全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，14(1)：25—30
Journal ofTropical and Subtropical Bot~my
大花蕙兰基因组DNA提取及 RAPD反应条件探索
李冬梅 ，一， 朱根发 ，叶庆生
(1．华南师范人学生命科学学院，广尔省植物发育牛物上程雨点实验审，J 州 510631；2．广东省农业科学院花卉研究所， 州510640)
摘要：用SDS、CTAB和改良CTAB法分别提取大花蕙兰叶片基因组DNA，发现以改良CTAB法提取的DNA纯度
高，产牢也较高。以5’．GGTGCTCCGT．3’(BA440)为随机引物，并以人花蕙兰品种 ‘金杯’(Cymbidium hybridiurn
CV．Hiroshima Golden Cup“Sunny Moon”)的DNA为模板，对 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)反应体
系进行了优化研究，结果表明，25 l反 体系r}-，Mg 、 DNA聚合酶、引物、模板DNA和dNTP 5种主要成分的适
宜浓度或用量分别是：2．0mmoUL、1．0U、0．20ixmol／L、25 ng和 O，20mmol／L。扩增程序优化为：94~C预变性 4min；94~C
变性 0．5 rain，37 C退火 l rain，72℃延伸 l min，40个循环；最后 72℃延伸 7 min
关键词：人化蕙兰：举因组 DNA提取：CTAB；RAPD
中图分类号：Q523 文献标识码：A 文窜编号：1005—3395(2006)0l一0025—06
Genomic DNA Extraction and RAPD
Protocols for Cymbidium hybridium
LI Dong—mei 1,2 ZHU Gen—fa 。 YE Qing—sheng’
(1，Colege of Life Science，South Nornud University,Guangdong Key Lab of Biotechnologyfor Plant Development，Guangzhou
510631，China；2．Floricuhural ResearchInstitute，GumtgdongAcademy ofAgricuhural Science，Guangzhou 510640，China)
Abstract： SDS， CTAB and modified CTAB methods were used to extract DNA from the leaves of Cymbidium
hyb ridium CV，Hiroshima Golden Cup “Sunny Moon”and CV．Fortissimo “Pianist”．The results showed that
modified CTAB method was best for DNA quality and production．The optimal reaction of RAPD in e hybr Mm
was studied with primer 5’一GGTGCTCCGT-3’for CV．Hiroshima Golden Cup “Sunny Moon”．The optimum
concentration of five important components such as M ， DNA polymerase， primer
， template DNA， and
dNTP in 25 Ixl RAPD reaction system were 2．0 mmol／L， 1．0 U， 0．2O Ixmol／L， 25 ng
， and 0．20 mm ol／L。
respectively．Modified thermal profile consisted of al initial denaturation step at 94℃ f0r 4 min． followed bv 40
