全 文 ：前言
菊叶香藜（Chenopodium foetidum）为藜科藜属一年生草本，高20～50cm，有强烈气味。生于海拔
2700-4500m的山坡、村边、河滩[1]。有时也为农田杂草，分布于亚洲、欧洲及非洲[2]。对于这种常见的植
物，目前只有在各类植物志中有简单的记载，并没有更加深入的研究。若要了解其更进一步的机制，DNA
的提取是不可或缺的步骤。本文首次用5种方法对菊叶香藜基因组DNA进行提取，旨在探讨出最适合的
提取方法，即得到纯度、浓度较高的DNA，同时操作较为简便的提取方法。RAPD（Random amplified poly-
morphic DNA）,即随机扩增多态性DNA标记，是上世纪90年代发展起来建立在PCR技术基础上的检测种
一级水平基因多态性的行之有效的分子标记[3]，并且具有快速、方便、灵敏度高、检测容易的优点[4]。将提
取所得的DNA进行RAPD-PCR扩增，通过电泳图谱可以更进一步对DNA的质量及提取效果进行评估，为后
续研究提供更可靠的依据。
菊叶香藜(Chenopodium foetidum)基因组
DNA的提取方法研究
张勇群 石梦菲 德 吉 索南措 拉 多
(西藏大学理学院西藏拉萨 850000)
摘要:文章通过传统CTAB法、改良CTAB法、SDS法、高盐低pH法和试剂盒法等5种方法，对菊叶香藜
进行基因组DNA提取，旨在筛选一种菊叶香藜基因组DNA的适宜提取方法。同时用紫外分光光度法和
琼脂糖凝胶电泳对 5种方法所提DNA进行检测，并对改良CTAB法提取的DNA进行RAPD-PCR扩增检
测。结果表明：改良CTAB法提取速度较快，便于操作，提取的DNA质量较好，进行的RAPD-PCR扩增条
带清晰，能满足分子标记的要求。因此，改良CTAB法为菊叶香藜基因组DNA可靠并合适的提取方法。
关键词:菊叶香藜；基因组DNA提取；RAPD检测
中图分类号:Q948 文献标识码:A 文章编号:1005-5738(2014)01-013-04
收稿日期：2014-04-16
第一作者简介：张勇群，女，汉族，湖南益阳人，西藏大学理学院副教授，博士，主要研究方向为生物多样性与分子生态。
通信作者简介：拉多，男，藏族，西藏日喀则人，西藏大学理学院副教授，博士，主要研究方向为生态学。
西藏大学学报(自然科学版)
JOURNAL OF TIBET UNIVERSITY
Vol.29 No.1
May 2014
第29卷第1期
2014年5月
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DOI:10.16249/j.cnki.54-1034/c.2014.01.004
1 材料与方法
1.1 材料
新鲜菊叶香藜采于西藏拉萨西藏大学新校区，植株清洗后烘干粉碎于4℃保存。
1.2 菊叶香藜基因组DNA的提取
将处理保存后的样品分别用以下5种方法进行基因组DNA的提取。
1.2.1 传统CTAB法
称取菊叶香藜干粉50 mg，盛入1.5mL离心管中，加入500μL 65℃预热的缓冲提取液（0.015mol/L
EDTA pH8.0，0.075 mol/L Tris-Hcl pH8.0，1.5% CTAB，1 mol/L NaCl），于65℃水浴中保温45min，每隔
几分钟颠倒混匀，使得粉末与提取缓冲液充分接触；加入500μL氯仿/异戊醇（24:1），震荡混匀，室温下
12000 r/min离心10 min，取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），重复离心，取上清，加2倍体积的无
水乙醇，于-20℃静置过夜；次日取出于室温12000r/min离心10min，倒掉上清，用70%乙醇洗涤沉淀2次，
12000r/min离心5min，倒掉乙醇，室温干燥后溶于50μL TE。
1.2.2 SDS法
称取菊叶香藜干粉约50mg，盛入 1.5mL离心管，加入600μL 65℃预热提取液（0.5mol/L NaCl，
0.1mol/L Tris-HCl pH8.0，0.05 mol/L EDTA pH8.0，0.01mol/L DTT），再加250μL 5% SDS，充分混匀后
于65 ℃水浴中保温40 min；稍冷却后加入150 μL 5mol/L NaAc，混匀后冰浴20min；16℃，10000r/min
离心20min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），震荡混匀后于4℃ 12000r/min离心10min；取
上清液，加入0.6倍体积-20℃预冷的异丙醇，-20℃静置30 min；12000 r/min，室温离心10 min，收集沉
淀，并用70%乙醇洗涤两次，风干后溶于50μL TE。
1.2.3 高盐低pH法
称取菊叶香藜干粉约50mg，盛入1.5mL离心管，加入500μL 65℃预热提取液[5]（100mmol/L NaAc，3%
可溶性PVP，2% DTT，25mmol/L EDTA pH8.0, 1.5% SDS），混匀后65 ℃水浴保温30 min，不时颠倒混匀；
稍冷却后于4℃，10000r/min离心10 min，取上清液加2/3倍体积的2.5 mol/L pH4.8的NaAc溶液，冰浴
15min；10000 r/min，4 ℃，10 min。取上清液加等体积的氯仿/异戊醇（24:1），震荡混匀后10000r/min，
4℃离心10min；取上清，加等体积的异丙醇（-20℃预冷），轻轻颠倒混匀，-20℃静置30min；14000r/min，
4℃离心20min，用70%乙醇洗涤沉淀两次，风干后溶于50μL TE。
1.2.4 改良CTAB法
称取菊叶香藜50mg的干粉，盛入1.5mL离心管中将250μL氯仿直接加在装有样品的离心管中浸泡
