全 文 ：核 农 半 报 。。 , , 恋一
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放射免疫法测定畜产品中的己烯雌酚
黄世乐 陈祖义 冰
南京农业大学同位素应用教研室 一 一
成
京南
本文采用 一 一 复合物 免疫家兔
, 制 备 兔抗 杭 血 清 。 其 滴
度 为 , 亲和常数为 “
, 与 己 烷雌酚和双烯雌酚 的 交叉反 应 分
别 为 和 , 与 日一雌二醇
、 孕酮 、 甲地孕酮 、 带酮和 丙 酸争酮 的 交又
反应均 。
’ 。 应 用制得 的杭血清 , 建立 了 的放射兔疫测 定法 。 其最小 检 测
量 为 管 , 平均回收率 土 , 批 内和批 间变异 系数分别 为 和 ,
表明本法灵敏
、
可 靠 , 适 于 大批样品 的常规 筛检
。
关健词 乙 烯雌酚 杭体 放射 免疫测 定
前 言
己烯雌酚 , 是一种人工合成的茂类 雌激素 。
当作为生长促进剂用于畜禽的催肥与增重时 , 肉品 中残 留的 对人类健康有潜在危 险 致
癌
。 目前 , 世 界上很多国家 已规定该药禁止用作饲料添加剂 〔‘
。
但 由子 经济有效 ,
仍有人违法使用它 。 为了保护人民健康 , 保证外贸产品质量 , 寻找一种简便实用监测畜产品
中 残留量的方法具有重要现实意义
。
国内外学者 已先后应用生物测定法 小鼠子宫称重法
、 比色法
、
荧光测定法和纸层析
法 〔 , 气浪色谱 “ 气 气谱 质谱 〔 ”以及高压液相色谱 〔们等分析技术进行生物 样 品 中
的检测 。 这些方法或灵敏度有限 , 或操作 尤其是样品 前处理 繁琐 。 而 放 射
免疫测定法 具有灵敏 一 。一 一 ‘“
、
特异
、
简 便 、 快 速 等 优 点 。
等 【“ 〕首先报道了 的 , 之后 , 又有许多学者从不同的 角度研究了 的 , 并将之
成功地用于牛 肉
、 肝 、 肾
、
脂肪等中 残 留的检测 〔“
‘一 。 〕。 关于 的 , 目前国外 已
有商品药盒供应 〔“ 〕 , 而国内尚未见报道
。 本文参考 等的方法 , 采用混合 酸 醉 法
合成的 免疫原 , 制得 抗血清 , 并应用它建立了灵敏
、
特异
、
简便的 。
材 料 与 方 法
药品与试剂 己烯雌酚 和双烯雌酚 , 美国 公司 己 烷 雌 酚
, 上海第十二制药厂 日、雌二醇
、 孕酮 ‘ 和 肇酮 , 上 海 内
此文于 年 月 日收到
弘
‘
核 农 学 报 卷
一
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分泌研究所 甲地孕酮和丙酸攀酮 , 上海第九制药厂 “ 一单 乙基标记的己烯雌酚丈 。 。
一 一 , ” 一 , , 英 国
公司 氯 甲酸异丁醋 , , 上海东风农药 厂 三正 丁 胺 , , 瑞士 公司
牛血清白蛋 白 丑 , 电泳纯 , 中国科学院上海生物化学研究所 。 实验所用其它 试 剂 均
为 级 。
免疫原的合成 按前文 〔‘ ” 」报道的混合酸醉法合成 一 一 复合物 。
抗血清的制备 选 只 一 月龄
、
健壮
、
无人工免 疫 史
、
体重 士 只的 雄性新
西兰白兔 江苏省农业科学院畜牧兽医研究所动物房提供 进行 免疫 注射 。 一 一
冻干粉用生理盐水溶解 , 配成 浓度的溶液 , 然后 与等体积的 氏 完 全 佐
剂 乳化 , 在兔足垫及背部皮 内多点注射 , 剂量为 只 。 周 后重复 次基础免疫
。 之后 ,
每隔 天加强注射 次 , 剂量减半 , 并改用 。 氏不完全佐剂乳化 抗 原 。 每次 加 强注射
后的 一 。天于兔耳缘静脉采集少量血液
, 检测抗血清的产生与质量
。 ’
一旦发现抗血 清 质量
合格 , 即对动物行颈动脉全采血 , 制 备抗血清
。 抗血清加 终浓度为 防 腐 , 分
装后于一 ℃贮存备用 。
样品的制备 猪肉 肉泥
、 鸡蛋 匀浆 或牛奶等 , 分别取 各加 甲醇 , 旋涡混
合 , 然后于室温下静置 , 离心 ,
, 取上清液 。 沉 淀 物加
甲醇重提 次 , 合并两次提取液 , 于 ℃烘干
。
残渣加 甲醇溶解 , 置 ℃冰箱待 测
。
放射免疫测定 分别用甲醇将 一 稀释成 件 , 将 配 成
、 、
、 、 、 和 卜 作为标准液 。 用 含 明胶 、
。 硫柳汞的 作为抗血清和活性炭 分离剂 的制备液 。 平行三管或双 管 进 行 标
准 曲线和样液的测定 。 总计数管
