全 文 ：收稿日期： 2012–04–13　　　　接受日期： 2012–08–24
基金项目： 陕西省教育厅科技计划项目(2010JK391)； 陕西省科技厅科技计划项目(2011K01-40)资助
作者简介： 杨金宏，硕士，讲师，主要从事植物生物技术研究。E-mail: yjhyjhyang@126.com
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: weiqing_kongwq@126.com
热带亚热带植物学报　2013， 21(2)： 116~122
Journal of Tropical and Subtropical Botany
基于rbcL和matK序列探讨马鞭草科部分植物的系
统学位置
杨金宏, 孔卫青*
(安康学院 , 陕西省蚕桑重点实验室 , 陕西 安康 725000)
摘要： 为探究适用于马鞭草科植物的 DNA 条形码及该类群的系统分类关系，对豆腐柴(Premna microphylla)的叶绿体基因
ycf6-psbM、 trnV-atpE、 rbcL、 trnL-F、 psbM-trnD、 atpB-rbcL、 trnC-ycf6、 trnH-psbA、 rpl36-infA-rps8 和核基因 ITS 序列进行了
PCR 扩增和测序，结果表明，仅 rbcL、 trnl-F、 trnH-psbA 序列的 PCR 扩增以及测序效果较好，而 ITS 不能得到明显的扩增条
带，ycf6-psbM 不能成功测序，其它序列存在有部分双峰或噪值高等问题。根据 DNA 条形码标准，rbcL 序列是所有测试条码
中相对最适合的。应用 rbcL 和 matK 序列对马鞭草科(Verbenaceae)豆腐柴属、牡荆属(Vitex L.)、马鞭草属(Verbena L.)和大青属
(Clerodendrum L.)等 4 属与唇形科宝盖草属(Lamium L.)、水苏属(Stachys L.)、鼠尾草属(Salvia L.)和香科科属(Teucrium L.)等 4
属的分类和系统发育关系进行分析，以紫草科 Lithospermum multiflorum L. 为外类群，最大简约法对 2 个片段的单独和联合矩
阵分别构建系统发育树。豆腐柴属和大青属应从马鞭草科划入唇形科，马鞭草属仍归于马鞭草科，而牡荆属的系统学位置还需
更多的证据。
关键词： rbcL； matK； 马鞭草科； 豆腐柴属； 系统学
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2013.02.003
Systematic Position of Partial Plants of Verbenaceae Inferred from
Sequences of Chloroplast rbcL and matK
YANG Jin-hong, KONG Wei-qing*
(Key Laboratory of Sericulture in Shaanxi, Ankang University, Ankang 725000, China)
Abstract: In order to understand systematic relationship of Verbenaceae, chloroplast genes, such as ycf6-psbM,
trnV-atpE, rbcL, trnL-F, psbM-trnD, atpB-rbcL, trnC-ycf6, trnH-psbA, rpl36-infA-rps8 and nrDNA ITS of
Premna microphylla Trucz. were amplified by PCR and sequenced. Among these loci, rbcL, trnL-F and trnH-
psbA were efficient for both PCR amplification and DNA sequencing, while other sequences don’t conform to
DNA barcode standard, ITS had no specific bands, ycf6-psbM could not sequence successfully, and the others had
double peaks or high noisy values. However, rbcL is better than others according to DNA barcoding standard. The
phylogenetic relationships among four genera from Verbenaceae, such as Premna L., Vitex L., Verbena L., and
Clerodendrum L., and four genera from Labiatae, such as Lamium L., Stachys L., Salvia L., and Teucrium L., were
studied by both combined and individual analyese using the chloroplast genes rbcL and matK sequences. The gene
trees were constructed by maximum parsimony method with Lithospermum multiflorum as outgroup. It suggested
that Premna L. and Clerodendrum L. were supposed to be moved to Labiatae from Verbenaceae and Verbena L. in
Verbenaceae taxonomically, and the systematic position of Vitex L. was worthy of further study.
