全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，l4(6)：451-459
Journal ofTropical and SubtropicalBotany
逆境诱导水稻谷胱甘肽合成酶基因的表达研究
麦维军，曾纪晴，张明永 ，
(中国科学院华南植物园，广州 510650)
蔡昭艳
摘 要 ：用 RACE方 法获 得 了全长 的水稻 谷 胱甘肽 合 成酶 (GS)基 因 的 cDNA，并命 名 为 OsGS(GeneBank
accessionNo．：AY453405)。该 cDNA全长 1 892 bp，编码一个由540个氨基酸组成的多肽，预测其氨基端 (N端)含有
一 段定位叶绿体的信号肽。比较水稻基因组定位结果表明 OsGS基因位于水稻 l2号染色体短臂上，转录区全长
6 321 bp，由 12个外显子和 11个内含子组成。通过 RT—PCR对 OsGS在水稻正常生长条件和逆境条件下的表达进行
了研究。结果表明，在正常生长条件下，OsGS在水稻幼苗的根和叶以及抽穗期水稻的根中表达：但不在抽穗期水稻的
叶、茎和幼穗中表达，这显示 OsGS在水稻中的表达具有发育和组织特异性。利用抽穗期水稻的叶片为材料，经高温、
干旱和重金属逆境处理后，OsGS在抽穗期叶片中的转录被诱导表达；而在盐、低温、伤害逆境下则不被诱导。在轻度和
中度干旱胁迫4 h后 OsGS基因可被诱导表达。外源 ABA处理也能够提高 OsGS的转录水平，这显示 OsGS可能是依
赖 ABA信号途径的环境胁迫诱导基因。
关键词：水稻；谷胱甘肽合成酶基因；基因表达；胁迫
中图分类号 ：Q786 文献标 识码 ：A 文章编号 ：1005—3395(2006)06—0451—09
Stress Inducible Expression Analysis of Glutathione Synthetase Gene
in Rice(Oryza sativa)
MAI Wei—jun，ZENG J i-qing，ZHANG Ming—yong’，CAI Zhao—yan
(South China Botanical Garden，the Chinese Academy ofSciences，Guangzhou 510650，China)
Abstract：A ful—length cDNA of rice(Oryza sativa L．)glutathione synthetase(GS)gene was obtained by 5’一
RACE(rapid amplifcation of 5’一complementary DNA ends)，and the gene was named as Os GS fGeneBank
accession No．：AY453405)．The l 892 bp cDNA contained an open reading frame(0RF)encoding a polypeptide
of 540 amino acid residues with a predicted signal peptide of chloroplast． The alignment of Os GS cDNA with the
mapped genome sequences office indicated that OsGS is located in the short arm office chromosome l2． an d the
transcript region f6 32 1 bp)of this gene consists of 1 2 extrons and ll introns．The transcriptions of Os GS in rice
under normal and stress conditions were studied by RT PCR method．The results showed thatI un der norm al condi
tions，the transcriptions of Os GS could be detected in roots，leaves of one week old seedlings and roots of heading
rice，but not in leaves，stems and spikes of heading rice．This result indicated that the expression of Os GS conforillS
to a spatio—temporal pa~ern．Under stress conditions，the expression of Os GS in the leaves of heading rice
demonstrated that the transcription of OsGS was strongly induced by heat shock(40"C)，cadmium and drought；but
not by salt，low temperature and woun d．Further transcription an alysis showed that Os GS expression was strongly
induced by mild and medium drought stress for 4 hours． In addition
， the exogenous ABA could induce the
transcfiption of Os GS in the leaves of flowering rice，suggesting that the response of Os GS to drOught might be
收稿 日期：2006—03—02 接受 日期 ：2006—08—04
基金项目：广东省自然科学基金项 目(06026070)，广东省科技计划项 目(2006A2010101M)，国家自然科学基金(3O67Ol69)资助
通讯作者 Coresponding author
维普资讯 http://www.cqvip.com
452 热带亚热带植物学报 第 14卷
mediated by ABA—dependent pathway．
Key words：Oryza sativa；Glutatione synthetase gene；Expression；Stress
谷胱甘肽(glutathione，GSH)是生物体内的一种
重要小分子三肽化合物。GSH作为生物体内最主要
的非蛋白巯基，是细胞内主要的还原型物质。它可
以调节细胞内的氧化还原状态，维持硫醇和二氧化
硫的平衡，保护生物体内蛋白质的巯基 (一SH)，对
内、外源性毒物具有解毒作用。GSH作为植物体内
重要的抗氧化剂可以降低各种逆境胁迫中产生的
活性氧的积累，减轻活性氧对植物体的伤害。GSH
还可能是逆境条件下的信号传递物之-(1l，可能涉
及植物程序化死亡的诱导[21，促进抵御真菌感染的
各种基因转录[31。
生物体内的GSH是在 y^一谷氨酰半胱氨酸合成
