全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，l4(4)：321—326
Journa／ofTropical and Subtropical Botany
甘蓝和青花菜杂种小孢子培养
陈文辉，方淑桂， 曾小玲，朱朝辉 ，廖晓珍
(1．福州市蔬菜科学研究所，福州350012)
摘要 ：对甘蓝 Brassica o~racea var．capitata)×青花菜 Brassica oleracea var．i~ica)的 20个杂种及相应的父母本进行游
离小孢子培养，并对影响甘青杂种小孢子胚胎发生的主要因子进行探讨，适于小孢子培养的培养基为 1／2NLN，附加
0．5mgL。。NAA、0．05mgL。。BA、 5mgL。AgNO3、0．2mgL‘。2,4一D和 0．1 mgL 活性炭。结果有 l4个杂种能产生胚状
体，诱导率 70％；不同杂种问小孢子胚胎发生频率存在很大差异，最高的是绿洲 808x夏宝，平均每蕾 16．2个胚。诱导杂
种胚状体发生的最佳时期是小孢子单核靠边期至双核期，34℃热激 2 d有利于小孢子细胞对称分裂。在含糖 170 g L，
的液体培养基中培养 3 d，添加低糖 (含糖 110 gL-)的培养液，可显著提高出胚率。
关键词：甘蓝；青花菜；杂种．，J、孢子培养
中图分类号：S 635．036 文献标识码：A 文章编号：1005—3395(2006104—0321—06
Isolated—microspore Culture of Fl Hybrids between Brassica oleracea
var．cap／tata and var．／ta／／ca
CHEN Wen—hui， FANG Shu—gui， ZENG Xiao—l ing， ZHU Chao—hui， LIAO Xiao．zhen
(1．Fuzhou Institute of Vegetable Rese~ch，Fuzhou 350012，China；)
Abstract：Microspore culture of twenty F1 hybrids between cabbage Brassica oleracea vaf．capitata)and broccoli
(Brasswa oleracea vaf．italic0)and their coresponding parents were carried out，and the major factors afecting
microspore embryogenesis was investigated．Liquid medium 1／2NLN was used for microspore culture，which
contained 0．5 mg L。NAA， 0．05 mg L—BA， 5 mg L～AgNO3， 0．2 mg L 2,4一D an d 0．1 mg L active carbon．
Results showed that fourteen F1 hybrids could produce embryoids，the induced frequency being 70％ ．The highest
embryo producing rate appeared in‘Luzhou808xXiabao’witl averaging 16．2 embryos developed per flower bud．
The optimum period of microspores for embryoid development Was from late uninucleate(1ate anaphase D stage to
binucleate(anaphase II)aage．The heat-shock treatment at 34℃ f0r 2 days was beneficial for stimulating
symmetric unclean division of microspore cells．Th e embryo production was signifcan tly increased in liquid
medium containing 170 g L。sucrose for 3 days andthen by adding low sucrose content(110 g L )．
