全 文 ：2014 第十六卷 第七期 ★Vol.16 No.7
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
收稿日期：2014-07-02
修回日期：2014-07-18
＊ 广东省科技厅科技计划项目（2012A061600005）：广东省岭南药用植物资源保护与利用企业重点实验室（产学研）培育基地，负责人：王德勤；国家
自然科学基金委青年基金项目（81102764）：基于改进Mauve算法的贯众类药材 DNA条形码序列预测与验证，负责人：马新业；广东省科技厅博士
启动项目（S2011040005237）：广东省水龙骨科药用植物资源 DNA条形码鉴定研究，负责人：马新业；广东省教育厅高等院校学科与专业建设专项
（重点实验室滚动支持）（2013CXZDA011）：春砂仁等“十大广药”DNA条形码标准化研究，负责人：陈蔚文。
＊＊ 通讯作者：马新业，副研究员，主要研究方向：中药资源学；陈蔚文，本刊编委，教授，主要研究方向：中药资源保护与合理开发利用。
溪黄草DNA条形码鉴定研究＊
张慧晔 1，刘 锋 2，王德勤 1，詹若挺 2，马新业 2＊＊，陈蔚文 2＊＊
（1. 广州白云山和记黄埔中药有限公司 广州 510515；
2. 广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心/岭南中药资源教育部重点实验室 广州 510006）
摘 要：目的：研究 DNA 条形码技术在溪黄草药材品种鉴定中的适用性。方法：选取 rbcL、psbA-trnH、
matK和 ITS2等 4 个条形码标记，对 41 份溪黄草药材样品（含溪黄草 Rabdosia serra、线纹香茶菜 R. lo－
phanthoides和纤花香茶菜 R. lophanthoides var. graciliflora）进行 DNA 提取、PCR扩增及双向测序，对测序结
果进行质量检查、人工校对和序列拼接获取标准碱基序列信息，通过比较序列获得成功率以及物种鉴定力
（TaxonGap 法），筛选适合溪黄草基原鉴定的 DNA 条形码序列。结果：条形码序列获得成功率依次为 rbcL
（100%）、psbA-trnH（90.2%）、ITS2（87.8%）和 matK（70.7%）；物种鉴定力方面，rbcL、psbA-trnH 和 ITS2 等 3
条序列均可有效鉴定不同物种，但不适于分辨种下单位。结论：综合考察序列易得性和物种鉴定力，rbcL
可作为溪黄草品种鉴定的首选条形码。
关键词：溪黄草 DNA条形码 rbcL 鉴定
doi: 10.11842/wst.2014.07.008 中图分类号：R285.5 文献标识码：A
溪黄草是民间习用草药，因其喜生于山谷阴溪
旁，新鲜叶片捣碎有黄汁而出名，俗称溪勾草、山羊
面、台湾延胡索等，主产于长江以南各省，具有清热利
湿、利胆退黄、散瘀等功效，是消炎利胆片、胆石通胶
囊等的主要成分[1]。目前溪黄草药材来源存在争议，民
间传统使用的溪黄草药材为唇形科植物线纹香茶菜
Rabdosia lophanthoides及其变种纤（细）花线纹香茶菜
R. lophanthoides var. graciliflora 的干燥全草，在商品
市场上作为溪黄草药材流通的还有溪黄草 R. serra
等的干燥地上部分[2，3]。为保障用药安全和临床疗效，
众多研究者分别从外观形态 [4]、显微特征 [5]和 RAPD
分子标记[6，7]等多个方面对不同来源溪黄草品种进行
鉴别，但由于外观形态囿于植物发育时间、显微特征
多为描述性指标、RAPD 分子标记实验重复性差等
诸多因素而不利于实际操作。作为被国内外广泛
关注和肯定的新型物种识别方案—DNA 条形码技
术 [8~10]有望实现利用标准化方法快速、准确鉴定不同
溪黄草基原的目的，但目前尚未见相关报道。