酶 ( 一ECS，EC 6．3．2．2)及谷胱甘肽合成酶(GS，EC
6．3．2．31的催化作用下，通过两个依赖 ATP提供能
量的反应，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成的。因
为GSH可通过反馈抑制调控 y^—ECS的活性，^y—ECS
被认为是 GSH生物合成途径中的限速酶 】。但是，
在某些逆境条件下 一ECS是否可作为 GSH合成途
径中的关键酶仍有争议。比如，在 Cd胁迫条件下，
y^—ECS可能不再是GSH合成的限制性酶，因为 Cd
胁迫会消耗植物体内的GSH，GSH对 y^—ECS的反
馈抑制被解除，而 GSH合成酶活性在 Cd胁迫下受
到抑制，因此 GSH合成酶可能成为 GSH合成途径
的限制酶[61。研究发现，过量表达 GSH合成酶基因
的印度芥菜(Brassica unce 比野生型具有更高的
GSH含量和更高的植物螯合肽(PC)合成能力，结果
也提高了植株对 Cd的抗性，而且转化植株体内能
积累更多的 Cdt61。因此，GSH合成酶在植物的抗逆
性反应中具有不可忽视的作用。
Ulmann等 在 1996年 首 次 从 拟 南 芥
rabidopsis thaliana)中 克 隆 了植 物 GSH 合 成
酶基因[71。此后 ，植物谷胱甘肽 合成酶基 因陆
续在豌豆 (Pisum sativum)[81、蒺藜状苜蓿 (Medicago
truneatula) 、大豆 (Glyeine max)、玉米 n mays)、小
麦 (Triticum aestivum)【1 0]和百日菊Zinnia elegans) “
等植物中被克隆，但迄今还没有水稻 GSH合成酶
基因被克隆的报道。因此，克隆水稻 GSH合成酶基
因并研究其在水稻中的功能，对了解 GSH在水稻
生长发育与抗逆的作用具有一定的意义。本文报道
了水稻 GSH合成酶基因的克隆和在水稻中的逆境
诱导表达分析的初步结果。
1材料和方法
1．1材料
水稻(Oryza sativa L．CV．Nipponbare)来源于 日
本水稻资源 中心 。EST克隆 (R3434、S21515和
S1893)来自目本水稻基因组计划 (RGP)。
1．2 水稻总 RNA的提取
剪取开花期水稻叶片 200 mg(每叶片取中部
2 cm)，采用 Qiagen公司的RNeasy Plant Mini Kit提
取水稻 叶片 总 RNA。经 RNase flee的 DNase I
(TaKaRa)处理，以去除可能的DNA污染。
1．3 5’一RACE
用 于 5’一RACE(rapid amplifcation of 5’
complementary DNA ends)的水稻谷胱甘肽合成酶
基因的特异引物为：5’一TCA CCA CTT TTG TCA
AGT GCA TAT AC一3’。扩增出来的片断经测序 (上
海联众基因公司 )确认后用 BamHI酶切 ，再将
OsGS cDNA的3’一和 5’一端连接起来，以得到水稻
GSH合成酶基 因的全长 cDNA，操作方法参见
Clontech公司的 SMART RACE cDNA Amplifcation
Kit操作手册。
1．4 RT—PCR
扩 增 OsGS mRNA 的 引物 为 ：Primer R，5’一
CTG CAT TAG GAT GTA GGC TGC：Primer L，5’一
TGG GAA CAC AGC AAT TGC TC。
为了检测水稻 OsGS cDNA的表达，将组成性表
达 的水 稻 Actin基 因 mRNA (GenBank登 录 号 ：
AB047313)作为 OsGS mRNA半定量 RT—PCR的内
标。扩增Actin mRNA的引物根据 AB047313设计
为 ：Actin L primer： 5’一CCG GAA TTC CGG ATG
TCA TTT TCG：Actin R primer： 5’一GGG TTC GAA
CCCAATAGTCAC AAA。
一 步 法 RT—PCR 采 用 Promega公 司 的
AccessQuickTM RT—PCR System进行。逆转录 (RT)
反应条件为：37~C保温 15 min后再在 42~C保温
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 6期 麦维军等：逆境诱导水稻谷胱甘肽合成酶基因的表达研究 453
30 min，94~C灭活逆转录酶 2 min后进行 PCR扩增
反应。PCR反应条件为：94~C 45 S，60~C 45 S，72℃
1 min，共 29个循环；最后72~C扩展 5 min。取 2O l
反应液在 2％的琼脂糖上电泳并拍照记录结果。
1．5OsGS基因的结构分析
基 因组和 cDNA序列 比对在 NCBI(htp：／
、^r、^r、^r．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST／ 口 http：／／www．ncbi．
nlm．nih．gov／BLAST／Genome／PlantBlast．shtml?2)上进
行。OsGS cDNA序列在 expasy(htp：／www．expasy．
ch／tools／dna．htm1)进行翻译，预测水稻 GSH合成酶
的一级结构和大小。OsGS编码的多肽氨基酸序列
在 htp：／wolfpsort．seq．cbrc．jp／上用 PSORT软件预
测 其 在 细胞 中 的 定 位 。在 htp：lwww．cbs．dtu．
dk／services／ChloroP／上用 ChloroP 1．1软件预测信
号肽片断长度 。氨基酸序列同源性分析在 htp：
／clustalw．genome．jp／上利用 CLUSTAL W(1．83)软
件进行。利用 Phylip和Treeview建立谷胱甘肽合成
酶的进化树并分析。
1．6水稻的逆境处理
不同逆境胁迫处理 取开花期水稻叶片 (每
叶片取中部2 cm)，浸泡于各种处理液中以模拟各
种逆境。各种处理如无特殊说明，均在 25~C下进行。
低温处理：水稻叶片于双蒸水中 lO℃浸泡 24 h；高
温处理：水稻叶片于双蒸水中 4O℃浸泡 2 h；盐胁
迫处 理 ：水 稻叶片 于 100 mmol／L NaC1中浸泡
24 h；干旱处理：水稻叶片于 lO％ PEG(FW=6000，
纯度I>99％，Sigma)中浸泡 24 h；伤害处理：取最上
一 片叶切成 l cm段浸水中24 h；重金属处理：水稻
叶片于 100 ixmol／L乙酸镉(Cd(CH3COO)2)中浸泡
24 h；以上溶液均加入0．01％Triton一100。
不同浓度 PEG干旱胁迫处理 剪取开花期
水稻叶片 (每叶片取中部 2 cm)，浸泡于 O％、5％、
10％、l5％、20％、25％ 和 30％ PEG(FW=6000，纯
度≥99％，Sigm a)水溶液 24 h(加入 0．01％ Triton-
lOO)。
不同时期干旱胁迫处理 将开花期水稻移
栽到2 000 cm2花盆中，一株一盆，正常浇水 10 d后
停止浇水，从停止浇水当天开始每隔 3 d从一盆水
稻中剪取 200 mg叶片用于提取总RNA，一直持续
到第 2l天。