5 min，尽可能倒掉氯仿，加750μL 65℃预热的提取缓冲液（0.1mol/L Tris-HCl pH8.0，0.1mol/L EDTA
pH8.0，0.5 mol/L NaCl，2% CTAB，3% PVP，2% DTT），65℃水浴20min，不时颠倒混匀；稍冷却后，4℃离心，
12000r/min，10min；取上清，加等体积的苯酚/氯仿（1:1），震荡混匀，12000r/min，4℃，10min，取上清，加
等体积的氯仿/异戊醇（24:1），震荡混匀后12000r/min，4℃，10min；取上清，加等体积的异丙醇（-20℃预
冷），轻轻颠倒混匀，-20℃静置30min；12000r/min，4℃，20min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗两次，风干后溶
于50μL TE。
1.2.5 试剂盒法
基因组提取试剂盒购于生工生物工程（上海）有限公司，称取50mg的叶片按照Ezup柱式植物基因组
DNA抽提试剂盒的使用说明对菊叶香藜基因组DNA进行提取。
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1.3 基因组DNA提取结果检测
1.3.1 紫外分光光度法检测
取2μL DNA提取液稀释100倍，以TE作为空白对照，利用核酸蛋白测定仪（Eppendorf BioPhotome-
ter plus）测得DNA样品的浓度，以及在波长260 nm和280 nm处的吸光值，通过其比率可以判断DNA的纯
度及提取效果。
1.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测
配制0.8%的琼脂糖凝胶，在TBE缓冲液中以80 V的电压电泳1.5 h，并用凝胶成像系统(北京六一仪
器)进行拍照。
1.3.3 RAPD-PCR扩增检测
在含有10×Taq Buffer、2mmol/L Mg2+、0.2mmol/L dNTPs、1.0 U Taq酶、30 ng 改良CTAB法提取的
DNA模板、0.2μmol/L RAPD随机引物（序列为GGT GAC TGT G）的25μL反应体系中进行3次平行PCR扩增。
扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，36.9℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
扩增结果用1.6%的琼脂糖凝胶在TBE缓冲液中以110V的电压电泳45min，并用凝胶成像系统进行拍照。
2 结果与分析
由图1可知可用不同方法提取菊叶香藜DNA，从DNA条带上来看，传统CTAB法、改良CTAB法及高盐低
pH法所得到的DNA浓度较高。其中，高盐法的条带更明亮，同时，改良CTAB法提取到的DNA降解较少，弥
散程度远小于另外两种提取方法。从点样孔来看，由于受到糖类等物质的粘连，传统CTAB法、改良CTAB
法及高盐低pH法在点样孔处均有亮带，而试剂盒与SDS法对于糖类杂质的去除较彻底，只是由于DNA浓
度较低，DNA条带极弱。同时，由于未经RNAse处理，DNA图谱中仍有部分的RNA带。从表1的数据中来看，
改良CTAB、高盐低pH法及试剂盒法的蛋白质类杂质去除较彻底。就整体浓度及纯度而言，改良CTAB法与
高盐低pH法更适合菊叶香藜基因组DNA的提取。
图2 改良CTAB法提取的菊叶香藜基因组DNA的RAPD-PCR电泳图谱
注：M:λ Marker；1，2，3：改良CTAB法提取的DNA进行3次平行RAPD-PCR扩增的结果
注：M:λ Marker；1,2：传统CTAB法；3,4：改良CTAB法；
5,6：SDS法；7,8：高盐低pH法；9，10：试剂盒法
图1 5种方法提取的菊叶香藜基因组DNA的凝胶电泳图谱
提取方法 浓度（μg/mL） A260 /A280
传统CTAB法 1450 1.55
改良CTAB法 370 1.80
SDS法 140 1.35
高盐低pH法 .590 1.78
试剂盒法 220 2.18
表1 5种方法所提取的菊叶香藜基因组DNA的浓度和纯度
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由图2可以看出，改良CTAB法提取得到的DNA可以成功地进行RAPD-PCR扩增，并且3次平行扩增的
条带基本一致，说明该提取方法得到的DNA进行RAPD反应的重复性较好，可用于进一步的分子生物学研
究。
3 讨论与结论
实验表明，对于菊叶香藜基因组DNA的提取，改良CTAB法和高盐低pH法最适宜，其中，改良CTAB法的
操作时间更短，步骤简单，更适合针对大量材料的DNA提取。
CTAB破坏细胞膜释放DNA，同时与提取缓冲液中的EDTA共同保护DNA免受内源核酸酶的降解[6]。在
改良CTAB法中，增加提取缓冲液的用量，并且将EDTA的浓度增加到100mmol/L，这样可以大量地螯合Ca2＋
和Mg2＋，而Ca2＋和Mg2＋是DNA酶的辅助因子，使残余的DNA酶进一步失活。此时，即使减少与缓冲液混合的
保温时间，也能够减少DNA的降解。同时，为了避免在加入提取液与酶变性失活之间的时间里DNA酶对于
DNA的降解作用，改良CTAB法中提前加入了氯仿，使得蛋白质和DNA酶变性失活。
在提取缓冲液中加入2%的DTT和3%的PVP，可以抑制酚类物质氧化而使得DNA发生褐变，PVP易与酚
类物质结合沉淀[7]，从而去除酚类杂质。同时，在抽提时先用酚/氯仿（1:1），再用氯仿/异戊醇（24:1），最
大限度地去除酚和蛋白质，提取得到的DNA溶液为无色的澄清液体。
在提取材料预处理时，由于没有及时冷冻保存以及液氮研磨，使得材料中部分DNA在提取前已被降
解。若要减少DNA的降解，可将新鲜材料采集后立即进行冷冻处理，并且在提取前使用液氮研磨充分，会
得到质量更好的DNA。
