全 文 ：核 农 学 报
, 。一
八公
脂质体介导的外源基因在
黄瓜悬浮细胞原生质体中的表达
汤辉仙 贾士荣
中国农业科学院生物技术研究中心 北京
尹长城 赵南明
清华大学生物科学与技术系 北京
本文 用脂质体 包裹质杜 , 研 究 了不 同制 备方法 、 不 同磷脂成分对 包 裹 率
的影响 , 以 及超声处理时脂质体 内质粒 稳 定性的影响
。 用改进的脱水再 加 水
,
法制备质粒脂质体 , 使 包裹率由 一 提高到 一 黄瓜悬浮细胞原生质体
与 包裹 一 质拉的脂质体 经 诱导融合
,
培养 天 和 天后 均测 得 较 属
的 活 性 , 说明脂质体介导的外源基 因 己 在黄瓜 细 胞 中成功地表达 。
关健词 脂 质体 质拉 原生质体 遗传转化 黄瓜
前 言
脂质体作为载体
, 将外源基因导入植物细胞 , 是近年来发展起来的遗传转化方法之一
以原生质体作为受体 , 用 一磷酸钙共沉淀法 、 根癌农杆菌共培养法 、 显微注射法
、 电激
法等介导基因转移 , 都 已有成功的报道
。 用脂质体包裹病毒 〔
, “ 或 〔‘ ’
、
细菌质
粒 ”了 , 也 已成功地导入动植物细胞
。
脂质体介导的质粒 , 在导入烟草原生 质 体
后 已在其种子后代中得到稳定的表达 〔“
。 脂质体作为基因载体的优点是 , 可使包裹的 核 酸
物质免受核酸酶等的降解 , 从而提高转化效率 。
本文报告用脂质体包裹质粒 , 将其导入黄瓜悬浮细胞原生质体 , 摸索和优选 了 质
粒脂质体的包裹
、 导入及外源基因在细胞中表达的合适条件 , 建立了用脂质体介导进行黄瓜
原生质体遗传转化的体系 。
、
材 料 和 方 法
一 原生质休的游离
、
培养
黄瓜胚性悬浮细胞 已继代三年
。
原生质体的游离 、 培养均参照贾士荣等的方法 ’ 〕
二 质粒 的提取
、
鉴定
大肠杆菌质粒由比利时 大学 。爪 教授赠送 , 该质粒 左
右 , 带有胭脂碱合成酶基因的启动子和卡那霉素抗性 ’ 标记 基 因 一 。
议 。 核 农 学 报 卷
一 大肠杆菌质粒由美国 大学植物分 子生物 学买验室蔡 南 海 教 授 惠
赠 , 质粒大小为 , 带有花椰菜花叶病毒 启 动因 乙和 氧霉素乙酞转移 酶 报 告 基 囚
一 。 本文中将 用于测定质粒脂质体的包裹率和超声对 脂
质体内质粒 稳定性的影响 一 用于导入黄瓜原 尘质体 , 观察 基因在细
胞中的表达 。
·
质粒 用 “ 碱解法 ” 〔们提取后 , 用 溶液 , ,
, 甘露醇 , 溶解成 一 林 州
。 取少量 进行 电泳鉴定 , 电 泳 参 数
为 琼脂糖凝胶 , 缓冲液 一 , , ,
伏 电泳两小时 , 在紫外灯下观察质粒 条带 。
三 脂质体包裹质粒 的方法及其鉴定
质粒脂质体的制备
以大豆磷脂 为原料 , 用下列三种方法制备质粒脂质体
‘ 脱水再加水法 ” 法 。 同荧光脂质体的制备 。
“ 冰冻一解冻法 ” 法 。 参考 等的方法 〔吕 ’
。
将 大豆磷脂氯仿溶
液 于氮气下干燥 , 加入 林 溶液 , 超声 分钟 , 形成单片层小囊 泡 脂
质体 , 加 川质粒 , 混匀 , 置液氮中速冻 , 一 ℃放 小时后置室温下融化
小时以上 , 然后再置液氮中速冻 , 重复以上解冻步骤 , 室温 卜完全融化后 形成单片 层 大
囊泡脂质体 。
改进的 “ 脱水再加水法 ” 法 〔。 〕 除以 作原料外 , 还适用于磷 脂 酸