Key words: rbcL; matK; Verbenaceae; Premna L.; Phylogenetics
第2期 117
马鞭草科(Verbenaceae)隶属于被子植物门双
子叶植物纲唇形目，有 80 余属 3000 余种，主要分
布于热带和亚热带地区，少数延至温带。我国有
21 属 175 种 31 变种 10 变型[1]，多分布在长江以南
地区，大部分是重要的中药材来源。马鞭草科和
唇形科(Labiatae)植物有时容易混淆，在系统位置
及进化关系方面存在争议，如恩格勒系统中，认为
马鞭草科是由紫草科发展到唇形科而位于管花目
(Tubiflorae)，将马鞭草科分成 7 个亚科。而哈钦森
分类系统中，本科起源于茜草科(Rubiaceae)，位于
马鞭草目(Verbenales)，而塔赫他间等近代分类学者
则认为仅有马鞭草亚科(Verbenoideae Briq.)、牡荆
亚科(Viticoideae Briq.)及莸亚科(Caryopteridoideae
Briq.)属 于 本 科[2–3]。 而 利 用 DNA 信 息 进 行 的 系
统分类则将马鞭草科分成 8 个类群，包括 1 个新
类群 Neospartoneae trib. nov.，并且认为马鞭草族
(Verbeneae)和 马 缨 丹 族(Lantaneae)的 进 化 关 系 最
近，这与所有的传统分类方法的结果不一致[4]。
豆 腐 柴(Premna microphylla Turcz.)分 布 于 我
国华东、华中、中南、西南各省，其叶和嫩枝含有大
量的果胶、蛋白质和纤维素，可制作豆腐[5]，叶中富
含维生素和氨基酸。植株体可入药，具清热解毒、
消肿止血、医治毒蛇咬伤、无名肿毒等功能，具有重
要的食用和药用价值。传统分类学将豆腐柴归于
马鞭草科豆腐柴属(Premna L.)，但近来利用 DNA
信息进行的系统分类则将其归入唇形科，而大青属
(Clerodendrum L.)的分类同样经历了由最初位于马
鞭草科后划入唇形科的变化。
针对马鞭草科植物在分类与系统研究上存在
的争论，本文利用 DNA 条形码在生物分类上的应
用，对 豆 腐 柴 属 豆 腐 柴 的 ycf6-psbM、 trnV-atpE、
rbcL、 trnL-F、 psbM-trnD、 atpB-rbcL、 trnC-ycf6、
trnH-psbA、 rpl36-infA-rps8、 ITS 基 因 进 行 扩 增 和
测序，并从 NCBI 下载马鞭草科和唇形科的 trnH-
psbA、rbcL 和 matK 序列进行分析，以期为马鞭草
科豆腐柴属和大青属的系统位置和进化关系提供
参考和分子方面的依据，同时也为该类群筛选合适
的 DNA 条形码。
1 材料和方法
1.1 材料
研 究 材 料 包 括 马 鞭 草 科 豆 腐 柴 属、牡 荆 属
(Vitex L.)、马鞭草属(Verbena L.)和大青属与唇形科
宝盖草属(Lamium L.)、水苏属(Stachys L.)、鼠尾草
属(Salvia L.)和香科科属(Teucrium L.)(表 1)。实验
材料豆腐柴(Premna microphylla Turcz.)取自陕西
安康市农业科学研究所植物示范园，其它数据从
GenBank 数据库中下载。
1.2 样品DNA的提取、PCR扩增和测序
称取新鲜植物叶片 100 mg，用组织匀浆仪匀
浆后，使用植物 DNA 提取试剂盒(Tiangen Biotech
Co., China)提取植物总 DNA。各候选序列的 PCR
反应条件、通用引物及扩增程序参照 Chen 等[6]的
方法。PCR 扩增产物经纯化后，在生工武汉测序部
使用 ABI 3730XL 测序仪进行双向测序。
1.3 数据处理
所 测 各 序 列 峰 图 使 用 CodonCode Aligner
V 2.06 (CodonCode Co., USA)软件进行校对拼接，
取出低质量序列及引物区，后利用 ClustalX 1.83
进行多序列比对并查错，可用序列纳入后续分析。
psbA-trnH 序列根据 GenBank 上的注释，取出 psbA
和 trnH 区段，获得 psbA-trnH 间隔区。其余序列采
