全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
核 农 学 报 , 一
亡 , 八 止
诱变与组织培养相结合诱发
水稻耐盐突变的初步研究
田少华 梁竹青 高明尉 项友斌
浙江农业大学核农所 杭州
以 个水 摘品种 的成熟种子作 为外植体 , 用 丫射 线
、
叠氮化钠 施行单项
或 复合诱 变处理后 进行组 织培养 , 出愈后 的部分愈伤组 织 再用 丫射线辐照 处理 , 并
在含 的筛选培养基上进行耐盐突 变的 筛选
。 结果表明 , 射 线对
·
出愈 率
和生长率均有严重 的抑制作用 , 而 单独 处理对 出愈率 和生长率则有促进作
用 , 所有诱 变处理都降低 了植株分化须率 , 愈伤组 织 的生长速率和植株再生率虽随
筛选培养基中 含量 的提高而 下降 , 但 作为衬盐突 变体的 筛选压较 为适
宜 。 诱 变处理的种子愈伤组 织 再以 适 当剂量 的 射 线辐照 , 有提 高诱发计盐 突 变频
率的作 用 。 适宜的照针量 为 一
。
与几卫写盯
﹃
卜必肠
关铭词 水稻 诱 变齐 愈伤组织 付盐 突 变
前 份梦口
水稻是对盐溃敏感的作物之一
。 国内外通过组织培养 , 并在一定的选择压下筛选耐盐突
变体 , 以诱导耐盐突变株 , 取得了阶段性的成果 〔‘ 一 〕
。 田 文忠等 用未经诱变 处 理
和 诱变处理的水稻花药愈伤组织 , 接种在 一 的 。分化培养基上 , 实行一步
选择法直接从 和 的培养基上筛选出耐盐的绿苗 〔‘ ’。 大野等 用水稻
种子诱导出愈 , 再在含 的培养基上进行筛选培养 , 以较高频率获得了 再 生 突 变
株 〔“ ’
。 山 田 等 则在愈伤组织诱导培养基叶,加入海水
,
并将形成的愈伤组织再 在 相
同海水含量的培养基上继代培养四次
, 由此筛选出的愈伤组织分化出了耐盐 的 植株 〔艺
。 习
际水稻研究所从 台巾 选出耐盐的突变细胞 , 井再生成了植株 , 了印 培养液中 , 这
些突变株存活率大大高于原品种 〔 ’。 但是
, 迄今为止 , 由人工诱发的耐盐突变频率还很低 ,
是否所有水稻品种都能诱导出耐盐突变体 , 以及耐盐突变休后代的耐盐性是 否稳定等 , 都有
待进一步研究
本试验 目的是采用组织培养和外植体理化诱变处理
, 以 及与离体筛选相结合的方法 , 研
究诱发与筛选水稻耐盐突变体的效果 。
此文于 年 月 日收到 。
本试验得到夏英武教授的大力支持和蔡其华同志的帮助 , 谨致谢意 ,
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卷核 农 学 报
材 料 和 方 法
供试材料 高耐盐品种 “ ” 和不耐盐中釉品种 ,’ ” 以 及南方杂交 稻的保
持系 “ 珍汕 ” 和优质早釉品种 “ 红突 ” 的成熟种子 。
诱变处理 所有供试品种用出糙机脱壳后 , 分别采用 种诱变处理 。 。“ 射线 辐 照
以 表示 , 照射量为 , 照射剂量率为 用 的磷酸缓冲
液稀释 , 以 表示 , 在 ℃的恒温水浴中处理 小时 , 后用流水冲洗 小时 复合处
理 。 先用“ 。 丫射线辐照 照射量为 , 照射量率
, 以 表 示 , 然 后
再用与处理 相同的方法处理种子
。 以不作任何处理的脱壳种子为对照
。
培养基 本试验采用的培养基共 种 , 诱导培养基 。 其大量元素与微 量 元 素与 。培
养基 相 同 , 外加 , 一 , 和 一 , 蔗 糖 , 琼 脂
值在高压灭菌前调至 。 筛选培养基 。 在诱导培养基中分别加 入 , ,
和 。 分化培养基 。 基本成分同于诱导培养基 , 但不加 , 一 , 另
加 。
接种培养 将经过各种诱变处理的水稻种子与对照种子用 的酒精表面消毒 分钟后
,
用 写的升汞溶液浸溃灭菌 分钟 , 再用无菌蒸馏水冲洗 次以上 。 然后接种到诱导培养基
上 , 何试管接种 粒种子 , 在 ℃士 ℃的培养室 中诱导出愈
, 并记载出愈速度 , 周后统计
出愈率 。 继代培养时先仔细剔除残留的外植体 , 然后把愈伤组织转到新配制的培养基上 , 侮
管接种 块愈伤组织 , 并称鲜重
。
周后 继代培养结束 , 称愈伤组织鲜重 。 在转到筛选培养基
上 以前 , 取 “ ” 和 “ 珍汕 ” 两品种 的 愈 伤 组织 , 再进行辐照处理 , 照 射 量 分 别
为
、 、 、 和 , 照射量率 , 然 舌再把各处理的愈伤组织转到含不
