全 文 ：犊 表 学 报 、。。, 决一 含色
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苏云金杆菌天门变种晶体蛋白
’
基因的克隆和表达 ⋯
陈新国
’
张大达
’ ‘
王惠贤 尤崇构
中国农业科学院原子能利用研究所 北京 。。。
用改进 的 斑法检测 了苏云金杆菌 个 变种的质杠组成 , 其中我国分 离到
的天门 变种有 条质粗带 , 用 。 杂交法证明 , 天门 变种的 卜内毒素基因位于
个约的 的质杠上 。 该质粗经 川 , 酶切后 与 酶切 的 载体连接
,
“ 转化 大肠杆菌
。 通过菌落原位放针兔疫反应和 杂 交 方法 , 筛 选 带
有 色一 内毒素基 因并能在大肠杆菌中表达 的转化体 。 对玉米螟幼 虫进行生物浏 定 表
’
明 , 阳性克隆 及 有较强 的抑制幼 虫生长的作 用 。
关键词 苏云金杆菌天日 变种 分子克隆 各一 内毒素 一 。
前 言
苏云金杆菌 ’ “ “二沁 在形成抱子的同时汽生一种伴抱晶体蛋 白 各
内毒素 , 对鳞翅 目或双翅 目昆虫有毒杀作用‘ 不同苏云金杆菌变种的
、
各一内毒 素 毒力及杀
虫范围不同 。 用质粒治愈
、
质粒转移
、
分子杂交 、 基因分离和克隆等技术证明 , 苏云金杆菌
的 卜内毒索基因位于质粒上
, 并且已对许多不 同亚种和菌株的苏云金杆菌 乙一内毒素基 因进
行 了分子克隆 〔 , 。
‘
,
, 对其中二些亚种的毒素蛋 白基因进行了序列分析 〔 , ,
。
与世界上已大
,
规模生产的苏云金杆菌商品化生产制 剂勺 ’ 一 不 同 ,
一
我 国 分 离
的苏云金杆菌天 门变种 ‘ ‘ 。、 ,
一
简 称 属 于 。 。 。、血
‘
清
型 「 丁。 该菌的生化反应和对昆虫的毒性物质有其特异性什 , ‘ ’
, 其菌剂对棉花 、 水稻 、 蔬菜
和树木等的鳞翅自害虫都有一定的毒杀作用 , 是我自用于防治农业害虫的主要苏母金杆菌制
剂之一 〔‘ , ’。 但有关天 门变种 各、内毒素的分子克隆尚未见报道 。 本文报道了天内变种质粒
的分离及与其它菌株质粒组成的比较和 卜内毒素基因的定位及分子克隆
。
材 料
‘
与 方 法
材料 苏云金杆菌 ‘ 一
、 。。 ‘ 、 二 及其它变 种 和 菌
株 由中国科学院沙搓云研究员及华中农业大学喻 子牛教授提供
。
限制性 内切酶和其它核酸修
饰酶购 自 。。 打公司或华美生物工程公司 ‘ 金黄色葡萄球菌 蛋 白为 公司
此文于 年明 日收到石
现在地址 新盔农科院微生物所 。 二 现在地址 中国联合生物技术公 司
幼布 一从“
一
核 学 农
‘
报 卷
产品
。 一“ , 一 及 ”“ 购自中国原子能科学 院 。 溶菌酶为上海禽羞二厂产品
。
方法 苏云金杆菌的大质粒提取按改进的 法 〔“ 〕进行 , 溶菌酶量为 。
垂组质粒的提取采 ‘汕“ 法‘扮’琳凝胶中回收质粒 采用件酗琼脂糖法 〔
‘“ ’。 基
因探针的标记
、
时 “印杂交
、
菌落原位杂交按 等的方法 〔‘ “
·
’进行 。
用硫酸钠和 四氯化碳液体双相法
、
泛影葡胺等 密度梯度离心法 〔 纯化伴抱 晶休
, 用 电
子显微镜观察 晶体并拍照
。 将晶体溶于 的 中
,
, ℃温育 , 再用 磷酸盐
制菌缓冲液
‘
透析过夜 , 所得晶体蛋 白溶液按每只兔子
、 、 的量 次注射免疫
取抗血清 。 抗血清的效价测定按板 。井的方法 〔“ 丁进行 。 抗血清的吸附用大 肠杆 菌