用 CodonCode Aligner 软件处理，剔除不确定碱基
数目大于 10 个和长度小于 100 bp 的序列[7]。后根
据理想的 DNA 条形码序列应当具有明显的种间变
异，同时种内变异足够小的标准，对各序列的变异
进行分析，选取后续用于系统发育分析的 DNA 条
形码序列。
1.4 系统发育分析
ClustalX 1.83 基于相似性标准对马鞭草科豆
腐柴属、大青属、牡荆属、马鞭草属和唇形科水苏
属、香科科属、宝盖草属、鼠尾草属等的序列进行比
对和排序，并以各基因片段的单独及其联合矩阵分
别构建系统发育树。系统发育树及自展分析应用
PAUP V. 4.0b10 软件，数据均处理为等权重和无序，
空位(Gap)处理为缺失(Missing)，采用最大简约化
法(Maximum parsimony)， 1000 次随机加入，TBR
(Tree bisection-reconnection)枝长交换，进行启发式
搜索(Heuristic search)，寻找最简约树。系统树的
可靠性评价采用自展检验(Bootstrap)来评估，启发
式搜索 1000 次重复取样，计算各分支的支持率，
50% 严格一致树采用。
杨金宏等：基于rbcL和matK序列探讨马鞭草科部分植物的系统学位置
118 第21卷热带亚热带植物学报
2 结果和分析
2.1 PCR扩增效率和测序成功率
本 实 验 进 行 了 ycf6-psbM、 trnV-atpE、 rbcL、
trnL-F、 psbM-trnD、 atpB-rbcL、 trnC-ycf6、 trnH-
psbA、 rpl36-infA-rps8、 ITS 序 列 在 豆 腐 柴 中 的 扩
增 和 测 序，除 ITS 外，PCR 扩 增 均 获 得 成 功(出
现 明 显 的 扩 增 条 带)，除 ycf6-psbM 外， PCR 产
物 测 序 均 获 得 成 功，并 已 在 NCBI 登 陆(登 陆 序
列号分别为： trnV-atpE， JN899595； rbcL， JN899596；
trnL-F， JN899597； psbM-trnD， JN899598； atpB-
rbcL， JN899599； trnC-ycf6， JN899600； trnH-psbA，
JN899601； rpl36-infA-rps8， JN986809)。而测序成
功的 8 条序列中，rbcL、 trnL-F、 trnH-psbA 的序列
峰图较好，其它 5 条序列存在部分有双峰或噪值高
等问题，结果稍差。
根 据 理 想 DNA 条 形 码 标 准，继 续 对 rbcL、
matK 和 trnH-psbA 序列进行分析，结果编码基因
rbcL 和 matK 序列在同一属内物种间的变异较小，
在不同属和科间的变异相对较大，适合于对各属序
列间的分化进行分析。而非编码区片段 trnH-psbA
在不同种属间存在较多的插入 / 缺失和小的 DNA
条形码序列，虽然物种识别所需要的信息增多了，
但变异较大，可能更适于种属内物种的鉴定，因此
本研究选取 rbcL、 matK 两条序列进行后续研究。
2.2 基于rbcL、matK序列的系统进化分析
本文以紫草科 Lithospermum multiflorum L. 为
外类群，用 PAUP V. 4.0b10 软件对来自马鞭草科和
唇形科共 8 属 64 条 matK 和 rbcL 序列的单独及其
联合矩阵构建最大简约树(图 1 ~ 3)。3 个矩阵中，
简约信息位点与变异位点的比例很接近，而与总
长度的比例有很大差距， matK 为 24%，而 rbcL 仅
10%。matK 的变异位点和简约信息位点较多，所
含的信息量相对较丰富，且基于 matK 的系统树的
一致性指数(CI)和维持性指数(RI)分别为 0.756 和
表 1 使用的基因或间隔区
Table 1 Genes or spacer regions tested
科
Family
种
Species
基因 Gene 科
Family
种
Species
基因 Gene
matK rbcL matK rbcL
马鞭草科
Verbenaceae
Premna microphylla HQ427331 JN899597 马鞭草科