cycles of 94℃ for 30 S， 37℃ for l rain and 72℃ for l min and a final exposure to 72℃ f0r 7 min．
Key words：Cymbidium hybridium；Genomic DNA extraction；CTAB：RAPD
随着 RAPD技术的迅速发展l_，其存化l卉的种
质资源遗传多样性和育种研究中被』 泛应用[2-17]。大
花蕙兰(Cymbidium hybridium)~称虎头兰、蝉兰，为
兰科 (Orchidaceae)兰属多年生常绿草本植物。其
品种众多，花瓣大，色彩艳丽Ⅱ花色多，花期较长，
可盆栽或用作鲜切花，具有很高的观赏价值和经济
开发前景。目前我国的人花蕙兰品种主要靠进口，
而系统的育种研究刚开展不久，因而大花蕙兰产业
的发展较慢。大花蕙兰RAPD标记技术研究的开
展，将对我国火花蕙兰种质资源的保存 利用及其
良种的选育与推广提供理论与技术支持，对火花蕙
兰产业的长期发展也有重要的作用。
收稿 Et期：2005—08—08 接受Et期：2005—1卜21
基金项 目：广东省科技攻关厦人专项 (2003A201040)；J’州市农、Ik局招标项目(GK0302105)资助
通讯作者 Coresponding author
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26 热带亚热带植物学报 第 14卷
成功提取基因组 DNA是"RAPD扩增的关键，
据报道花卉植物 RAPD—PCR常用的 DNA提取方
法有CTAB法、酚／氯仿法和 SDS法等 10,14]，但
有关兰属大花蕙兰的研究报道很少 · 】。本文探
讨适宜的大花蕙兰基因组 DNA提取方法和大花蕙
兰 RAPD优化体系， 为大花蕙兰种质资源评价及
育种的研究奠定基础。
1材料和方法
1．1材料和试剂
材料 在广东省农业科学院花卉研究所兰
圃中采集大花蕙兰 ‘金杯’(Cymbidium hybridium
CV．Hiroshima Golden Cup“Sunny Moon”)和 ‘钢
琴家 (CV．Fortissimo“Pianist”)的幼嫩叶片，用塑
料袋封装，然后装入冰盒保鲜，带回实验室后用灭
菌双蒸水洗涤除去尘渣等杂物，室温晾干后保存于
一 80℃冰箱备用。
试剂 Tris碱、HC1(盐酸)、CTAB(十六烷
基三甲基溴化胺)、EDTA(乙二胺四乙酸二钠 )、
NaC1(氯化钠)、Boric Acid(硼酸)、B一巯摹乙醇、
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、Tris饱和酚、氯仿、异丙
醇、无水乙醇、SDS(十二烷基硫酸钠)、NaAc(醋酸
钠)、KAc(醋酸钾)等试剂为国产分析纯；dNTPs、
琼脂糖、kDNA／EcoR I+Hind m Marker、RNaseA购
自北京鼎国生物技术有限公司； DNA聚合酶、
10~Reaction Bufer和 MgC12购 自TaKaRa生物公
司：引物购自上海博业公司。
1．2 基因组DNA提取和检测
SDS法 参照戴思兰等 】的方法。
CTAB法 参照 《精编分子生物学实验指
南》[ 9]的方法。
改良CTAB法 从一80℃冰箱中取出冰冻的
0．5 g叶片加液氮研磨成粉末，迅速转入 l0 ml离心
管，加入 3 ml 65℃预热 的 CTAB提 取缓 冲液
(1 00 mmoFL Tris-HC1，pH 8．0； 1．4 mol／L NaC1；
20 mmol／L EDTA．pH 8．0：2％CTAB；2％6．巯基乙
醇，现用现加)和0．1 gPVP，充分混匀后，65℃水浴
保温 3Omin。冷却至室温，加入 1／8体积的Tris饱
和酚，65℃水浴 15 min，4℃ 14 500xg离心 15 min，
取上清液加入等体积的氯仿，缓慢颠倒混匀，65℃
水浴 15 min后在 4℃下 14 500xg离心 15 min。取
上清液加入 0．7倍体积的一20℃预冷的异丙醇，混匀
后，于一20~C静置 30 rain以上。取出于4℃12 000xg
离心 10 min，所得沉淀用 70％乙醇和无水乙醇各洗
两次，转移至 1．5 ml离心管，室温风干。风干后溶入