同 浓 度 的 筛 选培 养 基上 。 转培 时 把愈伤组织挤碎 , 平
一
铺在培养基表面
, 置 士 ℃
条件下培养 , 光照 小时 天 , 照度
。 周后把第一次筛选后的愈伤组织转到含有同
等浓度的 新鲜培养基 上继续筛选一次 。 其中详细观察各愈伤组织的各期生长 情 况 , 记
载并称量愈伤组织鲜重 。 考虑到继代次数的增加 , 会降低植株再生能力 , 故在经 两 次
筛选后 , 即把愈伤组织 除明显丧失活力的 以外 均转到分化培养基 培养 湃生植株 , 培养
条件同前 。
再生苗移栽管理及后代耐盐性初步鉴定
当再生苗
一
长至 以上时 , 移至盆钵中生长 , 并用含 的自来水隔 「浇
一 次 , 保持 左右的水层 , 直至收获 , 其它栽培管理措施与常规相同
。
代植株按穗收获 , 代按穗播种 , 在移栽时 秧龄 天 进行耐盐鉴定 。 集 定以水
培和盆钵土培结合 。 水培采用 培养液加 , 水层保持 高 , 天换一次培
养液 盆钵鉴定取大田 水 稻 土 , 加 , 电导率 一 相 当 于 含 量 一
, 用 自来水保持盆钵 内水层 。 以 和 为耐盐对照品种 , 以原亲
本 为感盐对照
。 移栽后 天
、
天观察水培各植株生
一
长情况和绿叶数 , 成熟时考察结实
率 。
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诱变与组织培养相结合诱发水稻耐盐突变的初步研究
结 果 和 分 析
一 汤变处理对水稻种子出愈率的形晌
本研究的 个参试品 种的种子都能形成愈伤组织 平均出愈率为 一
表一
,
但品种间存在显著差异 , 以 最低 , 红突 最高
。
表 不同诱变处理对水稻种子出愈率 的影晌
公
辐照 ,
对照 心
品种
一
,
飞
吕
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一
畔
,
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辐照
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接种数 出愈数
一
出愈率 出愈率
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红突
。
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珍汕
”
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‘ 一 ⋯
,
一 。
· ‘
一
不同的诱变处理对出愈率也有较大的影响 , 辐照 极显著地降低了水稻 种子 的出愈
率 , 各品种间表现出一致的趋势 , 而 的 对水稻种子最终出愈率 不 但 没
有抑制作用 , 反而有刺激出愈的作用 , 出愈率均高于对照 丫 辐照和 复合处 理 后 , 虽使
各品种的出愈率降低 , 但却高于 辐照单独处理的出愈率 该结果表明 , 对水 稻 种子的
出愈率具有一定的促进作用
,
而 丫 辐射则有明显抑制作用 , 从 复合处理的结 果看出 ,
丫射线的抑制作用 明显大于 的促进作用
, 因此复合处理也使出愈率显著降低 。
二 诱变处理对水稻愈伤组织生长的影晌
对水稻种子进行诱变处理后作为外植体进行培养 , 不但对出愈率有影响 , 而且对愈伤组
织的生长率 、 形态特征等均有影响 。
从各品种对 种诱变处理的平均效应来看 , 和 处理都延迟了出愈始 期 但 与
对照相 比 , 处理却使出愈始期略有提早 最初 周 内比其它处理出愈率高 , 但 随后 却急剧
下降 , 已形成的愈伤组织也逐渐变褐死亡 , 最终出愈率反而最低 。 和 十 处 理的愈伤
组织形成虽迟 , 但生长正常 , 增重快 表 以 个品种的 日增鲜重平均效应 来 看 , 单
独处理的愈伤组织平均日增鲜重最高达 , 。 克
, 为对照 日增鲜重的 , 而 和 十
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“ 核 农 学 报 卷
表 诱变处理对水稻愈伤组织生长 鲜重 影响
、
品 种 项 日 对 照 辐照
接种愈伤组织重
盯
⋯蘸蕊雇姗然于
’
一正刃一硫一
周后愈伤组织重
日增重 一 一﹃占对照 日增重 一 生 。 。
接种愈伤组织 重
士
周后愈伤组织重 。
日增重