Verbenaceae
Clerodendrum fragrans 　 L11689
P. mooiensis JF270900 Verbena bonariensis HM850974 HM850444
P. puberula JQ322526 V. officinalis GQ434146 GQ436523
P. odorata HQ384494 Q384866 V. rigida HM850975 HM850445
P. obtusifolia FJ976163 唇形科
Labiatae
Stachys arvensis HM850806 HM850384
Vitex negundo GQ434148 GQ436525 S. sylvatica FJ395437 AF502022
V. agnus-castus U78716 Salvia miltiorrhiza FJ513168 HM590063
V. rotundifolia AB284177 GQ436526 Salvia sp. FR719105 FR720578
V. trifolia AB284175 S. uliginosa FR719102 FR720577
Clerodendrum
trichotomum
HQ427334 HQ384865 S. rutilans FR719100 FR720575
HQ384492 S. officinalis FR719097 FR720574
C. japonicum AF315297 S. sclarea FR719101 FR720576
HQ911380 GQ436521 Teucrium scorodonia HM850801 HM850397
C. glabrum JF270694 T. chamaedrys FR865047 FR865125
C. thomsonae AF315298 T. montanum FR865045 R865120
C. fortunatum HQ415394 Lamium purpureum JF779876 AB266224
C. cyrtophyllum HQ415393 L. galeobdolon JF779869 HM850102
HQ427333 L. amplexicaule JF779865 AB266225
C. inerme AY289684 L. album JF779864 FJ395588
Clerodendrum sp. 　 AB586352 紫草科
Boraginaceae
Lithospermum multiflorum FJ827263 EU599856
第2期 119
0.850，系统树的拓扑结构较为可信。
在 3 个系统树中，大青属均处在最晚的分支
上，与香科科属或先(图 1, 3)或后(图 2)聚合在一个
分支上，分支支持率分别是 100%、87% 和 66%。
水苏属和宝盖草属是比较相近的类群，聚合分支的
支持率分别为 100% (图 1)、80% (图 2)和 100% (图
3)，豆腐柴属在所构建的 3 个系统树中，与水苏属
和宝盖草属聚合形成的分支(图 2, 3)或与更多的包
括鼠尾草属和牡荆属在内的种属聚合(图 1)分支的
支持率为 62% ~ 64%。牡荆属在以 matK 序列构建
的系统树中与宝盖草属、水苏属和鼠尾草属聚合的
分支相聚合后，再与豆腐柴属聚合(图 1)，在 rbcL 序
列构建的系统树中，其与除马鞭草属之外的所有属
聚合后的总分支相聚合(图 2)，而在 matK 和 rbcL 序
列的联合矩阵构建的系统树(图 3)中，其处于与水苏
属、宝盖草属和豆腐柴属聚合的分支处， 3 个系统树
图 1 基于 matK 的 50% 严格一致树
Fig. 1 Fifty percent strict consensus tree from maximum parsimony for matK
杨金宏等：基于rbcL和matK序列探讨马鞭草科部分植物的系统学位置
120 第21卷热带亚热带植物学报
图 2 基于 rbcL 的 50% 严格一致树
Fig. 2 Fifty percent strict consensus tree from maximum parsimony for rbcL