600 tzl高盐 TE溶液 (10 mmol／L Tris—HC1，pH 8．0：
1．0 mol／L NaC1；0．1 mmol／L EDTA，pH 8．0)，用等体
积的酚 ／氯仿、氯仿各抽提 1次，离心，取上清液，加
入 1／10体积的 3 mol／L NaAc(pH 5．2)混匀，再加
入 0．7倍体积的一20℃异丙醇沉淀 1 h以上，离心，
弃上清液，收集沉淀。所得沉淀用70％乙醇和无水
乙醇各洗两次，自然风T后溶于 100 l TE缓冲液
(1 0 mmol／L Tris—HC1，pH 8．0；1 mmol／L EDTA，pH
8．0)中，充分溶解后，加入 1 l RNaseA，37℃水浴
1 h。分装成小体积，4 0C或一20℃保存备用。
DNA检测 在核酸蛋 白测定仪(Eppendorf
Biophotometer)上测定 A260、A2舳、A260／A280和 DNA溶
液的浓度 (每个样品取 3次的平均值)。然后取
DNA样品液存 0．8％琼脂糖凝胶 (含 0．5 g ml。溴
化 锭 )上用 0．5~TBE缓冲液(45 mmol／L Tris；
45 mmoUL Boric Acid；1 mmol／L EDTA，pH 8．0)以
5 V cm 的恒压电泳 30 min，在 SYNGENE凝胶成
像系统中拍照并记录。
1．3 RAPD反应体系的初步优化
RAPD主要成分用量的优化 参照文献
[201的方法，RAPD—PCR反应体系的 5种主要成分
Mg2+、 DNA聚合酶、引物、模板 DNA和 dNTP的
用量设置 7个浓度梯度 (见表 1)。以BA440为随
机引物 (5’一GGTGCTCCGT一3’)，以大花蕙兰 ‘金
杯’基因组 DNA为模板进行 RAPD反应体系的单
因素优化实验。当进行某一因素水 f￡实验时，其他
因素均固定在第 3个浓度梯度。所有反应体系均为
25 Ll，均 加 1~Reaction Bufer。DNA 扩 增 在
PTC一100型热循环仪 (MJ Research公司生产)上进
行，基本扩增程序为：94~C预变性 4 min；94℃变性
1 min．35℃退火 l min，72℃延伸 2 min，40个循环；
最后 72~C延伸 7 min。取 20 1 PCR产物和4 l 6×
溴酚蓝，存 1．5％琼脂糖凝胶 (含 0．5 g ml。溴化乙
锭)上电泳 (0．5xTBE、5 V cm )1．5 h，SYNGENE
凝胶成像系统拍照记录。
扩增程序的优化 筛选出各因素的最佳水
平组合后，在基本扩增程序的基础上，主要针对主
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第1期 李冬梅等：大花蕙兰基因组DNA提取及RAPD反应条件探索 27
衰 1 RAPD反应体系中5种成分用量
Table 1 Diferent amount offive important components used in RAPD reaction
循环的变性时间、复性温度、延伸时间设置6种程
序(表2)，其它扩增程序参数不变。
衰2 6种不同的扩增程序
Table 2 Six diferent thermal programmes used in am plifcation
1．4 优化的RAPD体系的初步应用
利用优化的RAPD体系，分别以大花蕙兰 ‘金
杯’和 ‘钢琴家’的基因组 DNA为模板，对 [00个
lO碱基随机引物进行筛选。重复三次。
2结果和分析
2．1基因组 DNA提取
用3种方法提取了大花蕙兰的基因组DNA，从
图 l和表 3可以看出，3种方法均能提取基因组
DNA，但用 SDS法提取的DNA，在电泳检测时胶状
物富集点样孔附近，形成亮带，0D龇 舳高于 2．10；
CTAB法提取的DNA呈棕褐色或粘稠状，OD： 帅低
于1．70；改良 CTAB法提取 的DNA的 OD2 帅在
1．8O一1．9O之间，电泳点样孔附近无杂质污染，条带
清晰。利用改良CTAB法，从 O．5 g‘金杯’、‘钢琴
』 Q墨 TA旦 —Modife—d CTAB
1 2 3 4 5 6 M
图 l大化蕙兰的基因组 DNA不同提取方法的电泳图谱
Fig 1 Electrophoretogram ofgenomic DNA from