Key words：Brassica oleracea Var．capitata；Brassica oleracea Var．italica；Hybrid；Isolated-microspore culture
结球甘蓝 (Brassica oleracea Var．capitata L．)和
青花菜 Brassica oleracea var．italica)是芸苔属甘蓝
种的两个变种，两者杂交易获杂交种子。青花菜富含
维生素，品质口感均优。为培育新的甘蓝种质资源，
将青花菜的品质性状转入甘蓝，育成优质的甘蓝新
收稿 日期 ：2005．12-12 接 受 日期 ：2006．03．27
基金项目：福建省科技厅重大项目(2003N022)资助
品种，用常规方法要进行杂交、回交和自交分离，需
好几个世代才能选育出理想的材料。而用游离小孢
子培养方法对甘青杂种进行培养，利用小孢子数量
多、在离体培养过程中易发生突变、选择机会大和
自然加倍率高等特点，可快速获得双单倍体纯系，
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322 热带亚热带植物学报 第 l4卷
缩短育种年限并提高育种效率。自Lichter【 】首次从
甘蓝型油菜小孢子培养获得胚状体后，国内外已相
继在油菜、白菜、青花菜、甘蓝、萝 卜等芸苔属作物
上获得成功【 ，并被用于种问杂种的研究【 61，但迄
今尚未有甘蓝变种间杂种小孢子培养的报道。本试
验对甘蓝、青花菜及其 F．代进行小孢子培养，对影
响杂种小孢子胚胎发生的有关因子进行了研究，旨
在建立甘青杂种小孢子培养的高效技术体系，为甘
蓝优质育种提供新的途径。
1材料和方法
1．1 供试材料
10个甘蓝品种与易出胚的青花菜绿洲 808经
正、反交后的杂交一代(F。)及相应的亲本共 31份为
试材 (表 1)，在 自然条件下栽培，2004年 8月上旬
播种，9月上旬定植，2005年 1月中旬至 4月上旬
供体材料陆续开花进行试验。
1．2 亲本及杂种小孢子培养
为确定甘青杂种小孢子培养的适宜培养基，以
芸苔属游离小孢子培养常用的Lichtert 】修改的NLN
培养基为基础，对大量元素、蔗糖浓度、激素和生长
素作不同水平的试验，结果 1／2 NLN．14(大量元素
减半、蔗糖含量 140 g L )添加 0．5 mg L～NAA、
0．05 mg L～BA、5 mg L。 AgNO3、0．2 mg L～2,4-D和
0．1 mg L-i活性炭的培养基最好。因此，利用以上筛
选出的 1／2 NLN．14培养液作基本培养基。小孢子
分离培养基本上参照常规的方法和程序进行【 Ol，将
离心后的小孢子悬浮于经过滤灭菌的培养基中，用
血球计数器将小孢子密度调整为 1．5x10 个ml～，分装
于直径为 6 cm 的培养皿中，每皿 3 ml，用 Parafilm
膜封口，置于黑暗中进行 34℃热激预处理 48 h，然
后于25℃的黑暗条件下静止培养。
1．3 小孢子发育时期的试验
用绿洲 808与夏宝的正反交 F。为材料，在盛花
初期取 2．6—3．5、3．6—4．5、4．6—5．5、5．6—6．5 mil长度
的花蕾，分别进行分离，取沉淀物用醋酸洋红染色，
在显微镜下观察花蕾长度与小孢子发育时期的关
系，每个指标观察 2个视野，统计各时期的小孢子
数量，并分别进行培养。
1．4 热激预处理
将接种了绿洲 808x夏宝的 F。小孢子的培养皿
分别在 32~C、33℃、34℃、35~C下进行 24 h、48 h的热
激处理，以在 25~C恒温下培养为对照。
1．5 更新和加液培养
用绿洲 808~夏宝的 F。小孢子进行更新或加液
培养试验 。更新培养液培养设 3个处理：初始用
含蔗糖 170 g L-的培养液培养 3 d后重新离心
(800 rmin )，分别更换含蔗糖 170gL 、140gL 和
1 10 g L 的培养液继续培养。加液培养设 1个处理：
即初始用蔗糖 170 g L-的培养液 1．5 m1培养，3 d
后添加等量的含蔗糖 1 10 g L 的培养液培养。以一
直在蔗糖 140 g L-的培养液中培养的为对照。
1．6胚状体的发育与植株再生
培养至出现肉眼可见胚状体时，置摇床进行振
荡 (60 r min-)暗培养，形成子叶形胚状体时，进行
光照 (24~C 16 h d )培养，1周后转到含 20 g L 蔗
糖和 12 mg L 琼脂无激素的MS分化培养基上培
养，长出不定芽后转到20 g L 蔗糖、0．1 mg L IBA
的 1／2MS生根培养基上培养。
以上试验均取 20个花蕾，培养 5皿，3个重复。
培养过程中用倒置显微镜观察小孢子发育情况，光
照培养前统计出胚情况，并用邓肯新复极差法进行