中的支持率分别是 65%、92% 和 95%。马鞭草属 3
种马鞭草的序列均处于最靠近根目录的位置。
3 讨论
DNA 条形码作为一种新的性状构建分类系
统，实现序列本身变异信息与现有形态分类学的
结合，可以弥补传统分类学方法的不足，加快全球
生物物种分类和鉴定的步伐，自 2003 年 Hebert 等
提出后，已在哺乳动物、鸟类、鱼类、昆虫以及真菌
和藻类等物种的鉴定研究中广泛应用[8–15]。理想
的 DNA 条形码不仅应具有明显的种间变异，同时
种内变异足够小，而且片段应该尽量短，两端连接
应相对保守，可以应用通用引物扩增。而植物因线
粒体基因进化速率相对较慢，且由于植物容易发生
杂交和网状进化，同一基因在不同类群中的进化速
率可能不同，导致人们寻找理想的 DNA 条形码的
研究较动物复杂得多而发展缓慢[6,16]。叶绿体基因
第2期 121
间 隔 区 (trnH-psbA、 atpB-rbcL、 trnC-ycf6、 trnL-F、
rpl36-rps8、 trnK-rpsl6、 ycf6-psbM、 trnV-atpE、 psbM-
trnD 等)和植物系统发育重建研究中常用的 rbcL，
以 及 核 糖 体 DNA 片 段 ITS 是 目 前 使 用 较 多 的
DNA 条形码候选序列及其组合[17–21]，但对每一植物
科或属合适的序列都需进行针对性的探索和研究。
本 文 对 ycf6-psbM、 trnV-atpE、 rbcL、 trnL-F、
psbM-trnD、 atpB-rbcL、 trnC-ycf6、 trnH-psbA、
rpl36-infA-rps8、 ITS 序列是否可作为豆腐柴的理想
条形码序列进行了针对性的探索和研究，结果 ITS
不能得到明显的扩增条带，这可能是生物本身这些
引物位点发生了突变，我们将通过在该区段外设
计引物进行扩增和测序，进一步研究其具体原因。
ycf6-psbM 不能成功测序，而测序成功的 8 条序列
中， trnV-atpE、 psbM-trnD、 atpB-rbcL、 trnC-ycf6、
rpl36-infA-rps8 等 5 条序列存在有部分双峰或噪值
高等问题，这可能是由于豆腐柴本身果胶等多糖物
质含量过高，DNA 纯化不彻底造成的，也可能是
图 3 基于 matK、 rbcL 联合矩阵的 50% 严格一致树
Fig. 3 Fifty percent strict consensus tree from maximum parsimony for combined data of matK and rbcL
杨金宏等：基于rbcL和matK序列探讨马鞭草科部分植物的系统学位置
122 第21卷热带亚热带植物学报
这些引物对豆腐柴的特异性太低，造成存在非特异
性扩增的问题。对 rbcL、 trnH-psbA 和常用的 matK
序列进行分析，trnH-psbA 序列因变异太大，在不
同种属间存在较多的插入 / 缺失和小的 DNA 条形
码序列而不适用于本研究。
本文以马鞭草科和唇形科的部分种属的序列
构建的 3 个最大简约树，与大青属所处的最晚分支
相聚合的种属序列均来自唇形科，这与之前基因鉴
定的结果大青属从马鞭草科划入唇形科的结果一
致[22]。同样的，豆腐柴属在较多情况下也最先与水
苏属和宝盖草属聚合形成的分支聚合，因此也应该
被划入唇形科。马鞭草属属于马鞭草科马鞭草亚
科，是马鞭草科的代表，马鞭草属 3 种马鞭草序列
均处于最靠近根目录的位置，可能这与其在形态分
类学中为马鞭草科代表植物的地位相一致。牡荆
属是牡荆亚科的代表植物，在 3 个系统树中聚合分
类方式均不太相同，对于其系统学地位可能需要更
多的证据。
植物长期生活在野外，自然环境下很容易发生
杂交，进化过程呈网状，系统位置及进化关系比较复
杂。本文选取的核基因序列 ITS 在豆腐柴中没有获
得成功，用于分析的基因序列全部来自马鞭草科和
唇形科的叶绿体基因组，可能会有一定的片面性。
因此，后面将通过更多的方式获取其核基因证据，为
其系统学位置及进化关系的确定提供更多参考。
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