不同外源信号分子处理 剪取开花期水稻
叶片 (每叶片取中部 2 cm)，浸泡于 O．5 mmol／L水
杨酸 (SA，salicylic acid)、0．5 mmol／L脱落酸
(ABA，abscisic acid)和 l％过氧化氢 (H202)溶液
24 h(加入 0．0l％ Triton-l00)。
2结果和分析
2．1谷胱甘肽合成酶基因的结构
利用拟南芥 的谷胱甘肽合成酶基 因 cDNA
(X834l1)与 GenBank中水稻 EST进行同源分析后
发现 3个 EST克隆可能是水稻 GSH合成酶基因的
EST克 隆 ，从 日本 RGP获 得 了这 3个 克 隆
(S215 12、S1393、R3434)。对获得的3个 EST克隆
进行测序后，结果发现 R3434克隆与其它植物的
GSH合成酶基因完整序列具有很高的同源性，但不
是全长的cDNA，缺少 5’端。于是通过 5’一RACE的
方法获得全长的水稻 GSH合成酶基因的 cDNA
(GenBank登 录 号 ：AY453405)。 该 序 列 全 长
l 892 bp，阅读框介于 +28与 +l 650 bp之间，与水
稻基因组比较，结果表明水稻谷胱甘肽合成酶基因
转录区全长 6 32l bp，位于水稻 l2号染色体短臂
上，含有 12个外显子和 l1个内含子 (图 1)，除第6
个内含子按 AT／AC方式剪切外，其余 lO个内含子
3 8．1 46O4．I 4898-l5063．1 521．I 5468．1 5686． 9 7 Il2 I342 07 I7 5956． 632l
图 1水稻 OsGS基因结构示意图
Fig．1 The genomic structure ofrice glutathione synthetase gene(OsGS)
方框表示外显子，三角形表示内含子，数字表示外显子和内含子的大小。
The relative positions and sizes ofthe exons an d introns are indicated by boxes and trian gles respectively
■ ． ．
、
一瞬， 、
，
，
，
、 、
、
一 、 、 、
，
一 、
～ 兽＼
一 、、
，
一年
～ 、、
一， ，
～ ，．、 、一弘如、 ，、、
维普资讯 http://www.cqvip.com
454 热带亚热带植物学报 第 l4卷
都严格符合内含子和外显子的 GT／AG剪切规则。
把这一水稻谷胱甘肽合成酶基因命名为 OsGS。取
OsGS转录区上游 2 000 bp DNA序列在 htp：／www．
dna．afic．go．jp／PLACE／signalscan．html上进行顺 式
作用调控元件的搜索，发现了许多与逆境胁迫 (干
旱、高温、低温、病原菌和伤害)和信号传导 (ABA、
乙烯和SA)相关的顺式元件 (表 1)。另外，该启动
子区还发现一些光调控基因所共有的顺式元件 (如
GT．1和 GATA模块)以及真核生物基因所共有的
TATA和 CAAT盒等。
2．2水稻谷胱甘肽合成酶基因编码多肽的一级结构
预测 OsGS cDNA编码一个含有 540个氨基酸
的多肽，其等 电点 (PI)为 6．O1，分子量 (Mw)为
58 969 Da。预测的 OsGS多肽与其它物种已知的谷
胱甘肽合成酶做了聚类比较，发现与其它物种的谷
胱甘肽合成酶有很高的相似性，与小麦谷胱甘肽合
成酶的相似性为 88％。在多肽的C末端具有谷胱甘
肽合成酶多肽均具有的富含甘氨酸的保守序列：
KPQREGGGNN(图2)。用 PSORT II和 ChloroP 1．1
软件发现在 OsGS编码的多肽氨基酸序列 N末端
有 47个氨基酸组成的叶绿体定位信号肽序列，显
示 OsGS的表达产物可能被运输进入叶绿体。
2．3水稻谷胱甘肽合成酶 的进化树分析
从 NCBI获得 18条各物种的谷胱甘肽合成酶
氨基酸序列，利用软件 Phylip生成进化树。进化树
分析结果表明谷胱甘肽合成酶家族可以分成微生
物、动物和植物 3个大类群 (图3)。水稻谷胱甘肽
合成酶与小麦和玉米等单子叶植物的亲缘关系最
近，与豌豆和番茄(Lycopersicon esculentum)等双子
叶植物的亲缘关系较远，与动物和微生物的亲缘关
系最远。这与水稻的进化地位和水稻与其它生物的
亲缘关系相一致。
2．4 水稻谷胱甘肽 合成 酶基 因的组 织表 达特异性
通过 RT．PCR来检测 OsGS的表达，结果表明：
在正常生长条件下，OsGS在水稻幼苗的根和叶以
及开花期的根中表达，但不在开花期的叶、茎和幼
穗中表达，具有发育与组织表达的特异性。从图4
中可见组成性表达的水稻 Actin基因的转录不具组
织与发育特异性 (图4中Actin扩增带)，但 OsGS
的RT．PCR扩增带只在水稻幼苗的根和叶以及开
花期水稻的根中可见 (图4中 OsGS扩增带)。
2．5谷胱甘肽合成酶基因在逆境条件下的诱导表达
以开花期水稻作为逆境诱导实验 的材料 。
RT．PCR结果显示开花期水稻叶片谷胱甘肽合成酶
基因响应各种逆境条件诱导表达的结果 (图5)。高
温、干旱和重金属 Cd可诱导水稻谷胱甘肽合成酶
基因 OsGS在抽穗期叶片中表达 (转录)，而盐、低
温、伤害逆境则不能诱导其表达。这表明水稻谷胱
表 1 OsGS上游序列中与逆境 和信 号传导有 关的顺式元件预测
Table 1 Predicted cis—elements associated with stress and signal conduction within the upstream of OsGS
顺式元件
cis—elements
在OsGS上游的位置
Position of the c／s—elements
within the upstream of OsGS
功能
Predicted functions
DRE2C0REZMRAB17
MYB1AT
MYBC0RE
MYB2C0NSENSUSAT
M YCC0NSENSUSAT
M YCA11三RD 1
HSE
U BC0REATC0R15
ER眦 E4
W BOXATNPR1
W BOXNTERF3
WRKY7 10S
- 698
— 901， 995
231， 一680
— 682
— 1385， 一1115， 一416， 317， 232， 一196
196
— 1382
— 697
- 538
141
141， 一1661
140， 一1217
— 1827， 1487， 1217， 140
ABA和脱水响应元件
ABA和脱水响应元件
ABA和脱水响应元件
ABA和脱水响应元件
ABA和脱水响应元件
干旱胁迫响应元件
热激响应元件
低温响应核心元件
乙烯响应元件
病原菌e1icitor响应元件
sA诱导的wRl(Y识别位点
伤害诱导相关元件
赤霉素信号传导途径转录抑制因子WRKY结合位点
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 6期 麦维军等：逆境诱导水稻谷胱甘肽合成酶基因的表达研究 455
Z 辰
． ，：
．j【
，：
C ．，
Z 五
． ，：
．j【
，：
C急J
Z 辰
． ，：
．j【
，
C
Z 辰
I．■：
．j【√
，
C
Z 属
．