leaves of Cymbidium hybridium
1，3，5为 金杯’CV．HiroshimaGoldenCup“SunnyMoon”
2，4，6为 ‘钢琴家’CV，Fortissimo“Pianist”；
M= DNA， coR I+Hind 1I Marker．
表3 3种方法提取的大花慧兰叶片基因组DNA检测
Table 3 Results ofDNA extraction from the leaves of Cymbidium hybrldium cultivars by various methods
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28 热带亚热带植物学报 第 l4卷
家 ’叶片 中提取 的 DNA量 分别为 1 10l3 g和
132．2 Ixg，按每次PCR的DNA用量为 25 ng计算，
可以分别满足 4412和 5 288次 PCR反廊所需。其
它两种方法虽数量上能满足，但在质量上达不到要
求。而改良CTAB法提取的基 组 DNA，在质量和
数量上均能满足大量PCR扩增的需要，故可作为优
选的方法。
2．2 RAPD体系的优化
2．2．1 RAPD反应体系主要成分的优化
从 2A可看}{，M 浓度在 1．0 mmol／L时扩
增产物很少，在 1．5-2，5 mmoFL之间时扩增产物条
带亮且清晰，在 3,0—4．0 mmoFL之间扩增产物条带
多但较模糊，故Mg 浓度以2,0 mmol／L左右为宜。
DNA聚合酶 (图2B)对 RAPD体系有较大的
影响，25 l反应体系中酶用量越多，扩增产物条
带越亮， DNA聚合酶在O．5 U到 1．5 U之间时
扩增产物条带清晰，从经济角度和实验效果综合考
虑，Taq DNA聚合酶用量以 1．0U为宜。引物的用
量 (图 2C)对 RAPD反应也有 一定的影 H向，在
O．20 txmol／L时，扩增的条带最清晰。在实验设置的
用量范围内，模板 DNA的用量 (图2D)和 dNTP的
Mg Taq DNA polymerase
2 3 4 5 6 7 M l 2 3 4 5 6 7 M
Primer Template DNA
1 2 3 4 5 6 7 M l 2 3 4 5 6 M
dNTP Different thermal programmeg
图2 5种上要成3)-*1 6种扩增 序对 RAPD体系的影响
Fig．2 Efects of five components and six thermal programmes on RAPD reaction
A、B、C、D、E ll的 1—7见表 1：F Illf一1-6见 2．1—7inA，B，C，D andE represent concentrationgradient as
indicated in Table 1：1 6 in F are the same as that in Table 2．M=kDNA／E~，oR I+t／bid IU Marker
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第 1期 牟冬梅等：大花蕙兰基囡组DNA提取及RAPD反应条件探索 29
用量 (图 2E)对 RAPD体系影 响 大 ，10到
50 ng的模板 DNA用量、0．10—0．40 mmol／L dNTP
均可扩增出稳定的条带，从扩增效果和经济角度综
合考虑，选用的模板 DNA用量为 25 ng、dNTP浓度
为 0．20 mmol／L。因此，优化的RAPD反应体系为：
在25 l反应体系中，M 、Taq DNA聚合酶、引物、
模板 DNA和 dNTP 5种主要成分的适宜浓度或用
量分别是：2．0 mmol／L、I．0 U、0．20 I~mol／L、25 ng和
0．20 mmol／L。
2．2．2 RAPD扩增程序的优化
在优化的反应体系基础上，用6种程序(表2)进
行扩增，以程序 5和 6的效果最好，扩增的条带多
且清晰，但程序6比5的特异性有所提高：程序3
次之，扩增条带较多但模糊；程序 1和 2扩增的条
带都很模糊；程序4最荠，扩增效率较低，条带少且
剥 ( 2F)。可能是程序 5与6扩增时间较短，对酶