胆碱 , 磷脂酞乙醇胺 , 胆固醇 和油酸 。 具体方 法 是
或 卜 卜 件 或 卜
卜 卜 , 溶于氯仿中 , 在氮气下吹干 , 真空干燥 小时 , 加 水 。 毫
升 , 超声 分钟 , 形成空白 加入 协 质粒 一 卜 协
、 卜 溶液
和 卜 水
’
, 混匀后置液氮中速冻 , 然后冰冻干燥 小时左右 , 室温下加 川水 , 水化 小
时 , 形成乳白状的 , 经 柱层析 , 部分收集器收 集 , 每
管 一 毫升 , 用紫外扫描俭测仪 , 西德 测定 下 的 吸 收
值 , 将第一吸收峰 脂质体 的各管合并 图 , , 用 缓冲液稀释至 毫升 此 时
脂浓度为 林 , 再经 卜聚碳酸脂滤膜 , 美国 公
司生产 过滤灭菌 , 得到大小较为均一的 脂质体 , 贮 ℃冰箱备用
。
脂质体内质粒 的鉴定
取上述脂质体溶液 毫升 , 加 川 胆酸钠溶液使脂质体破裂 , 加 醋酸钾
叭 , 再加两倍体积的 酒精 , 置一 ℃冰箱中沉淀 一 小时 , 经离心 、 吹 干 后 , 用
溶解 , 电泳鉴定质粒 。
四 脂质体介导的 若因转移及其检浦
一 质粒脂质体与原生质休的融合与保温
聚乙二醇 诱导融合和保温共培养方法同前报道 对照组为未经任何处 理 的 黄
瓜悬浮细胞原生质体
。 裸露质粒 处理组 , 是在 毫升原生质体 一 。
中加入 卜 一 质粒 和 林‘单精 , 混匀 , 余同
期 脂质体介导的外源基因在黄瓜悬浮细胞原生质体中的表达
图 “ 脱水再加水法 ’ 制备的质粒脂质体经
柱层析后 , 在 处的
吸收峰 包裹率为 帕
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—脂质体内 公 一 吸收峰
—脂质体外 一 吸收峰
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脂质体内 质粒吸收峰
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。
诱导融合法 〔“ , 。
活性检测
经上述处理后的原生质体 , 在 培养基 〔’ 〕,协, ℃暗培养 天和 天后 , 分别 破碎
细胞 , 提取 清液 , 参考 等 的方法 〔‘ “ ’进行 分析 。 每个样 拮 蛋 白 量
为 卜 , 薄层层析点徉量 卜 , 用 胶
一
和加强 膜
进行放射性自显影
。
实 验 结 果
为使制备质粒脂质体的条件最优化 , 曾分别研究了不同制 备方法
、 不同磷脂成分对质粒
脂质体包裹率的影响 , 以及超声处理对脂质体内质粒 稳定性的影响
。
一 超声对脂质体内质较 分子的形晌
写哄 和 将裸露 质粒 进行不 同时间超声处理
, 发现超 声
核 农 学 报 卷
分 钟 , 质粒 全部破坏 , 降解成碎片 超声 秒 , 一半的质粒被降解 ’‘ 。 我们对 “ 脱
水再加水法 ”制 成的 质粒脂质体 , 进行不 同时问的超声处理
, 使得脂质袜矢少
、
结构较为均一 , 再经 ” 柱层析 , 将脂质体收集起来进行 电泳 , 鉴定脂质体 咚质
粒 分子 的完整性 图版
。
结果表明 , 不 作超声处理
,
质粒 条带清楚 , 一 没有降
解 图版 一 , 下部条带 为超螺旋质粒 , 电间和 上部条带为线形和 升环质粒 。
,
超
声 秒 , 质粒 部分降解 , 开环和线形质粒减少 超声 秒 , 质粒大量降解 图版 一 人