体及其裂解物与抗血清在 ℃下进行 , 并经 。。 离心除去沉淀 。
酶切和连接按照 等的方法 〔‘“ 进行 。 采用改进的 等 〔‘ ” 程序制备
感受态细胞 , 并用连接好的 进行转化
。
菌落原位放射免疫测定是按 。卑 法 〔’‘ 将转印到硝酸纤维素膜上的重组子菌落 原位裂
解 , 裂解物再与澳化氰活化纸结合 〔‘ ’
。
将带有菌体蛋 自的嗅化氰活化纸放入稀 释 倍的
卜内毒素杭血清及 中
, 室温振荡 , 加入‘ ‘ 标记的葡萄球菌 蛋 白
‘
, 室温褥荡 。
经 概涤后
, 进行放射 自显影一生物活性测定 是将克隆菌株的菌悬液混匀到人工饲料中 , 饲喂玉米螟 一
幼 虫 , 用等量的大肠杆菌作对照 。 观察并统计结果 ‘
结 果 与 讨 论
‘ 苏云金杆菌的质粒电泳图谱及 杂交
‘
苏云金杆菌的质粒组成复杂
, 不同变种或菌株的质粒数 目和大小都不同 , 从 一
,
个不
氛 而 尔内毒素基因一般位于 个或几个大质粒上
。 本工作采用改进的 。 方 法 , 可
以快速 、 简便地得到苏云金杆菌的大质粒 。 大质粒不易重复检测的原因主要 与溶菌方法不 当
有关
。 ‘ 苏云金杆菌对溶菌酶有抗性 〔。 」, 因此加大溶菌酶量
、
操作尽量温和 就 可 得 到 较 好
的结果 。
’
图版 为 个变种的苏云金杆菌质粒图谱 , 可见苏云金杆菌的大质粒是普遍存在的
,
不同变种的质粒图谱不 同 , 其 中天 门变种有 条质粒电泳带 , 包括 条木质粒 带
, 与 “ “ ’
等变种的质粒电泳带明显不同 , 为天门变种的分类提供 了有力依据
。 用“。 。石“ 变种的 质
拉作探针进行 杂交的结果 图版 亚 表明 除了 。。 ‘ 变种的 外 , 探 针
与其 它 个杀鳞翅 目昆虫变种的质粒 发生了不 同程度的杂交 。 杂交大部分发生于大质粒
上 , 不 司变种的杂交部位也不 同 。 探针与天门变种的
、
质粒有较强的同源性 ,
与 的质粒同源性较弱 , 在 及 位置发生微弱杂交 。 根据已知质粒电泳图谱和杂
交带位置 , 初步认为苏云金杆菌天门变种的 各一内毒素基因位于约 和 的质粒上
。
又
’
二 苏云金杆菌天门变种重组质粒的构建
用低融点琼脂糖凝胶法分离纯化了天门变种的 质粒 , 回收的质粒 呈 现 单 一
电泳带
。 将该质粒在低盐缓冲液及 林 的条件下经 川 酶切 , 再以 的 比例
与经 酶切 的 其中一份经小牛肠碱性磷酸醋酶处理 混合 , 在 终浓度为
林 的条件 下用 连接酶连接 然后转化大肠杆菌 里感受态细 胞 , 从
个 的转化子中得到 个 ’ , 的重组子克隆
, 对重组子质粒快速提取的结果表明 ,
期 苏去金杆菌夭门变种晶体蛋白基因的克隆和表达 幼
所检测的重组子质粒大都比 质粒 分子量大 图版
。
由
十 、
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图版 苏云金杆菌 个变种的质粒凝胶电泳 和 杂交
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图版 苏云金杆菌 个变种的质粒凝胶电泳 和 杂交
玄” ” 云 ,
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一 , 一 , 一 一 一
三 菌落原位放射免疫测定及 杂交
用液体双相法及等密度梯度离心法提取并纯化 一 的 晶体 , 经相差显微 镜 及
扫描电子显微镜观察
、