活性的保持相对会好些。由于程序 6比5的特异性
好，故确定程序 6为优化的程序。
2．3优化的RAPD体系的初步应用
利用筛选出多态性和重现性最好的 8个随机
引物 (表 4)分别对 ‘金杯’和 ‘钢琴家’的基 组
DNA进行 PCR扩增。结果表明 (图3)，多数条带
清晰，扩增背景较 F净，扩增片段的大小范同也较
人，冈此，进 ‘步证实该 RAPD反应体系和扩增程
序适宜进行大花蕙兰的 RAPD分析。
表 4 8个随机引物的序列
Table 4 Sequences of selected arbitrary primers
引物编号
Code ofprimers
序列 Sequence
5’一 3’
GAACGGACTC
G11CCCGACGA
TCCGATGCTG
CTGGCGAACT
GAGTCAGCAG
ACTGAACGCC
GTCCGTACTG
GGTGC1℃CGT
3讨论
3．1基因组DNA的提取
研究表明m，：”，不同的取材时间、取材部位所获
得的基因组DNA对 RAPD有很大的影响。由于大
花蕙兰叶片肉质，叶片越老，含有的多糖、多酚物质
就越多，所以，采集幼嫩叶片是提取人花蕙兰基【大l
组 DNA的前提。DNA的提取是 RAPD扩增成功的
基础，不同植物的基因组必须采取与之相适宜的提
取方法，本试验采用改 良CTAB法，在提上Dc液·I『力U
入B．巯基乙醇和 PVP两种抗氧化剂，可防止 DNA
的褐化，这上j戴思兰 】的研究结果 ·致；针对 SDS~H
CTAB法提取的 DNA中蛋白、多糖和多酚含量高
的问题，我们采用的改良CTAB法用高盐TE溶液
I蚓3不同引物对 ‘金杯’和 ‘钢琴家’基网组 DNA的RAPD扩增 谱
Fig．3 RAPDpaterns ofcv．HiroshimaGoldenCup“SunnyMoon”and CV．Fortissimo“Pianist’
1～8为 ‘金杯’模板 DNA；9—16为 ‘钢琴家’模板 DNA．1—8：GenomicDNA ofcv．HiroshimaGoldenCup“SunnyMoon”：9—16：Genomic
DNA ofCV．Fortissimo “Pianist”． 1与 9、2 10、3与 1 1、4与 12、5与 13、6与 14、7与 15、8与 16所用引物分别为 BA66，BA67，BA187，
BA198，BAl99，BA425，BA439和 BA440．M：kDNA／EcoR I+日ind m Marker． Theprimers of 1 and 9，2 and 10．3 and 11，4 and 12，5 and 13，6
and l4，7 and 15，8 and 16wereBA66，BA67 BAl 87，BA198，BA199，BA425，BA439 andBA440，respectively．
订 ％ ∞
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30 热带业热带植物学报 第 l4卷
(1 0 mmol／L Tris—HCI，pH 8．0； 1．0 mol／L NaC1；
O．1 mmol／L EDTA，pH 8．0)溶解粗DNA样品液后，
再用酚／氯仿、氯仿抽提，可有效除去蛋白、多糖和
酚类等物质，获得的DNA的质量和纯度都较好。
3．2 RAPD体系的优化
RAPD反应条件严格，M 、 DNA聚合酶、
引物、模板 DNA和 dNTP及反应缓冲液等因素均能
影响扩增结果，已有的RAPD反应体系不能适合所
有的物种。虽然RAPD反应涉及诸多 子，但通过严
格控制反应条件，保证所有反应都在同 ‘反应体系
下完成，如使用同 厂家相同批号的7I(砌DNA聚合
酶，采用相同的扩增程序，就能获得重复性好、稳定
可靠的结果[2n篮I。本试验为了使RAPD体系具有较高
的稳定性，对影响RAPD的主要因素进行了试验，结
果得到与之相吻合的结论。而且 RAPD操作流程快
速、简便，不需要同位素等优点，根据实验需要也可
以转化为可靠的 SCAR标记，故我们认为 RAPD可
作为火花蕙兰分子生物学研究的重要标记方法。
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