．j【
，
C
Z 最
． ■：
．j【
，：
C
Z 辰
．蠢．1：
j【
，
C
Z 辰
． ■：
．j【
，
C丸
￡ ￡
． ■：
．j【
，：
C
Z 五
． ，：
J
．j【
，
一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一
一 一 ⋯ 一 一 一 一 一 一 一 一 -
l．1G．s G CS S LSY S SS ST C SA T V FS IS S P PS SS SS LK LN PS S FL FQN PK
到 SA F G FG G 工R F S CT 工 P LS薹(Y 工 PP L0 Pl| 珊 NT F FS F FP SS S SS SS S SS S SS IN F SFK P L
一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一
一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 M S S C V S S S 董n 饿 C ^ L P A P P P IJ L ^ 一一
一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 UL A J S G P P S F A S S L G R C R V L P V — ， 蛋 P G G ^ -R P S P L L A
一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 M SD Ptrr工D PE L 工0lCLV lpA LVU S S LH G LW GD采取『 —￡
T L 0 P PLR C G 一 一-R S F 摊 S 0lCP 工蕾 D LElcLD D E 薹 0lCLV Yp A LVU S S LH G L、Ⅳ GD 取 0
PM S 珏 董LT 工N GD E 0N 工工lCPS P L D 1}l尊 工D 00 L LDN 工A Y DA L~F(JA S LH G L LN GDK SY 0
一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 M S囊 PP^期∞lPA囊^ GE 油 船 A 囊 A CS LH G LW GD R—AJD0
S CA S P 巴薹 W G S L冀心 GAE A P S SVA PA A G嚣 S 0^E 瑚fVE 一 矗 A肼 CA艄 G L、Ⅳ GD R GN P
PA R C ^ 矗 AV GT AA P ，E G-G-GI：~IRS g 0G 0 LAV A PA R L、巾 LVE 嚣 A LV U gs 0H G LVV GD 取搠 P
： ： ． 1fr lfr ． ： lfrlfrlfr ： = 竹 _ ：
R SG LV P G-V G割 tA P 工A L L PN S ]p"I>EV 0W蕾 0A CE LA P 工 F陬 L~rD RV S LD GK F L0I>T LS Rl1laK
lCSGN V P GV G LRD~IA P IA L LPT GF PE^ 0A CD V T P L FN E LID lW S LD G蕾CF L0D S LS Rl1laK
K SG量Ⅳ P GV G L 口队 P FS L FPT S F P S ：毛 Q A CD LA P T FN1￡L、 RV S LD GK F LQE S L PR rK Q
R SAT v PGV G L、，H AP FS LL PA H FPE S F讴 0A C】eLA PV FN E L、巾 lW S捌 GN F L0N A L S 孤 0
R S GT v PGV G LV’lAP FS LL PT R FPA S FⅥ (0A C】eLA P工 FN E L、巾 RV S LD GlcF L0 G S LSRT K 0
R S G掣：A PGV G L LH A PFA LL PM S FS r b D 0AV E LA PL FNE L、，】DRV S LD GD F L0E T LA嗣|]．1aE
： ★ ． ． ★ ★ ★ ★ ： ： ★ 青 ★ ： ： ★ ： ★ ★ ． ★ ★ ★ ： ： ： ★ ： ★ ★ ： ★ ： 青 ★ ★ ★ ： ★ ★ ． ★ ★ ★ ： ★ ． ： ★ ： ：
、，】DA F’rSR L LD 工H SR．M L0 工G a D 工R LG LH R SD YM LD E li 门 LL L0 工E L卫谭T 工 SC S FS G LG C L
、，】DV 董叮 S R L LD 工H S a噬LER C】ED 工R L G LH R YM LDE E rN SL L0 工E 列口b r工S CS F PG LSR L
、，】DE 董叮 SR L LD 工H S a噬L0 LN a￡E 工R F G LH R SD YM LDE 0 rK SL L0 工 L卫谭T 工SS S FA G FST L
、，】DD FT S R L LE 工 a 量lE 工瑚1匹 EN 工R L G LH R SD YM LD SE T S SL L0 工E L卫谭T 工SA S F PG LG S L
、，】DD 1 A冀 L LE 工翱 a哪瞳^ “司KE D 工R L G LH R SD YM LD SE rN SL L0 工E L卫谭T 工ST S F PG LG S L
、巾 S 董叮 G R L LD 工 q 既K LN a￡Dv R L G LT R SD YM 工D GAT D 0L L0V E L卫 工ST S SN G LA C G
★ ★ ★ ★
． ★ ★ ★ = ★ ★ ： ★ ： ． 霄 = ★ ： = ★ ： 肯 ★ ★ ★ ★ ★ = ★ ★ ． 青 ★ ★ ： ★ ： 肯 霄 ★ ★ ★ ★ ： ．
V SD LHR S LLS 11aK0 L GLD S0薹c、，P 工N A SA SlcFAE V LAK A WTE Y SN P S^ ，】曩V、n ，0 PGE 王
V S0 LH 0 SL LR SY 6D 0 工 G 工D SER V P IN ’rST 工0 FAD A LAK A W LEY SN P 认 V 唧 工V 0 PE E 王
V r0 LHR Y 工 LT CH 6lcLL G LD SE薹c、，P矗N W AV S0N Ⅱ A LA rJm SEY PRA v 工 r】 Ⅳ 0AE E 薹 N
V SD LHR S L工lc0Y GT S L S LE 列 aW P^点¨ ST 0 F SEA LA 0A W SE F 工D S—W 工删 工V 0 PE E 薹 N
V SE LH口目门 L LN 0Y 6E V L G LD SER 工P致N Ⅵ A A 工0 F AJEA L G蕾rJ VE Y G S^ 气 ●M 工V 0AE E 王
V CE L L工R 0醒 R E L G LD P SW G刹r】 工A 0 雌 A LA GA瑚 f^ E FN N 0S S、Ⅳ LVv v 0 PE E l Y
★ ： ★ ★ ： ： ： ： ： ． ： ： ： ： 书 ： ： ： ： ． ★ ． ★ ★ ★ ： ． ： 吉 ： = = ★ ★ ． 书 ★