、 非特性 结合管 和零标准管 。 各 加 书
甲醇 , 标准管 一 , 由稀至浓分别加入 时不同浓度的 标准 , 样品管 加 川
待测液 , 然后 向各管中加 时 “ 一 溶液 , 室温自然风干 。 、
、 。 、 一 及 管 分
别加 、
、 、 、 件 , 旋涡混合 后 , 句 。 、 一 及 管 中分别加人
时稀释抗血清
,
混匀 , 置 ℃孵育 , 接着 向各管 除 管 中加入 时 葡聚糖衣
时用活性炭
, 混匀 , 置 ℃孵育 后离心 , , ℃ 。 于各管中准确吸出
上清液 , 置 烁瓶 ,二卜, , 力一 闪烁液 一 闪 烁 依 ,
一 型液休闪烁计数器测定结合型 “ 一 的放射性活度 。 将测得的 数 据
进行换算 , 以标准 含量的对数值 〔 〕 为横坐标 , 标 准 管 。 〕
值为纵坐标 , 绘制标准 曲线
。 然后根据样品管 〔 。 〕值 , 从标准 曲线 上 查 出
含量 。
结 果 与 讨 论
一 抗血清的特性
用 一 一 免疫家兔 , 制得 抗血清 。 兔抗 一 一 抗血清
号兔 结合 一 的滴 度为 图 , 亲 和 常 数 为
作 图法 , 与 类似物交叉反应 的钡, 定结果 ,法 如表 所示
。
表 」表明 , 抗血清 与 类似物的交叉反应率均 , 较 等 〔 ” 」制备 的
期 放射免疫法测定畜产品中的己烯雌酚
水
炭
工 图 抗体滴 度曲线
、 一 为只
互 分 卫
抗体稀释度
尽
表 兔抗 抗血清与 类似物的交叉反应性
一 ‘ 示
化 合 物 交叉反应率 一 肠
己烷雌酚
双烯雌酚 。
灯 日二雌二醇 一
孕 酮
甲地孕酮 卜
肇 酮
丙酸肇酮 一
生
主
抗血清特异性强
‘
, 与 。 等 〔。 了的 抗血清特异性相 近 , 表明该 抗 血 清 符 合
的要求 。
,
二 样品的提取率
取 时 “ 一 加入样品中 , 按前述程序提取样品 , 然后从 待检液中吸出 时
个重复 置闪烁瓶中 。 另取 时 个重复 上述“ 一 液
, 直接加至闪烁瓶中 , 最
后 于两组闪烁瓶中各加 闪烁液 , 测 量其放射性话度
。 以样品平均 与“ 一
平均 相 比 , 求得样品 的提取率 。 猪 肉 , 鸡蛋和牛奶中 的提取率分 别 为 土
二
一
, 。 哇土 二 和 。 土 。
三 的标准曲线
按 的 程序 , 用结合“ 一 的抗血清稀液与系列 标准液反应 建 立
标准 曲线 , 以 幼 〔 。 〕对 〔 〕作图
, 所得典型标准 曲线如图 所示 , 其
’
直 线
回归方程为
’
一 一 。。 。
应用 。等 〔“ ’ “ 效点系统 ” 法检验 , 上述标准 曲线总分达 分 表 , 表明它达
到一般 的优级质量控制标准
。
四 方法的可靠性
、
灵敏度 按 法求出标准 曲线 最 小检测 量为 管 , 相 当于 , 与
核 农 学 报 弓卷
汗翻 州
图 标准曲线
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、
表 标准曲线得分表
指 标 比率范围 率郭》
零标准管结合率 “
取代 比率
百分精密度 肠
百分准确度 肠
灵 敏 度
总 分
。一 日
一
一
一 了
一
、
等 〔 和 飞 等 〔吕 ’的结果 一 相近
, 较 林永寿等 “ 的气液色谱法
和 等 〔‘ 的高压 液相 色谱法 。 灵敏 , 表明本法灵敏度较高
。
准确性 平均 回收率 外加标准品法 为 土
。 稀 释 样 品提取液的
测定值具有 良好的平行性 , 表明通过 回收率的校正 , 所得结果可靠
。
精密度 批 内变 异 系 数 为 一
, 平均 为 , 批间变 异系
数 为 一 , 平均为 二 , 表明本法重复性较好 。
非特异性结合率 样品提取液 的 稍高于 甲醇的 , 二者分别为 土
和 。土 。 二 , 表明提取液中的基质 如 脂 质 等 对测定有一定的影
响 。 为了保证实验结果的准确性 , 每次应测定样品提取液的 。
此外 , 本法样品制 备简单 。 样品经 甲醇提取后 , 无需进一步 的 纯 化 处理 , 就可进行 测
定 , 对于 血装
、 肌肉挤压 液和脱脂奶粉等也可直接进行测定 , 优于其它分析方法 。 因此 , 本
法可供外贸商检
、
基层卫检 以及药理和毒理研究单位对大批 样 品 中的 进行微 量检测 。
参考文献
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