产胚量问差异显著性测定。
2结果和分析
2．1不同亲本和杂种的胚胎发生
结球甘蓝与其它芸苔属作物相比，其游离小孢
子培养是最不容易诱导成功的材料之一，许多甘蓝
基因型对培养无反应，少部分有反应的产胚量也极
低 8】。在本试验条件下，10个甘蓝品种只有4个产
生胚状体，且出胚率低，平均每蕾只有 0．5—6．1个，
其余 6个材料经多次重复试验均无反应 (表 1)。
绿洲 808青花菜每个花蕾产胚 25．6个，是出胚
率高的基因型。
供试 20个 F．材料中有 14个能产生胚状体，出
胚率为 70％。但不同F．小孢子培养的出胚量差异显
著，最高的是绿洲 808x夏宝，平均每蕾 16．2个，最
低的是绿洲 808x秋绿，平均每蕾 1．6个，相差 l0倍
(表 1)。试验观察发现：(1)不同杂种小孢子出胚快慢
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第4期 陈文辉等：甘蓝和青花菜杂种小孢子培养 323
表 1 亲本及正反交杂种胚胎发生情况
Table 1 Embryogcnesis in parents and reciprocal hyb ds
同栏数据后不同大写字母表示在0．Ol水平上差异极显著。·表示每个花蕾诱导的胚数。Diferent leters within a
column indicate signifcant diferences at p=o．01． Number ofembryos per flower bud．
差异很大，最快出胚的是夏宝×绿洲 808，13 d用肉
眼就能见到胚状体，而最慢的是秋绿×绿洲 808，
40 d才能见到。同时，出胚早的材料出胚率高，胚状
体生长快，发育正常，畸形胚少。(2)杂种小孢子培
养在个体间发育进程表现 出明显的不同步性，夏
宝×绿洲 808的 F．培养 3周，大的子叶形胚长约 3—
4Him，而最小的球形胚仅 0．1 Him(图版 1：A—D)。
(3)亲本相同的 F。正反交材料出胚率没有明显差
异，杂种的出胚率介于父母本之间。(4)在青花菜
为亲本之一条件下，甘青杂种的胚胎发生与甘蓝亲
本关系密切，对培养无反应的甘蓝亲本的F。出胚率
低或不出胚，有反应的甘蓝亲本 F。都能出胚，出胚
率高的F．出胚率也高，成正比例关系。
2．2 小孢子不同发育阶段对胚胎发生的影响
以夏宝×绿洲 808正反交 F。为材料，比较各时
期小孢子培养的出胚量。观察结果表明，只有单核
靠边期和双核期的小孢子能发育成正常的胚状体。
镜检发现花蕾长为4．6—5．5 Him时，大部分的小孢子
处于单核靠边期和双核期，这时培养的小孢子出胚
量最高，平均每蕾产胚 16．2个；而花蕾长度在 3．6—
4．5 Him时，处于单核靠边期和双核期的小孢子比例
较少，因此出胚量较低；花蕾长度短于 3．6 Him，大部
分小孢子处于单核中期以前，培养不出胚状体；花
蕾长度大于 5．5 Him，大部分小孢子处于三核期，产
生正常的胚状体极少 (表 2)。
2．3 高温热激处理对胚胎发生的影响
高温热激预处理是促进细胞对称分裂，改变小
孢子发育方向的主要途径【9]。本试验用绿洲 808x夏
宝的F。小孢子进行高温热激处理，结果显示，温度
以34℃热激效果最佳，处理 48 h比24 h的出胚量
多；34℃48 h的处理组合每蕾平均产胚 15．8个，明
显高于其它的处理组合；25℃恒温培养的小孢子没
有诱导胚的产生 (表 3)。
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324 热带亚热带植物学报 第 14卷
表2 甘青杂种不同长度花蕾小孢子的发育阶段对胚胎发生的影响
Tlable 2 Efects ofdevelopmental stage ofmicrospores originated from diferent length
offlowerbudsonembryog~aesisinhybrid
+、++分别表示处于该时期的小孢子少和多。 同栏数据后不同大写字母表示差异极显著 (P=o．O1)。+、++means
less and more micmspore．respectively．Diferent letters within a column indicate significant diferences at P-O．O1．
裹 3 不同温度热激对甘青杂种小孢子胚胎发生的影响
Tlable 3 Efects ofdiferent heat·shock temperatures on