本文通过广泛采样，比较 rbcL、matK、psbA -
trnH 和 ITS2 等 4 个热点推荐分子标记的序列获得
率和物种鉴定力等指标，考察 DNA 条形码技术在
溪黄草基原鉴定中的可行性。
1 实验材料与方法
1.1 材料
溪黄草、线纹香茶菜和纤花香茶菜共 41 份植
物样品由广州白云山和记黄埔中药有限公司采集，
由中国科学院华南植物园叶华谷研究员鉴定，如表1
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所示。实验数据已上传 GenBank，登录号分别为：
rbcL 序列 KM208821 -KM208861、psbA -trnH 序列
KM208765 -KM208801、matK 序 列 KM208736 -
KM208764、ITS2 序列 KM208701-KM208735。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取、PCR 扩增及测序
称取 30 mg 硅胶干燥叶片，液氮研磨，使用植
物基因组 DNA 试剂盒（天根生物技术公司）提取总
DNA，参照文献方法 [11]对 rbcL、matK、psbA-trnH 和
ITS2 等 4 条序列进行 PCR 扩增并直接双向测序
（ABI 3730XL 测序仪）。
1.2.2 数据处理和分析
测序原始峰图通过 CodonCode Aligner 软件（V
3.7）进行查看、拼接和校对，以碱基质量（QV）不低
于 20 为标准。使用 TaxonGap 软件 [12]进行物种鉴定
力分析，以最大种内遗传距离描述种内变异程度
（异质性），以最小种间遗传距离衡量种间变异状况
（可分离性），结果以数据表格和示意图形式分别展
示。遗传距离由相似性矩阵获得，相似性矩阵由软
件 MatGat（V 2.01）[13]计算。
2 结果与分析
2.1 PCR 成功率和测序成功率统计
利用文献 [11]报道的通用方法，实验结果如图 1
所示，全部 41 份样品均获得 ITS2、psbA-trnH 及 rb－
cL 等 3 条序列的 PCR 产物，成功率均为 100%，39
份样品获得 matK 序列的 PCR 产物，成功率为
95.1%。常规测序分别获得 41 条（100%）rbcL 序列，
37 条（90.2%）psbA-trnH 序列，36 条（87.8%）ITS2
序列和 29 条（70.7%）matK 序列。因此，考虑在常规
实验条件和方法下的序列信息易得性，rbcL 最适合
作为溪黄草真伪鉴定的条形码使用，matK 的 PCR
成功率和测序成功率最不理想。
表 1 溪黄草实验样品
拉丁名 中文名（俗称） 材料数 采集地点
R. serra 溪黄草（苦草） 5 广东和平县
1 广东清远
R. lophanthoides var. graciliflora 纤花香茶菜（甜草） 7 广东和平县
6 福建下坝老虎站
6 广东平远大塘里
9 广东平远苏坑里
R. lophanthoides 线纹香茶菜（甜草） 6 福建下坝龙牙塘
1 广东平远苏坑里（栽培种）
图 1 溪黄草样品不同序列 PCR 成功率与测序成功率对比
表 1 溪黄草不同品种的条形码鉴定结果（TaxonGap 法）
条形码序列 品种 异质性 可分离性 最近邻居品种
ITS2 Rs 4.8 15.1 Rlvg
Rlvg 1.4 0 R1
psbA-trnH R1 0 0 Rlvg
Rs 3.9 25.4 Rlvg和 R1
Rlvg 0 0 R1
rbcL R1 0 0 Rlvg
Rs 0 1.4 Rlvg和 R1
Rlvg 0 0 R1
matK R1 0 0 Rlvg
Rlvg 0 0 R1
R1 0 0 Rlvg
注：Rs. 溪黄草 R. serra，Rlvg. 纤花香茶菜 R. lophanthoides var.
