全 文 ：核 农 学 报 ,
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氖标记蜜环菌的研究
兰 进 徐锦堂
中国医学科学院药用植物资源开发研究所 北京 。。。
李京淑
中国农业科学院原子能利用研究所 北京
对蜜环 菌进行氖标记 、 放射性浏 童和放射 自显影结果显示 , 一标记物分布于 菌
体的各个部位 , 在培养墓 中加入 一 蔺萄糖标记蜜环 菌的方法是可 行的 。
关键词 蜜环 菌 氖标记 放射 自显影
前
‘
言
蜜环菌 属担子菌纲 , 白蘑科 , 蜜环菌属 , 是一种广泛分布的真菌 ,
是天麻生长发育过程中营养来源的主要供给者 。 应用光学显微镜和电子显微镜研究天麻与蜜
环菌的关系已有许多报道 , 但多限于双方相互作用的形态和解剖特征 , 对作用双方物质交换尚
缺乏深入的研究 。 为此 , 我们应用 ’ 一葡萄糖配制培养基标记蜜环菌 , 通过显微放射 自显影观
。
察 , 分析 , 一标记物在蜜环菌中的分布与积累 , 为进一步研究天麻与蜜环菌的营养关系提供新
的研究手段 。
材 料 与 方 法
佩标记化合物 一葡萄糖 〔 一 〕, 由中国科学院上海核技术开发公司提供 , 比活度
。
菌种标记培养 标记蜜环菌 配制 培养基阁 , , 高压灭菌后 , 在超净工
作台上 , 将培养基分装试管中 , 每管 。 ℃放置 , 无菌条件下熔化后 , 加入 一葡萄糖 , 分
别为 即 和 拜 , 摇匀 。 用 ‘ ℃。下射线辐照灭菌 。 ℃再放置 , 确认无杂菌污染 。
在无菌条件下 , 用接种铲将蜜环菌菌种接入试管中 , ℃条件下培养 , 后转接入树枝培养
基 。
接种树枝培养基 将 粗青杠树枝切成 长 , 上砍鱼鳞 口 , 放入克氏瓶 中 ,
每瓶 根 , 再放 海棉一块 , 保湿 , 加水 , 高压灭菌后 , 在无菌条件下 , 接
入 一标记的蜜环菌 , 在 ℃条件下培养 后取样 。
样品预处理 切取树枝培养的蜜环菌菌索 , 用流水反复冲洗 , 用 浸洗 , 再
此文于 年 月 。日收到
核 农 学 报 卷
用流水冲洗 。
放射性活度测 分别取 种荆量标记的菌索 , 约 长 , 加到有二氧六环助闪剂的闪
烁瓶中 , 用 型液体闪烁仪进行悬浮法相对测量 。
光镜 、 电镜样品制备 电镜样品制备 切取数条菌索 , 长 左右 ‘ 一葡萄糖 比活度
拌 , 用 。 磷酸缓冲液配制的 戊二醛液固定 , 在 ℃条件下固定 , 用
同样缓冲液冲洗 次 , 每次 , 用 起的系列浓度酒精脱水 , 在每种浓度中脱水 ,
丙酮过渡 。 最后用 树脂包埋 , 聚合 , 聚合温度 ℃一 ℃一 ℃ 。 包埋块用
型超薄切片机切片 , 切片厚度为 左右 。
光镜样品制备 切取 拜 一葡萄糖标记的蜜环菌菌索 , 长 左右 , 固定
, 常规石蜡切片 , 切片厚度 拜 将切片小心地平展于充分洗净的载片上 , 将载片放入
二甲苯溶液中脱蜡 , 再将脱蜡后的载片经过梯度浓度酒精 由高浓度至低浓度 水化 。
放射 自显影 电镜放射自显影 先将载有样品的铜网小心地用透明胶条沿铜 网边粘贴在
小玻璃棒顶端 , 样品面向上 。 在暗室红灯下 , 取定量国产 ‘乳胶置于经无离子水冲洗过的
小烧杯中 , 用无离子水按 一 比例稀释 , 并加水杨酸钠溶液 无离子水配制 稀释至
乳胶液中水杨酸钠浓度为 , 作为增感剂 。 在 ℃恒温水浴中熔化 , 缓慢搅拌 , 后 ,