0 m L1．AT L旺 辣 睫 S 工R LA E 工D A 0 GK 工 LA D GT L0、巾 G ET vA V 工Y FRA GY A PTD Y
rYt，0H LLS S 工 LB 薯N『工W 工R C rLAE V E KE GSV 0 ED T L IV GG 0AV A ％rV~FR SGY T PND H
rYt，0H F LSA V L K H G 工T 工V誊 r量l 、，】D0 E Gle工 LPD GT LS VN G 0A VlA v 工Y FR A GY T P、，】DY
0Y 玎 LSK H L0D SH G 工1-r工R LS0 、，E ^E G0V LPD GT L LV 6 G 0 VV Y F GY A PND Y
rYt，0Y 玎 L 工搬 zLK E zla 1瞪 r工R C rLA 0 VE AE B LV LPD C》T LVV p e}R PV A VV Y FI G rA P’l1)Y
rYt，0Y 玎 工T vA LRE ■童Y G r 工Rl{ J 工D AE GleLR PD GT LT 工D G L PVA r、 FR A GY T PNI>Y
★ ★ 竹 ★ ： ： ★ ： ： ： ． ： ： ★ ★ ★ ： ．o ： ： ： ★ ： ★ ★ ★ ： ． ★ ★ ★ ★ ： ★ ★ ★ ： ★ ★ ： ★ ★ ：
PSE SE q譬 L LM E S SA 工lCC PS 工 SY H LT Gl1 a V 00E L AJKP蕾 L S FLE N CDD 工 ，】目0E CF
PSE SE W AR L L工E E S S^ V l(C PS 工A Y H-T GS al(工 00E L AJKPGV LE R FLDN 1匹 D I AJKL取 CF
PSE SE 叼墨 L LM E 0 SS^ V l(C PS 工SY H LV Gl1laK工 00E L AJKPGV LER FLE N CDD 工^ 霸 CF
PSE AE W SAR Ll醒 Q S SAV K C PS 工 SY H LV G1 工 QQE LAK PNV LE R FLl(gE E —TD CF
PSE VE 付 SA R L L工E 0 S SA 工lcC PS 工 SYH LV Gl1laK工0 0E L AJKPSV LER F LD NE E D 工 AJKL ClCC F
PSE AE 叼墨 LL 工 CS SA 工lCC PS 工A朋 LV Gl1laK工0 0E L^髓 蕾 LER F LD N ：A】)工E 取 ，】剐KCF
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ： = 青 ★ ★ ★ ： ★ 霄 ★ ★ ★ ： ： ★ ★ ． ★ = ★ ★ ： ★ 青 ★ ★ ★ ★
．
青 ★ ★ ★ ★ ． ． ： ★ ★ = ： ★ ★
A G LW S LDD LDA VK SA 工0lcP
A G LW S LDD SE IVI<0A 工ElcP
A G L W S L D D S D 工 V =ICA 工 E R P
A G L W S L D D E Y 工 工 rA V E lcP
A G L W S L D N E E I V I< S A 工 E lcP
A G L W S L E ND S 工 S A 工 E S P
★ ★ ★ ★ ★ ★ ： ： ： ★ ： ： 肯
K P 0RE GG GN N
K P 0RE GG G删
K P0R E GG G删
K P0RE GG GNN
K P 0R E GG GNN
lcP 0 R E G G G N N
； ★ ： 肯 ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ：
Y GD DVX 嚣 T L LR L 0王口E GSE EE ^ A 工 L
Y GDD V N L LR L0王口E GEE GN ^—A 工 L
Y GD A V )T L IK L 0 c1rGS 0E D ^ A 工 L
Y G LD LRE T LV L0王口EG GDA L^—A 工 L
Y GllD LRE T L工R L 0 GEA L^—A 工 L
Y G D 童L R E T L 工 S L薹{ D G SN E L ^J f工 L
★ ★ ： ： ： ． ★ ： ★ ： ： ： ★ ★ ★ ★ ★
M OR IF PAV F PT V LV曹 G 工CY SE LG 工F S L辣 矬 T V 工 SNE 0C GY L瑚 —W S SSN E
M 0R 工 FPK V SWM F LV 芷 G％rY]II~ IQA I SE LGlw GlA Y LR S妨 C 工V NE 0 SGV L nK工A S SDE
M OR I FPN 工S L捌糊 G GC捌黜 【A 工S E LG 工 FGT Y LR r 目 M蔓m 0 S CIY L nK工S S SDE
M OR I FPK A S PAY LV R G GV C醒 G LA 工S E LG 工Y GlA Y LR r li ，1 工NE 0 CGV L n S S SDE
M OR I FPR A S LT 0 LV 0 G GV C Ir3EE L S I SE L G 工 FG SY LR r ：VV 工N N 0 C GV L — S S SNE
M OR I FP PA S LCY LVI~．I>GT C IP．ENA V S E FG 工 FGA Y LItNI~DR V IINI>0 CC Y LM R-r ：A A S LNE
★ ★ 肯 ★ ★ ★ 青 ： = ★ ． ： ： ★ 霄 = ★ ： ： ． = ★ 青 ★ ． ★ = ★ = ★ ： ★ ． ★ 霄 ★ ★ ★ ★ ★ ： ★ ： ★
G G_、，． A G F Lv L D S LY L 工 一 一
G G L G F GV L D S IY L N 一 一
G G_、，． A G F Ⅳ 工 D S v Y L T 一 一
G G L G F LV L D S LY L T G lC
G G L G F A V L D S 工 L L’l’D E
G G 、 、 A G Y A F L 辩 S V F L T 一 一
★ ★ ★
．
★ 青 ： ．
． ： ： ★ ： ★
图2 水稻谷胱甘肽合成酶 (Gs)蛋白和其它植物GS蛋白氨基酸序列的同源性比较
Fig．2 Amino acid alignment ofglutathione synthetase in various plants
0．S．：水稻Oryza sativa；z．E．：百曰菊Zinnia elegans；A．T．：拟南芥Arobidopsis thaliana；M．T．：蒺藜状苜蓿 Medicago truncatulⅡ：
z．M．：玉米 Zeamays；T．A．：小麦 Triticum aestivum．Gs家族富含甘氨酸的保守区域用方框标记；¨、～ ’表示氨基酸序列相似程度。
Conserved glycine—rich domain ofglutathione synthetase family are boxed；