graciliflora，Rl.线纹香茶菜 R. lophanthoides。
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2.2 物种鉴定力分析
将所有 4 种标记的可用条形码序列输入 Mat－
Gat 软件计算获得遗传相似性矩阵，再经 TaxonGap
软件分析，结果见表 1 和图 2。除 matK 序列数据缺
失导致无法分析外，以 ITS2、psbA-trnH 及 rbcL 等 3
条序列为分子标记，溪黄草（Rs）与其他品种间存在
最小遗传距离（深色 bar），分别为 psbA-trnH 序列距
离 25.4、ITS2 序列距离 15.1 和 rbcL 序列距离 1.4，
表明 3 个序列均能有效将溪黄草（Rs）和线纹香茶
菜 Rl（及变种 Rlvg）分开；就溪黄草（Rs）种内异质性
（浅色 bar）而言，ITS2 和 psbA-trnH 序列变异明显，
最大遗传距离分别为 4.8 和 3.9，rbcL 序列一致性
较好，所有种内序列均相同。分析结果还显示，所有
4 个条形码均不能有效鉴别线纹香茶菜 Rl 和纤花
线纹香茶菜 Rlvg，其品种间遗传距离均为 0（品种内
除 ITS2 序列外遗传距离也为 0），这与条形码技术
通常不用于鉴别种下单位的常识相吻合。
因此，考虑到 rbcL 序列在溪黄草（Rs）和线纹香
茶菜 Rl（含变种 Rlvg）样品间存在 7 个位点的变异
（图 3），可有效区分不同物种（图 4），而且种内不存
在变异，较其他标记更适宜作为优选 DNA 条形码
进行实际鉴定操作。
3 讨论
DNA 条形码技术已成功应用于中药材多基原
以及混伪品鉴定 [14~17]。无论目前溪黄草药材多来源
的现象属于多基原还是混伪品，本文研究结果表明
该技术适用于高效分辨溪黄草药材不同来源物种
（但不能区分种下单位），可开发为新型鉴别方案，
在操作上较以往基于形态、显微特征和 RAPD 分子
标记等鉴别的技术更为便利。
2010 版《中国药典》增补本已收载“中药材 DNA
条形码分子鉴定指导原则”[18]，指出植物类药材分
子鉴定体系应以 ITS2 为核心、psbA-trnH 为辅助，
但对于具体品种仍需考察方法适用性。本文对溪黄
草药材品种鉴定实验表明，ITS2、psbA-trnH 和 rbcL
等均可作为条形码标记使用。考虑到序列更容易
获得和种内变异更小，推荐 rbcL 作为溪黄草鉴定
首选条形码序列，ITS2 和 psbA-trnH 在实际应用中
需对个别样品测序技术和种内变异问题加以调整
和完善。
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图 2 溪黄草不同品种的条形码鉴定结果示意图（TaxonGap 法）
注：深色 bar 表示种间最小遗传距离，浅色 bar 表示种内最大遗传距离；Rs、Rlvg 和 Rl 代表品种同表 1。
图 3 溪黄草不同品种 rbcL 序列变异位点
图 4 基于 rbcL 序列构建溪黄草品种 NJ 树
ITS2 psbA-trnH rbcL matK
R1vg
R1vg R1vg
R1R1
R1vg
R1vg
R1
R1vg
R1vg
R1R1vg
R1
Rs
RI
RIvg
Rs
[ 122334]
[ 8146696]
[ 4003966]
Rs ATGCGAG
Rl GGATCTT
Rlvg GGATCTT
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Differentiation on Original Plants of Xi-Huang-Cao through DNA Barcodes
Zhang Huiye1, Liu Feng2, Wang Deqin1, Zhan Ruoting2, Ma Xinye2, Chen Weiwen2
(1. Hutchison Whampoa Guangzhou Baiyunshan Chinese Medicine Company Ltd., Guangzhou 510515, China;
2. Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering, Key Laboratory of Chinese Medicinal
Resource from Lingnan, Ministry of Education, Guangzhou University of Chinese Medicine,
Guangzhou 510006, China)
Abstract: This study was aimed to identify original plants of Xi-Huang-Cao (XHC) through DNA barcodes. The nu-
cleotide sequence information of rbcL, psbA-trnH, matK and ITS2 regions were abstracted using standardized man-
ners from 41 samples (including Rabdosia serra, R. lophanthoides and R. lophanthoides var. graciliflora). Sequencing
efficiency of each marker was calculated. Species identification capability was tested on the basis of TaxonGap. The
results showed that sequence success rates were 100% for rbcL, 90.2% for psbA-trnH, 87.8% for ITS2, and 70.7%
for matK. Three markers (rbcL, psbA-trnH and ITS2) were competent for species discrimination (not for subspecies).
It was concluded that rbcL can be the preferred barcode for XHC because of its convenience and efficacy.
Keywords: Xi-Huang-Cao, DNA barcodes, rbcL, identification
（责任编辑：张丰丰 张志华，责任译审：王 晶）
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