对于以上5种提取菊叶香藜DNA方法，整体的缺陷就是多糖的去除不够充分，也许是沉淀DNA时离心力
过大使得糖类物质与之结合过于紧密，即使在后面的洗涤中也不能完全去除。可以根据马明等的研究[8]，
将离心沉淀DNA改为挑取絮状DNA后洗涤，能得到纯度更高的DNA。
参考文献
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的胜负也会随着随机游动的节点多少而改变。
参考文献
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范忠雄：对弈熵率在藏棋“杰布杰曾”上的应用
Entropy rate of Chess Game-Tibetan JiebujiezengFan Zhong-xiong
(School of Mathematics and Computer Science, Northwest University for Nationalities,Lanzhou 730030, Gansu)
Abstract: There are many Tibetan folk chess games in Tibet, For example Nige’er, Mimang, Jiebujiezeng, etc.The possibility of winning in playing such chess game can be calculated by entropy rate. The wining possibilitylevel can be calculated by comparing the entropy rate between two opponents, i.e. the relationship between highentropy rate of a side and its high degree of freedom. The entropy rates of the two door Jiebujiezeng chess calcu⁃lated in present paper showed that the entropy rate of King is=3.9419 and of Minister is=3.7045. This gives ahigher possibility to win the King.
Keywords: Tibetan game; Tibetan chess; stationary distribution; entropy rate; random movement
Extraction of Genomic DNA from Chenopodium foetidum and
Detection of Its RAPDZhang Yong-qun Shi Meng-fei De Ji Suo Nan-cuo La Duo
(School of Science, Tibet University, Lhasa 850000, Tibet)
Abstract: The research aimed to find out a suitable method for genomic DNA extraction from Chenopodium foeti⁃
dum. The genomic DNA of Chenopodium foetidum were extracted with five genomic DNA extraction methods,namely traditional CTAB, improved CTAB, SDS, high concentration salt and reagent kit. The extracted genomicDNA samples of five methods were tested by using ultraviolet spectrophotometer and agarose gel electrophoresismethods, respectively. The DNA extracted by the improved CTAB method was detected through RAPD-PCR am⁃plification. The results showed that the improved CTAB method was more efficient and easy to operate. The im⁃proved CTAB method can extract high quality DNA and RAPD-PCR amplified DNA has clear bands. The quali⁃ty of extracted DNA with improved CTAB method could sufficiently meet the requirements for further molecularmarker experiment, and the improved CTAB method showed to be a reliable and suitable method for DNA extrac⁃tion from Chenopodium foetidum.
Keywords: Chenopodium foetidum; genomic DNA extraction; RAPD detection
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[责任编辑：索郎桑姆]
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