， ：and．indicate the similarity ofamino acid．
维普资讯 http://www.cqvip.com
456 热带Ⅱ热带值物学报
E hen chia c0妊 、P o 442 5
： y 口c 0cocc“s el0Hg tes＼Q 8D c
Ba 七 ，-
．y 口 lQ D 0D
品 0 口 1 ，| ?D7
N or~ ay ragI ，P D 70p4
胁 “钾 口“昌P lⅣ _P 0 220
H um a n l尸 母 d? 7
4 c4 clav~edfrogIP35668
()， sativa、再 也S i953i
Zea }摊 ysIC E2 8i 7P
占 4d w 自 f IC ． 7
A~red ica go ，1 c口f“ 咀 9
s 研 s n “， L生以 9 7
￡0f“s c 0 l0 s L4 95：99
A rabidop s~s thaha d、c A B5i o27
B ra s~ ca
．，“ cPd IC i 7 占7
Z j l 窖i虚窟 S B A D 27 39 i
Ly cop *r~ co n “ 砑 “ L 矗 7 ?
闺3 符胱 肚台战翦客接的逆化
Fig 3 Phyfogenetic tree ofglutathfo ne svnthe自如 based On the amino sequences
砷名后为酶蛋门 GenBank ’蝻登录号 The proteinsGenBank accessiol^numbc“ Listed fl thc sDeclcs namcs
撮 叶 橇 茎 叶 —劫
第 】4巷
4 水稻柞胜H蓝台成酶摹 的韭I螺 选特并性的RT-PCR~
．htL7
F g 4 RT*PCR analysis ofOsG5 mK＼A Wanst~ ption in rice und 0rmaI c0nditi。T1
I{f RT-PCR 14J总R_NA提取自蛙if-7 d』杓水 幼前的撤 l¨ 段开花划水肆{n0
、 、 乳德 r州日1 RNA forRT-P(R wc
ex【眦 剐 阡0m roots and Jca憾 。day-oldrice Or ro0b
， L。m lea e a spikest~fheadingdee wh Tc undernormal c0nditi
5抽弛l钥水稻I1I J{‘f- s 逆境每卟 r诱导枉这的RI-一PCR结果
Fig 5 RT。PCR analysi s ofO．~GStran~ ption undervarious abiotie stresses
~iftlt；b,kst1。 1 05GS 高 (40℃
，2 b) {：旱tlO％PEG，24 h)和重 勰f1∞ m01n_Cd~CH COO 24 h1旧逆境址雕
诱导表硅，忸 盐(1 DOmmoL,LNaCI-24 h)、低黼(】0℃t24 h1和伤害等逆境处理T 板诱导
． 水稻叭动蛋门蜒 的RT—PCR 物
怍为内标 扩增带为A ctin，0,~GS的 RT-PCR扣 增带 OsG5 0
．~GStranscription pa【ce巾 in【heIcaves headln日 nc。showedthat
E ss 。 ofO could beinduced by hightemperature[40℃ for2 h draught(10皤 PEGlbr 24 h)and heavymetal(1O0 m州1L
Cd(CH!COO}-for 24 hitreatment．but not bysalt(IO0mmoL：LNaC]for 24 fow tcmperature(10℃ r 24 h and w0叫d1rca【menI
斯 24 h RT PcR for OsGTI and 【：tin was carded ott in a same PCR reaction and th㈣i pri e w锹 sh0wed in 1 t Th
e
constitutive expression ofA rf￡ gentwas used as aftintem aI c0n Ln)I
维普资讯 http://www.cqvip.com
第6朝 麦维 等：逆境西导水稻谷脞打肚合成酶基I划的豪达研究
6 f屯朗水帮 川 r丌粹 计脯岢 蝻 小旧 垭于 逆境下i1勺瞒导挺逃
Fig 6 The inducible expression off)sGS in the leaves ofheading rice under diferent strength ofdmtIght
㈦ 经不 津艇 PEG脱水处埋后 门水幅 眦t J0t台城酶些l川的 RT-PCR骨折：怕)证 I 址 的小 F
l停 水0 3、6、9，I2、1 5、18、21 d)水耳{备腱 H融台成酶 妁 RT．PCR 《al RT PCR analvsis of
tmn~dption il1 rice leaves Brier dehydration trcatmerts by diferc~lt concentration ofPEG：m1 RT—PCR analysis of GS
Ⅱ 呻onin riceleaves af na沁 dmu tiTealmemsIO 3 6 9 12．15 18 and 21 days aaer stoppingirdgalion)
日。肽台成酶基因可能并不是环境狮迫普遍陆诱 导
摹 ，而足选择性抗性诱导基因
2．6谷胱甘肽合成酶基因与水稻抗旱的关系
PEG Jl宵脱水的作用，在离体条件 F可1月 人
工模拟一r早胁迫 通过 RT PCR的方法检删 0 GS
基因在水稻下 条件 下旧诱导表达 ，从而 r解
OsGS基因庄水稻抗旱-⋯ 作用，罔 6(a)显 水
稻开花期I1 r片谷胱 肽合成酶基冈在PEG阿浓度
为5％、10％、15％和 20％的模拟干旱胁迫条件 F可
被诱导表达。而存更高浓度则 被涛导。图6(b)箍
示水稻符胱”肽合成酶基因在水稻处于门然十旱
胁迪下，即停止浇水后的 3、6、9、l2和 15 d被诱导
表达，而在于早 l 8、2l d等 的时间后其转录则
停止了 这些结果 示 0sGS瑟因是干旱逆}竟l怖应
基因，抽穗期的I1片在中轻度和巾度干旱胁迫可诱
导 CS的转录
2．7谷胱甘脑合成酶基因的诱导信号分子
f1前曲 f究表明植物对十 胁迫可通过两条
途径而发生响应，即 一是依赖 ABA的途释，另一则
是独立于ABA的反应途径 为 r探求谷胱甘臁台
战隅基 诱导表达的信号选 ，利用已有文献_报道
的具有氧化胁迫信号分子功能的 3种小分子物质．
水畅酸、脱落酸和过氧化氢怍为外源信号纷子对实
验材制进行处理后．提取总 RNA 迎过 RT．PcR磷
冗符眦H 8k合成酶摹 的诱导我达情况 结果丧叫
谷胱甘肢台Ji竞酶恭㈧能被外镳脱落酿‘ABA)诱导
表达(陶7)，随明谷胱 肽合成酶基因诱导表达的
信号逢托可能依赖ABA f 号传导途径
水橱醯s^ j 落酸 ^ 过氧化氢H
7于F佗鄯 幅 r 5中粹l眭H肚啬成酶垃闻
：讣泺忙号讣了处 下f门诱导在逃