计数 、 拍照 , 鉴定其纯度为 以上 图版 。 纯晶体经
在 ℃下作用 后 , 完全分解为晶体蛋 白单体 , 经。 硫 酸盐缓冲液 透 析过夜后 ,
作为抗原免疫家兔 , 得到琼脂双扩散效价为 的抗血清
,
为了消除兔体 内本 身 所含有大
肠杆菌而引起的 非特异性免疫反应 , 将抗血清经 八 菌体及其裂解蛋 白吸附 , 稀释
倍后用于放射免疫检测 。 据报道 , 苏云金杆菌 舫 一 变种与天门 变 种 的 晶 休 蛋
幼杏 核 农 学 报 堪
图版 公
介
一变种的伴抱晶体
“ ￡ 一
图版 菌落原位杂交的放射免疫测定
几 ￡ “ 口
工
、
史 通 二 己 了
图版 重组子质粒 凝胶电泳
血 口 皿
白成分部分相同 〔“ , ‘ , 因此 我们制备的壳 脚 一 晶体蛋 白抗血清可以用于 天 门 变
种晶体蛋白抗原的放射免疫检测 , 重组子菌落经裂解 , 释放出的蛋 白质与澳化氰活化纸 共价
结合后 , 将其与晶体蛋 白抗血清一起温育 , 使抗原抗体反应 , 再将 ’ “卜 与活化纸一起 温
育 , 则抗原一抗体一 ’“ 一 三者结合 。 活化纸与 光片一起放射 自显影后 , 观 察 到 个杂交
阳性克隆 图版 , 其 中 个未列出 , 表明其裂解物中含有大肠杆菌产生的 晶体蛋 白抗原 。
杂交斑点的深浅不伺 , 表明晶体蛋 白量不 同 , 可能 由于各阳性克隆的表达水平不 同所致 , 也
可能因各克隆的细菌数 目不同 。 因此 , 无法仅从斑点的深浅来判定克隆表达的水平 , 用
探针 〔‘ 。 与这 个阳性克隆菌株进行 杂交也证明 , 它们含有晶体蛋白基 因的同源 序
列 待发表 。 以上结果说明 克隆的天门变种晶体蛋 白基 因在大肠杆菌中得到 了表达 。 同
时也进一步证明 , 天 门变种与 舫 一 的晶体蛋 白有相 同的抗原成份 , 天门变种的晶
体蛋 白基 因至少位于 个约 的大质粒上 。
四 生物活性阅定
用玉米螟侧定的结果表明 , 阳性克隆 和 对供试幼 虫有较强 的抑制生长
作用 其它 个阳性克隆也有一定的抑制作用 表
。 表明天门变种的晶体蛋 白基因已被克
隆并表达出有生物活性的 晶体蛋 自 , 但表达水平较低 , 其原因尚待进一步研究 。
期 苏云金杆菌天门变种晶体蛋白基因的克隆和表达
表 克隆菌的毒性测定
对 ,
几二下诬 、 ‘
一
几大
玉米殡
, 侧 ,
场
盯 一一
注 对试虫有强毒性 一 对试虫无毒性 。
记 一 一
本工作得到本所生物技术室全体同志的热情支持 , 特此致谢
参 考
‘
文 献
范云六 杀虫微生物 北京农业大学出版社 , 第 卷 , 卜一
。
,
湖北省天门县薇生物所等 苏云金杆菌天门变种 —
“ 比 ” 菌的研究
。 微生物学报 , 。,
‘
任玖新 , 冯喜 昌 , 冯维熊 苏云金杆菌伴抱晶体的形态及抗原特性 , 微生物学报 , ,
冯维熊 苏云金杆菌五个菌株的晶体蛋白的研究
。 微生物学通报 , ‘ , 一 。
喻居牛 苏云金杆菌制剂名录
。 微生物通报 , , 尽 一 。
刘志成 苏云金杆菌在我国农业害虫防治中的作用 。 微生物学杂志 , , 一 。
王裸摇着
、
白成 温洁 苏云金杆菌晶体与芽抱的分离研究
。 微生物学报 , 。, 。 一
一
板令声
陈乃用
植物免疫学检验法
。 上梅人民出版社 ,
。
印小朋 芽抱杆菌原生质体的形成和质粒转化的研究
。 微生物学报 , ,
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