喻占对照 日增重
接种愈伤组织重
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二 、 一 、 ‘ 口 一 白
红突
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周后愈伤组织重
日增重
一
占对照 日增重 。
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珍汕
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处理的 日增鲜重量均低于对照 , 分别为对照 日增量的 和 表 。 各 从因
型对诱变处理的反应也有一定的差异 。 如 用 丫 辐照后 , 其愈伤组织鲜重在 继代过程
中不但没有增殖 , 反而比初始接种时还低 , 以后逐渐变褐死亡
, 而其它品种则都略有增殖
从各诱变处理方式来看 , 以愈伤组织 日增鲜重为指标
,
各处理之间存 在 着 极 显 著 的 差 异 ‘
。, 。 愈伤组织鲜重日增量大小依次为 对照 。 基因型之间日增
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期 诱变与组织培养相结合诱发水稻耐盐突变的初步研究
量大小依次为 珍汕 红突 。
三 对水稻愈伤组织生长的形晌
将诱导和转培一次以后 的水稻种子愈伤组织转到含 的筛选培养基上 , 进 行 耐盐系
的筛选 。 追踪观察记载两次连续筛选以后 的愈伤组织生长速率
, 结果见表
。
表 浓度 对水稻种子愈伤组织生长速率的形晌
含量 , 肠
”· “ ”· ” ’,
一
·
品 种 项 目
生长速率 。
。
。
为对照生长速率
肠
。
生长速率 。
为对照生长速率
肠
。 。 。
⋯
一厂卜闪旧
红突 生长速率
。
为对照生长速率
肠
。 。 。 。
珍汕 生长速率
。
。
卜以一七
平均生长速率
占对照生长速率
·
,
典禁瓮禁李。
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⋯ 一 · · ,
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一 一 赢
一 一 石福丁厂 。 。 。
· 生长速率在第二次选择培养结束时记载 , 参照 等方法进行
一 三
一。 之
愈伤组织生长速率随着培养基 中 浓度的增加而下降 , 各品种 表 现 匕 势
一 致 , 在
浓度达到 时 , 个品种愈伤组织的生长速率平均仅为对照的 ‘ 。左右 。 但品
种之间下降幅度不等 , 以 “ “ 的愈伤组织生长速率下降最小 , 下降 ’险文从大 , 夕
时仅为 , 相 当于对照的 ‘八 。左右 由此可见 , 水稻种子愈伤组织的耐盐 性 与品种
本身的耐盐性有关 , 如 属高耐盐品种 , 由此产生的愈伤组织对 的耐 受 性 也 较
强 , 而不耐盐品种 则恰恰相反
四 诱变及 筛选对植株再生的影晌
将 次浓度相同的 筛选培养基上生长的愈伤组织转到分化培养基上 , 大多数愈伤组
织不是变褐死亡 , 就是只分化出根状物 , 而不出现幼苗 , 值株的再生频率显著低于不经任何
处理的对照 。 见表
一 。 各诱变处理之间以 辐射的植株频率最 低 , 仅为 ,
说明 的 辐射严重 地降低了植株再生率 而 和 两处理的植株再 生 率 差异不
, 大 , 但却略低于对照
。
试验结果看出
,
种子诱变处理后 , 均降低了愈伤组织再生植株频率
频率的影响 表 现 为 随 盐 浓 度 含量 的 升 高 而 下 降 , 在 含量 达 到 以
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了 妞 表 学 报
衰 不同诱变处理和 浓度对水稻愈伤组织再生级率 的形晌
能数一了
一再生频率
乙绿苗数
含量
。 。
再生频率肠绿苗数接愈数再生频率肠再生频率肠
诱变处理
”
总绿苗数
接 绿
愈 苗
数 数
接 绿
愈 苗
数 数
一
平均再生
频率
一
对照 。 。 。
辐 照
一
。 。
岛
。 。 。
辐照
口 一
合 计
。
、‘,万盈一、
。
表中数字为 个品种合计资料 植株再生频率 呱 出苗愈伤组织块数 总愈伤组织块数
一
,
,
表 种子及愈伤组织诱变处理对耐盐愈伤组织的诱变效应
一
一
种子诱变处理 一 乙
辐
愈伤组织
辐照处理照
射量