F 7 OsGS expresionin leaves afheading Tieeinduced畸
exogenous100mRit]I／L ofSA，AB^ and I％ H：0
3 寸沦
本文用5、一RACE方法首敬从水稻中获得 ，谷
胱甘肽合成酶基因的 eDNA 序列克降 (GenBank
登录号：AY453405)，并与水稻基因组序列进行比
较分析 OsGS幕 【划的结构．发现 0 GS基固位
于水 稻 12号 染色体 短臂 (BAC觅隆序列号：
AL73l744)， 有 12个外娃子和 I】个内龠子 (图
1)t全长6 321 bp，编码 540个氨赫酸 在网f．进行
OsGS基[^f 动 分析，发现了 ：多Lj逆境胁迫 (T-
旱、高温、低温、病原菌和伤害)帚I信号传导(ABA、
乙烯和 SA)十I J关的顺式元件 (表 1)。通过大肠杆
维普资讯 http://www.cqvip.com
458 热带亚热带植物学报 第 14卷
菌异源表达，检测了水稻谷胱甘肽合成酶活性，证
实得到的OsGS基因具有活性 (数据未提供)。这说
明所克隆的 OsGS基因确实是水稻谷胱甘肽合成酶
的基 因。
Schafer等的研究表明，芥菜 (Brassicajuncea)
谷胱甘肽合成酶存在一个小的多基 因家族【 ，而
Ulmann等的研究结果显示拟南芥的谷胱甘肽合成
酶基因是单基因，并且存在编码定位到叶绿体的转
运肽序列同。最新的研究发现，尽管预测拟南芥谷胱
甘肽合成酶基因含有编码定位到叶绿体的转运肽
序列，但实验表明该基因主要在细胞质中表达【”】，这
与 May等【n]观察到拟南芥谷胱甘肽合成酶基因在
细胞质和叶绿体中均有表达的结果相符【 。我们的
研究也发现 OsGS仅存在于水稻 12号染色体短臂
的一个 BAC克隆上，显示 OsGS是一个单拷贝基
因，同时 OsGS具有编码定位叶绿体的转运肽的序
列，但 OsGS基因表达的确切定位还有待实验证实。
另外，我们的研究表明OsGS在水稻幼苗的根和叶
以及开花期水稻的根中表达，但不在开花期的叶、
茎和幼穗中表达。虽然 OsGS具有定位叶绿体的转
运肽序列，但它并不在开花期水稻的叶中表达。这
表明水稻 OsGS基因编码产物可通过组织和器官的
特异表达调控机制分布于植物不同的部位。同时它
们合成的谷胱甘肽也可以在不同细胞与组织间运
输，而且谷胱甘肽运输基因在不同物种中都是多基
因家族【 41，表明在某些特定部位合成的 GSH可以通
过运输到它所需要发挥功能的地点。
逆境诱导表达试验结果显示，在高温、干旱和
重金属逆境处理后，OsGS在抽穗期叶片中的转录
被诱导表达，而在盐、低温、伤害逆境下则不被诱
导。而在低温、盐和伤害等环境胁迫下并不被诱导，
这可能表明水稻谷胱甘肽合成酶基因并不是环境
胁迫普遍性诱导基因，而是选择性抗性诱导基因。
研究表明，在轻度的干旱胁迫下，各种抗氧化
小分子如谷胱甘肽、抗坏血酸和维生素 E等在抗氧
化胁迫中起着主要作用【 4]；在中度干旱胁迫下抗氧
化小分子与过氧化物酶等保护酶共同组成有效的
抗氧化系统【 7】；但是随着干旱程度加深，自由基的产
率提高，清除系统趋于饱和，伤害变得难以避免，伤
害的加深破坏了植物细胞的防御体系，细胞趋于死
亡【 。本实验通过检测谷胱甘肽合成酶基因在不同
程度和不同时间的干旱胁迫的诱导表达验证 了这
一 点。而这也证明了谷胱甘肽合成酶基因具有抵抗
干旱胁迫的功能。
现在认为干旱胁迫下氧化胁迫诱导基因的信
号途径有 4条，两条是依赖 ABA的途径，另两条是
不依赖ABA的途径。一条依赖 ABA的信号途径需
要蛋白的合成；另一条信号途径的调控主要在转录
水平，许多相关的顺式和反式作用元件 已经被鉴
定；一条非依赖 ABA途径同时也能被冷胁迫诱导；
一 些干旱诱导基因不被 ABA也不为冷胁迫所诱
导，这表明存在第四条信号途 91。我们的实验结果
显示水稻谷胱甘肽合成酶基因能被 ABA处理所诱
导，但不能被冷胁迫诱导。所以诱导水稻谷胱甘肽
合成酶基因表达的信号途径可能是依赖 ABA的途
径。我们在 OsGS基因上游发现了许多与水分胁迫
和 ABA响应有关的顺式元件更证明了这一点。一
些基因响应干旱胁迫很迅速，10 min内就被诱导表
达，而另一些基因在 ABA累积到一定程度才被诱
导，所以响应速度比较缓慢，需要几小时甚至更长
的时『日]【20]。我们的实验显示水稻谷胱甘肽合成酶基
因在 ABA处理 8 h才被诱导表达。这表明水稻谷胱
甘肽合成酶基因是胁迫缓慢响应基因，信号传导途
径 属于依赖 ABA 同时需要 蛋 白合成 的途径 。
Wingate等[3】和 Dhindsat 】的研究表明 GSH是诱导
干旱胁迫的信号分子。根据前人和我们的研究，
GSH可能是环境胁迫的二级或三级信号分子。
参考文献
[1]Lappartient A G，Vidmar J J，Leustek T，et a1．Inter—organ signaling
in plan ts： regulation of ATP sulfurylase an d sulfate tran sporter
genes expression in roots mediated by phloem—tran slocated
compound[J]．PlantJ，1999，18(1)：89—95．
[2] Vanacker H，Foyer C H，Carver T L W．Change in apoplastic
antioxidants induced by powdery mildew atack in oat genotypes
、vim race non—specific resistance[J]．Planta，1999，208(3)：444—
452．
[3] Wingate V P M，Lawton M A，Lamb C J．Glumthione causes a
massive and selective induction ofplant defense genes [J]．Plant
Physiol，1988，87：206—210．
[4] Richman P G， Meister A． Regulation of-y-glutamylcysteine
synthetase by non—alosteric~edback inhibition by glutathione[J]．
J Biol Chem，1 975，250：1422—1426．
[5] Hell R Bergmann L．-y-Glutamylcysteine synthetase in hiI曲er
plants： catalytic properties and subcellular location [J]．Planta,
1990，180：603—612．
[6] Zhu Y L，Pilon—Smits E A，Jouanin L，et a1．Overexpression of
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 6期 麦维军等：逆境诱 导水稻谷胱甘肽合成酶基闪的表达研究 459
glutathione synthetase in Indian mustard enhances cadmium