置于冰浴中 。 取 出 , 在 ℃条件下 , 静置 。 于乳胶徐布箱中 , 采用金属环法 , 把液体
乳胶轻轻拉成均匀薄膜 , 套在置于玻璃棒顶端的铜网上 , 黑暗中晾干 , 放到备有干燥剂的暗盒
内 , ℃以下曝光 。 从乳胶配制到乳胶涂布的整个操作过程 , 均在暗室的安全红灯下进行 ,
严格防止乳胶意外曝光 〔” 。
光镜放射 自显影的制备 取定量国产核一 乳胶 , 置于用无离子水冲洗过的小烧杯中 , 按 比
例加入水杨酸钠溶液增感 , 在 ℃恒温水浴中搅拌 , 静置片刻 。 在恒温恒湿的乳胶涂布
箱中 , 用涂布法加核乳胶膜 , 黑暗中晾干 , 置切片于暗盒中 , 加硅胶千燥剂 , 密封 , 置 ℃冰箱中
曝光 〔 , 。
显影 、 定影 电镜 、 光镜切片曝光完毕后 , 在暗室安全红灯下 , 用 一 显影液 ℃ 显影
, 水洗 , 用 一 定影液 ℃ 定影 , 再用流水冲洗 。
显影后的电镜切片用醋酸双氧铀 一柠檬酸铅双染色 , 供电镜观察 。 显影后的光镜切片 , 用番
红一 固绿二重染色 , 加拿大树胶封片 。
结 果 与 分 析
一 ’ 一 葡萄糖标记蜜环菌
不同比活度 , 一葡萄糖 如 及 。即 标记的蜜环菌菌索 , 取约 长测量 , 结
果分别为 和 , 可见蜜环菌能从培养基中吸收 一葡萄糖 , 从而使蜜环菌被标记 , 标
记菌索的放射性活度与所用标记物的比活度呈正相关性 。 实验中采用 比活度 拜 一葡
萄糖标记的蜜环菌伴栽天麻 , 蜜环菌侵染天麻后 , 光镜和 电镜放射 自显影结果显示 , 能清晰观
察到标记物在天麻体中的分布 试验结果另文发表 。 实验证明 , 在含 ’ 一葡萄糖的培养基中培
养蜜环菌 , 可得到 ’ 标记的蜜环菌 , 一葡萄糖的比活度以 拌 为宜 。
二 一标记物在蜜环菌菌索中的分布
期 氛标记蜜环菌的研究
显微放射 自显影结果表明 , 在菌索的皮层 、髓部均有 一标记物的踪迹 图版 一 , 特别在
髓部的疏松菌丝中布满银粒 图版 一 , 。 在由数层排列较紧密的似植物外皮层的菌索鞘细
胞中 , 银粒较少 图版 一 部分 , 可能 由于多数已木质化的菌索鞘细胞把原先积累的同化
物以及细胞的内含物转给了生活力旺盛的疏松菌丝 。 电镜放射 自显影观察 , 可见在菌丝细胞中
的线粒体 、 内质网等细胞器上均有银粒分布 图版 卜 , , , , 说明标记物 已参与了蜜环菌的
生物代谢过程 , ’ 标记物 已被带到菌体的各个部位
。
习 几长 皿
“,
图版 说明
一标记物在蜜环菌菌索 中的分布 疏松菌丝 , 菌丝皮层 , 菌索鞘 。
图 的放大 。
疏松菌丝 的放大 。
疏松菌丝细胞的电镜放射 自显影 标记物在厚壁细胞 和薄壁细胞 中 。
皮层菌丝细胞的电镜放射 自显影 菌丝细胞核 , 线粒体 , 液泡 。
’ 标记物在薄壁细胞 和细胞壁 中的分布 。
’ 一标记物在疏松菌丝中的分布 内质网 、线粒体 、液泡 。
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参 考 文 献
刘鼎新 放射 自显影技术 北京 科学 出版社 ,
李京淑等 植物显微 自显影及双标记彩色自显影技术的应用研究 植物学通报 , ,
杨云鹏等 中国药用真菌 哈尔滨 黑龙江科技出版社 , ,
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