”
对照
辐照 一 照
一
愈伤组织块 ⋯正常生长百
数 分率
愈伤组织块
数
正常生长百分
率
愈伤绿织块数 正瞥舒 ”画黔块 ”正常生长百分率
。
。
。
。
。
甘
了
飞 。
。 。
。 。
筛选培养基 含盈 肠 , 品种为 和珍汕 表中数字为经 次筛选所得 的结果
一 主 。。 ‘ 。。 。怜 , 、
耽 。
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期 诱变与组织培养相结合诱发水稻耐盐突变的初步研究 粗
上时 , 下降幅度更大
,
到 含量时 , 很少有绿苗形成 整个试验只获得了 株苗 。 从筛选
的角度考虑 , 以及为了得到一定数量的再生苗以供育种应用 , 可以认为 的 浓度较
适宜 。
五 种子诱变处理和愈伤组织 丫辐照对耐盐愈伤组织的诱变作用
为了提高耐盐突变体的诱变效率
,
在对种子进行诱变处理的基础上 , 再 对 品 种 和
珍汕 的愈伤组织进行辐照处理 , 处理后把愈伤组织置于高浓度盐分 为 ,
的筛选培养基上 , 筛选耐盐性强的愈伤组织 , 结果见表 。 结果表明 , 在种子作 为 外植体进
行诱变处理的基础上
, 辅以适 当剂量的 丫射线辐照 , 具有提高耐盐愈伤组织突变率的作用
愈伤组织辐射处理的适宜剂量范围以 一 为宜
六 再生苗后代附盐性初步鉴定
本试验所获得的再生苗 , 全部移入温室盆钵中 , 并以 含量 的自来 水层保
持至成熟 。 其中大部分苗在苗期死亡 , 少数在成株期表现出盐害 , 生长停滞 , 全株不育 高
耐盐品种 再生出的植株都能正常结实 , 盐害不 明显 。 最后只从感盐 品种 得 到了
株 代种子 , 而且均是从 处理与愈伤组织 辐照的复合处理中 , 在 。 浓度下
经 次筛选后再生的植株 。 从这两株 代植株共收得 个穗 , 继续按穗系在盐分协迫下进 行耐
性鉴定 。
水培试验表明 , 所有处理植株 对照和突变株 在处理 天后 , 下部叶片都 有 干 枯 现
象 处理 天后 , 和 个 突变穗系植株全部 死 亡 , 只 有一 个穗系 一 一 的部
分植株上部还有 片绿叶 , 耐盐对照 和 仍有 片绿叶 , 但表现生长势弱 盆钵土
培也得到相同的结果 , 只有 广 一 株系最后有少数植株能生存 , 但有效穗 很 低 结实率只
有 耐盐对照品种只表现结实率 比未受 处理的稍低 。 由 和 代植株耐盐性初
步鉴定可见 , 愈伤组织的耐盐性与植株的耐盐性间有一定关系 , 但也还存在着一定距离 。
讨 论
从本试验结果看 以水稻种子作为外植体进行物理和化学诱变处理 , 并结 台组织培养和
离体筛选的方法 , 可以提高水稻耐盐突变的诱导率 。 主要的技术关键在于选择适瓦 的诱变处
理剂量和恰 当的选择压 。
在愈伤组织筛选培养过程中 , 愈伤组织的生长速率随培养基中 浓度的增高而下降 ,
从本试验结果 , 以及考虑到育种应用的实际 , 认为筛选培养基中 含量以 较适宜 。
在种子诱变处理的基础上 , 对其诱导产生的愈伤组织再进行适当剂量的 射线辐照 , 有提 高
耐盐突变频率的趋势 , 适宜的照射量为 一
。
本试验对 个感盐品种进行诱变处理并结合组织培养和离体筛选的方法筛选耐盐突变体 ,
最后只从 中得到 株 代植株 , 似乎基因型 间有差异 , 但是否与 种子处理及 辐 照愈
伤组织有交互作用 , 有待深入研究 。 由离体筛选出的再生 苗 , 苗期有一定程度的耐盐性 , 但
落 多数却在成株期丧失 , 表现全株不育 所得 株 , 代植株经 代耐盐鉴定 只有一个穗系有
一定程度的耐盐性 。 , 代和 以后世代能否保持耐盐性 , 耐盐性是否随世代增高而 丧 失 , 还
有待进一步研究
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口公 。 而
, 一
参考文献
〔 〕
〔 〕
〔 〕
〔 〕
〔 〕
〔 〕
〔 〕
〔 〕
田文忠等 《 中国科学院遗传所研究工作年报 》 , , 一丫
。
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, , , , 了一
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大野清春等 育种学杂志 , , 生 一
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