accumulation and tolerance[J]l Plant Physiol，1999，1 19(1)：73—80．
[7]Ullmann P，Gondet L，Potier S，et a1．Cloning of the A rabidopsis
thali~ma glutathione synthetase(GSH2) by functional comple-
metation ofa yeast gsh2 mutant[J]．Eur J Biochem，1996，236(2)：
662-669．
[8]Moran J F，Iturbe-Ormaetxe I，Matamoros M A，et a1．Glutathione
and homoglutathione synthetases of Legume nodules． Cloning，
expression，and subcelular localization[J]．Plant Physiol，2000，
124(31：1381—1392．
[9] Frendo P，Jimenez M J，Mathieu C，et a1．A Medicago truncatula
homoglutathione synthetase is derived from glutathione synthetase
by gene duplication[J]．Plant Physiol，200 1，1 26(4)：1 706-1 7 1 5．
[1 0]Skipsey M，Davis B G，Edwards R．Diversifcation in substrate
usage by glutathione synthetases from soya bean (Glycine mn )，
wheat(Triticum aestivum)and maize(Zea ma)s)Ⅲ．Biochem J，
2005，39 1(3)：567-574
[1 1]Henmi K，Demura T，Tsuboi S，et a1．Change in the redox state of
glutathione regulates differentiation of tracheary elements in
Zinnia cels and A rabidopsis roots[J]l Plant Cel Physiol，2005，46
(1 1)：1 757-1765．
[1 2】 Schafer H J，Haag-Kerwer A，Rausch T．cDNA cloning and
expression analysis of genes encoding GSH synthesis in roots of
the heavy-metal accumulator Brassica unceⅡL： Evidence for
Cd·induction of a putative mitochondrial gamma·glutamylcysteine
synthetase isoform[J]_Plant Mol Biol，1998，37(1)：87—97．
[1 3]Wachter A，Wolf S，Steininger H，et a1．Diferential targeting of
GSH 1 and GSH2 is achieved by multiple transcription initiation：
implications for the compartmentation of glutathione biosynthesis
in the Brassicaceae[J]．Plant J，2005，41(1)：15-30．
[1 4]May M J，Vernoux T，Leaver C J，et a1．Glutathione homeostasis
in plants：implications for environmental sensing and plant
development[J]l J Exp Bot，1 998，49(32 1)：649—667．
[1 5]Zhang M Y，Bourbouloux A，Cagnac O，et a1．A novel family of
transporters mediating the transport of glutathione derivatives in
plants[J]l Plant Physiol，2004，1 34(1)：482—49 1．
[1 6]Price A H，Taylor A，Ripley S J，et al Oxidative signals in tobacco
increase cytosolic calcium[J]_PlantCel，1994，6(9)：1301—1310
[1 7]Kranner I，Becket R P，Womik S，et al Revival of a resurection
plant corelates with its antioxidant status[J]_Plant J，2002，31(1)：
l3-24
[1 8]Farant J M．A comparison ofmechanisms ofdesiccation tolerance
among three angiosperm resurection plant species[J]．Plant Ecol，
2000，151(1)：29—39．
[1 9】 Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K．Molecular responses to
dehydration and low temperature： differences and cross．talk
between two stres signaling pathways[J]．Cur Opin Plant Biol，
2000，3(3)：2 1 7-223．
[20]Yamaguchi·Shinozaki K，Koizumi M，Urao S，et a1．Molecular
cloning and characterization of 9 cDNAs for genes that are
responsive to desiccation in A rabidopsis thaliana： Sequence
analysis of one cDNA clone that encodes a putative
transmembrane channel protein[J]l Plant Cel Physiol，1 992，33
(3)：2 1 7-224．
[2 1]Dhindsa R S．Drought stress，enzymes of glutathione metabolism．
oxidation injury and protein synthesis in Tortula ruralis[J]l Plant
Physiol，1 99 1，95(2)：648—65 1．
维普资讯 http://www.cqvip.com