embryogenesis in hybrids
同列数据后不同大写字母表示差异极显著 (P=O．O1)。
Diferent leters within a column indicate signifcan t difer-
ences at P=O．O1．
2．4 添加和更换培养基对胚胎发生的影响
在绿洲 808x夏宝的 F 小孢子培养时进行更
新或加液试验。结果表明，加液培养的效果最好，
产胚量最多，平均每蕾产胚 16．2个，比对照增产
237．5％。更新培养液培养的 3个处理，以蔗糖含
量 140 g L-的更换培养效果最好 ，比对照增长
79．17％，但明显低于加液培养的，二者产胚量相差
1倍；用 170 g L- 高糖更换培养的没有胚状体产生；
用 1 10 g L-低糖更换培养的产胚量极显著低于对
照 (表 4)。
2．5 胚状体的发育及植株再生
甘青杂种的胚状体前期生长很快，当子叶胚转
绿后转到固体培养基培养，很多胚状体颜色慢慢变
表 4 添加与更换培养液对甘青杂种胚胎发生的影响
Table 4 Efects ofmedia with chan ged sucrose content on
embryogenesis in hybrids
同列数据后不同大写字母表示差异极显著 (P-O．O1)。
Diferent letters within a~olumn indicate significan t diferences
at P-0．01．A：Med ia with sucrose content chan ged aRer 3 days；
B：Mediain whichl10gL‘SUCrOSewasadded ater 3 days．
褐色，停止发育直至死亡；有的胚状体下胚轴延长
和加厚，两片子叶融合在一起生长出许多愈伤组
织，要经过 2—3次继代培养，才分化出许多小芽 (图
版 1：E)；有一部分胚状体直接分化出小芽，将小芽
转接到生根培养基，lO一15 d就能长出新根，形成完
整的植株 (图版 1：F)。本试验共培育出375个正常
的子叶胚，经继代培养，最后培育出 45株再生植
株，成苗率为 12％。
3结论和讨论
通过对甘蓝、青花菜杂种的游离小孢子培养，
能在较大基因范围内获得小孢子植株。本研究结果
表明，变种间杂种小孢子胚的诱导效果很大程度上
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第4期 陈文辉等：甘蓝和青花菜杂种小孢子培养 325
取决于两个亲本的胚胎发生能力。例如本试验中的
夏宝甘蓝和绿洲 808青花菜都有较强的胚胎发生
能力，因此它们的杂种也相应地有较高的出胚量
(表 1)；6个没有胚诱导能力的甘蓝亲本，有 3个
正反交杂种能诱导少量胚发生，3个正反交杂种都
不能诱导胚发生，说明基因型在小孢子培养中起了
重要作用，这与大白菜、青花菜的小孢子培养结果
一 样【s-．o-。因此，变种间杂种的小孢子培养应选择胚
胎发生能力强的材料作为杂交亲本。本研究显示，
正反交杂种的小孢子胚胎诱导率无明显差异，说明
变种间杂种胚胎发生能力是由核基因控制的 【n】，与
细胞质无关，这与周永明研究的细胞质在油菜种间
杂种的胚胎发生起作用的结果不同网。在同一青花
菜亲本的条件下，杂种小孢子胚胎发生能力与甘蓝
亲本的胚胎发生能力明显呈正相关，说明品种间控
制胚胎发生的核基因可能存在数量上差别，需要进
一 步研究。
试验表明，高糖培养 3 d后添加低糖培养液培
养，能大幅度提高出胚量，这主要是培养基中高浓
度蔗糖作为渗透稳定剂在培养初期能维持小孢子
活力。培养3 d后添加低糖培养液，主要作用是稀释
高浓度蔗糖对细胞团的抑制作用和培养过程中非
胚性细胞死亡释放出的毒性物质【埘，并补充营养物
质，改善了小孢子发生与发育的培养条件。
甘蓝与青花菜是亲缘关系较近的变种，但二者
在植物学性状上有很大差异，研究变种间杂种小孢
子培养与利用，为种质资源的创新提供捷径。通过
对甘青杂种小孢子再生植株的选育可以获得许多
不同于双亲类型的单双倍体纯系，这个方法比利用
杂交、回交和连续自交分离筛选的过程要快得多。
所获得新的稳定的变异类型对芸苔属近缘变种间
的进化、遗传学乃至育种研究都具有潜在的利用
价值。
影响小孢子胚胎发生的因素较多。本试验得
出，在盛花期取单核靠边期至双核期的小孢子，经
34℃热处理 48 h，初始培养用 170 g L 高浓度蔗糖
的培养液，3 d后添加低浓度的培养液，胚诱导率可
达 70％，最高的每蕾可诱导胚 16．2个，成苗率是
12％。与芸苔属其它蔬菜小孢子培养结果相比，出胚
