基的产生和伸长。但 Neidz 等[23]认为 AgNO3 在子
叶植株再生中并无促进作用。Laurie[24]等在研究芜
青子叶再生中认为低浓度 AgNO3 (5.9~29.4 μmol L
–1)
利于子叶再生，高浓度(>117.7 μmol L–1)起到明显
的抑制作用[24]。本研究结果也表明：适宜浓度的
AgNO3 对马兜铃茎段不定芽诱导有促进作用，与
对照相比，外植体褐化现象减轻，当添加 2 mg L–1
AgNO3 时，不定芽诱导率达到最大，而 AgNO3 浓度
高于 5 mg L–1 对马兜铃不含腋芽茎段不定芽诱导
有抑制作用。
牛建新等[25]指出，组织培养过程中暗培养可以
促进不定芽的高效诱导，这可能是由于 IAA 在光下
表 5 2,4-D 和黑暗预培养时间对马兜铃不定芽诱导的多重比较
Table 5 Multiple comparison of 2,4-D and pre-culture in dark on adventitious bud induction of Aristolochia debilis
2,4-D
(mg L–1)
不定芽诱导率 (%)
Rate of adventitious bud induction
黑暗预培养时间
Pre-culture days in dark
不定芽诱导率 (%)
Rate of adventitious bud induction
0 13.36±4.26b 0 10.13±1.47b
0.1 19.49±10.24a 2 20.49±9.49a
0.5 11.72±5.35b 4 12.00±6.73b
1.0 7.86±5.84c 6 10.90±5.94b
2.0 5.57±4.71c 8 4.48±4.76c
同列数据后不同小写字母表示差异显著(采用 LSD 法， α=0.05)。
Data followed different small letters within column indicate significant differences at 0.05 level by LSD test.
第4期 411
的分解减少，从而相对提高了 IAA 浓度，进而刺激
了不定芽的产生。有学者认为葡萄再生需要一个
暗处理过程，时间为 1~4 周[26]。本试验结果也表明，
适当的暗培养有助于诱导不定芽形成，最佳暗培养
时间为 2 d，这比其他的研究结果偏短，可能是由于
物种的差异造成的。至于暗培养促进不定芽诱导
的机理还有待进一步研究。
已有研究表明，2,4-D 预培养可以显著提高
不定芽的诱导率，白菜型油菜(Brassica campestris)
在添加 1 mg L–1 2,4-D 培养基上预培养 3 d, 再生率
由 43.5% 提高到 89.0%[27]。芜菁(Brassica rapa ssp.
rapifera)在 1 mg L–1 2,4-D 的分化培养基上预培养
2 d，可将不定芽再生率由 81.2% 提高到 92.0%[28]。
但李文静等[29]指出 , 较高的 2,4-D 浓度会抑制植
株再生能力。本研究结果表明，预培养基中添加
0.1 mg L–1 2,4-D 可以促进马兜铃不含腋芽茎段诱
导不定芽，但 2,4-D 浓度达 1~2 mg L–1 时，不定芽
诱导率明显降低，同时生根明显增加，这与前人的
研究结果一致。研究结果还表明，在高浓度 2,4-D
和短时间黑暗预培养，容易诱导出不定芽；相同条
件下预培养时间长则容易诱导出不定根(图 1)，这
为我们后继试验中利用差异克隆方法去克隆芽、根
诱导相关基因打下了基础，这也是我们下一步研究
的方向。
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