脂质体外的质粒 经超声 。秒 , 几乎全部降解 , 只剩一点超螺旋的淡带 图版 “梦
「
, 说
明脂质体对
一
包裹的质粒 有保护作用 , 大大减轻了超声处理对质粒 六分子 的 破 坏 作
用 。
, ‘ ⋯
弓
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图 扳 超声处理对 。 飞 质粒 的影响
几 户 ”
脂质体内质垃
, 未经超声处理
脂质体外质粒 , 超声 秒
月旨质 休内质粒 , 超声 秒 。
‘ ,
班 , 令
‘
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· ” 士 ”夕
幻 。。 厂 ‘
二 不 同制备方法对质粒脂质体包裹率的影响
我们发现用包裹荧光黄 的 “ 脱水再加水法 ” 法 击、备包裹 勺
·
脂派
体的包裹率很低 图 , 仅 左右 , 目制备过 程中的超声处理对耳拉 的破坏很落
“ 冰冻一解冻法 ” 法虽然避免了超声处理 , 俱包裹率 仍然较低 , 约 一 以五 所 以
目前我们采用 了改迸 的 “ 脱水再加水法 ” 法
一
至 ,
, “ ’, 再稍恤修改
, 一
博翅矍中由 ,
一 提高到 一 表 , 图
。 , 一 、
表 不 同制备方法对 质粒脂质体包襄率的影响
、
方 法 再加水体积 冰冻前体积 包 裹率 呱
全 一 ⋯下派 肠
法
法
法
法
一
一
一
三 不 同包裹物和不同磷脂成分对脂质体包襄率的影晌
实验用不 同包裹物和不 同磷脂 , 通过 法制 备脂质体
。 由表 可 以看出 , 小分子包裹
期 脂质休介导的外源基因在黄瓜悬浮细胞原生质体中的表达
物不如大分子包裹物的包裹率高 , 荧光黄 , 的包裹率为 一 ,
、一 为 , 可能是小分子物质 比大分子物质更易从脂质体中渗漏出来
, 所 以 法
更适宜于包裹核酸类的大分子物质
。 不 同的磷脂组成对包裹率影 响很大 , 用大豆磷脂脂质体
包裹 时 , 其包裹率为 , 而用 时贝 为 ,
只有
。
为此
,
本实验均采用天 然大豆 磷脂为原料制备质粒脂质体
。
表 包裹物大小和确脂组成对脂质体包襄率的影响 法
竺
包 裹 物
打
”
分 于 量 磷脂成分
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包 裹率 肠
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一
攀 落 蠢 巍
图版
一 、
黄瓜细胞中 活性的放 射 自显影
士 一 一
一 和 一 , 分别为培养后 天和 天 。 裸露质粒 一 处理
,
质粒脂质体 原生
质体共培养 , 质粒脂质体 原生质体 诱导融合 对照
一 一
·
一 川 一
之 , 一 一 , , 一
, ”
城 四 黄瓜悬浮细胞中 基 因的表达
氯霉素乙酞转移酶 可 使氛霉 素乙酞化 , 形成 卜 乙酞笔 一 、 一 乙酞
核 农 学 报 卷
基 一 、 及 , 一双 乙酞基 , 一 等氯霉素衍生物 。
如 “ 材料和方法 ” 一节中所述 , 我们用脂质体包裹 一 质粒
, 分别对以下四种
处理进行了比较 质粒脂质体 原生质体 诱导融合 质粒脂质体 原生质体 保 温 共
培养 , 不加 处理 裸露 一 八 质粒 原生质体经 处理 对照 , 原
生质体中不加质粒脂质体或裸露质粒 。 原生质体经上述处理后分别培养 天和 天 , 测