率是相当高的，但成苗率却比较低，胚培养的条件
还需进一步优化。
致谢 本研究得到国家蔬菜工程技术研究中心刘凡研究
员的悉心指导，特此致谢。
参考文献
【l】 Liehter R．Induction of haploid plants from isolated polen of
Brassica rl,dpo,$【J】_z Pflanzenphysiol，1982，105：427-434．
【2】Yang L M(杨丽梅)，Fang z Y(方智远)’Liu Y M(刘玉梅)．Appli．
cations ofmicrospo re culture technology in inbred line ofcabbage
【J】_China Veget(~国蔬菜)，2003，(6)：3 1-32．(in Chinese)
【3】 Zhang D S(张德双)，Cao M Q(曹鸣庆)，Qin z W(秦智伟)．
Embryogenesis and plant regeneration of broccoli via isolated
microspore culture【J】．Acta Agri Boreal Sin(华北农学报)，1998，
l3(3)：102-106．(in Chinese)
【4】 Zhang L(张丽)．Primary smdi~on the isolated microspore culture
in radish【J】_Aeta Holt Sin(园艺学报)，2004，31(5)：676—678．(in
Chinese)
【5】 Lu G(卢钢)，Cao J s(曹家树)．Study on microspore culture ofthe
hybridsbetweenChinese cabbageandturnip【J】_J ZhejiangUniv
(浙江大学学报)，2001，27(2)：161—164．(in Chinese)
【6】 ZhouY M(周永 明)，SearthR．Microspore culture ofhybrids
betweenBrassica呷 and最 carapestris【J】_ActaBot Sin(植物
学报)，1995，37(1 1)：848—855．(in Chinese)
【7】 Fang SG(方淑桂)ChenW H(陈文辉)，ZengX L(曾小玲)．
Several factors afecting isolated microspore culture in broc co li
【J】_J F~ian Agri ForUniv(Nat Sei)(福建农林大学学报 自然科
学版)，2005，34(1)：51—55．(in Chinese)
【8】Tang Q L(汤青林)，Song M(宋明)’Zhang z L(张钟灵)．Advances
in studies on isolated microspore in cole crops【J】_Southwest
Chin J Agfi Sei(西南农业学报)，2000,13(3)：98-103．(in Chinese)
【9】 Lju G s(刘公社)，Lj Y(李岩)Liu F(Rtl凡)．Efects ofhigh temper．
atureonthe culturesofisolatedmierosporesinBrassica c~ ．pestris
ssp．pekinensis【J】_Acta Bot Sin(植物学报)，1995，37(2)：140—146．
(in Chinese)
【10】Cao M Q(曹鸣庆)，Lin F(刘凡)．Progress in isolated microspore
culture in Brasicavegetable crops【J】_Ann Rev Holt Sci(园艺学
年评)，1996，2：63-90．(in Chinese)
【ll】 Cloutier S，Cappadocia M，tanc~ry B S．Study ofmicmspo~
culture responsivenes in oilseed rape(Brassica呷 L．)by
comparative RFLP mapping of a F2 population an d two
microspore-derived populations【J】_Thenr Appl Genet，1995，91：
841-847．
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