定细胞提取液中 活性及基因的短暂表达 丁 , 结 果 如图版 所
示 由图版 可知 , 质粒脂质体 原生质体 诱导融合 , 培养 天和 天均有明显的 活
性 , 说明 基因已在黄瓜细胞中成功地得到表达
。
对照
、
保温共培养 天和 天 及 裸
露 一 处理组均测不出 活性
。 比较脂质体包裹相裸露 的结果说明 , 脂质休
对质粒 确有保护作用 , 有利于 基因的整合和表达
。 以 匕实验经三次重复 , 结果完
全一致 。
讨 论
实验中我们采用改进的 “ 脱水再加水法 ” , 使质粒脂质体的包裹率达 , 在所有供试
方法中最高 。 和 报道了这种脂质体制备方法 , 制备过程较 为 简
单 , 其改进的地方是冰冻干燥前 即脱水时 的体积增大 倍 , 再加水的体积为冰冻干燥前
的以 , 这样使得脂质体的包裹效率大大提高
。 他们用该法包裹了很多种物质 , 从小分子的
、 狡化荧光素 、 葡萄糖
、 蔗糖 , 到大分子的白蛋 白和 分子 , 其包裹率都很高 , 平
均达 一 , 特别是 分子的包裹率更高
, 为 左右 实验中我们将上述方法 稍 加
修改 , 将再加水量由脱水时的 改为 和 , 使 叨和 一 脂 质
体的包裹率达 一 这是 因为再加水进行水化时 , 若水量太少
, 会使冰冻干燥
后的脂和质粒 不能充分 、 彻底地水化 , 影响脂质体的形成和结构的稳定性
。 另外 , 水
化时加水量的大小还要考虑到使脂质体内外渗透压保持一致 , 以使脂质体结构相对稳定 。 该
法在制备过程中避免使用有机溶剂
、 超声处理和去污剂 , 也是一大优点 。 我们认为这是迄今
制备质粒 脂质体的最佳方法
。
原生质体与 一 脂质体保温共培养 天和 天后 , 未测出 活性 , 而 诱
导融合组 脂质体通过膜融合摄入细胞 培养 天和 天 , 均可测出很强的 活性 。 这说明
保温共培养法不适于质粒 的遗传转化 , 尽管在荧光脂质体的模式系统 中 , 保温处 理 组
的荧光细胞达 以上 〔“ 。 这可能是因为经 内吞作用导入细胞的脂质休 , 随后进入溶 酶 体
后破裂 , 导致它所包裹的质粒 被核酸酶类所降解
。
裸露质粒 与原生质体进行 处理后 , 也无 活性表现 , 这说明脂质体包裹确
实可以起到保护质粒 分子的作用 。 因而在相 同条件下 , 脂质休作为载体的外源基 因 导
入 , 比裸露 一 处理更加优越 。
本研究建立的脂质体介导的黄瓜原生质体遗传转化体系 , 有可能直接或稍加修改后用于
其它植物种 , 特别是在禾谷类作物上有应用前景
。 因为禾谷类作物的遗传转化 , 受农杆菌宿
主范围的限制 , 迄今仍依赖于原生质体转化技术 , 目前虽可用 电激法将外源基因导入水稻等
禾谷类作物的原生质体 , 但如何提高转化和表达效率仍是一个有待研究的课题 在 方 法 学
, 口
, 期 胎质体介导的外源基因在黄瓜悬浮细胞原生质体中的表达
上 , 不同的技术方法不应当是相互对立和互为排斥的 , 而应当取各法之长进行互补 , 或者在
不同的条件下对不同的植物采用不同的方法 。 因此 , 继续对脂质体介导的原生质体遗传转化
系统进行研究和改进是十分必要的
。
〕贾士荣 , 付幼英 ,
一 。
〔 〕 ,
参 考 文 献
林云 黄瓜子叶原生质体培养中的休细施胚胎发生和植株再生 , 《 生物工程学报 》 ,
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