全 文 ：热带亚热带植物学报 2004，12(4)：359-362
Joumd of Tropical and Subtropical Botany
菜心耐羟脯氨酸初选系的耐热性
廖飞雄
(1．广东省农业科学院花卉研究所，广东广州510640；
潘瑞炽2
2．华南师范大学生命科学院，广东广州510631)
摘要：分析了离体筛选出的一个菜心耐羟脯氨酸选择系的脯氨酸含量和耐热性。Hypr01比原品种六十天特青有较高
的游离脯氨酸含量；35~C热胁迫下Hypr01中有显著的游离脯氨酸含量增加，为六十天特青的4倍和耐热品种四九菜
心的近2倍。与对照相比，在 35~C下连续培养的Hypr01愈伤组织表现出更强的活力和根的分化能力，鲜重增量明显加
大：相对电解质渗出率、愈伤组织褐变程度和MDA含量低：SOD、CAT活性较高。在人工气候箱模拟栽培高温逆境
下，Hypr01再生苗生长优于未经选择的六十天特青，并具较低的电解质渗出率和较高的鲜重增长，说明有较强的耐
热性。
关t词：菜心；耐热性；羟脯氨酸；离体筛选；脯氨酸
中图分类号：Q945．78 文献标识码：A 文章编号：1005—3395(2004)04=0359-04
Heat tolerance Characteristics of a Hydroxyproline-resistant Line of
Brassica campestris L．ssp．chinensis var．utilis Tsen et Lee
LIA0 Fei-xiong PAN Rui-chi
(1．Floricultural Research Institute，Cuo~oaong Academy of Agricultural Science，Guangzhou 510640，China；
2．Colege of Life Science。South China Normal University，Guangzhou 510631，China)
Abstract：Proline(Pro)content and heat tolerance were determined in a hydroxyproline-resistant line HyprO 1
selected n vitro from seedlings ofBrassica campestris L．ssp．chinensis vat．utilis Tsen et Lee．Hypr01 had higher
content of free Pro than the original cultivar Liushitianteqing．A greater increase of free Pro content could be found
in Hypr01 un der heat stress at 35oC， which was 4 times as much as that in Liushitian teqing and nearly 2 times in
heat tolerant cultivar Sijiu．Compared to the control，the calus induced from Hypr0 1 shoots showed vigorous，root
diferentiationabilityandhigh shweightincrementwhen culturedunder successive stress at 35~C． Under such
condition，the relative electrolyte leakage，callus browning rate and the content ofMDA in Hypr0 1 were significant
lower，but the activties of SOD and CAT in Hypr0 1 was higher．The plantlets regenerated from Hpyr0 1 grew
beter than those from Liushitianteqing under a heat stress condition(35~C by day and 25~C by night both for 12 h)
in phytotron，and had lower electrolyte leakage and higher fresh weight increment，which indicated a greater heat
tolerance．
Key words：Brassica campestris；Heat tolerance；Hydroxyproline；／n vitro selection；Proline
通过筛选植物抗羟脯氨酸 (Hydroxyproline，
nyp)变异来获得高抗逆性植物新品种，在小麦、马
铃薯等多种作物上已有研究，对筛选出的变异进行
抗性和生化指标的分析鉴定表明，这些抗Hyp的变
收疆 日期：2oo3一O7．03 接受日期：2003—10-20
基金项目：广东省“九五”重点科技攻关项目(970308)资助
缩略词Abbreviation：Hyp：羟脯氨酸Hydroxyproline；Pro：脯氨酸Proline：POD：过氧化物酶同功酶Peroxidase；SOD：超氧化物岐化酶同
工酶Superoxide dismutas~；CAT：过氧化氢酶同工酶Catalase；MDA：丙二醛Malondialdehyde；PBS：磷酸盐缓冲液Phosphate
bufered saline；NBT：氮蓝四唑P-Nitro blue tetrazolium chloride；TCA：三氯乙酸Trichloroacetic acid；TBA：2一硫代巴比妥酸
2·Thiobarbituricacid；6-BA：6一苄氨基嘌呤6-Benzylaminopurine,NAA：萘乙酸Naphthaleneaceticacid
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360 热带亚热带植物学报 第 12卷
异有较高的Pro含量，对NaC1、水分胁迫或冷害逆
境有较强的抗性 [1 。芸苔属蔬菜中甘蓝也见有抗
Hyp变异筛选的报道[4】。菜心，又名菜薹(Brassica
campestris L．ssp．chinensis,car．utilis Tsen et Lee)是
华南地区重要的绿叶蔬菜，改进其耐热性，对实现
周年供应优质产品有重要意义。我们己探明在菜心
中脯氨酸的积累和外源脯氨酸对其耐热性的作用[5】，
并建立了离体筛选耐Hyp变异的方法，初选出了一
些耐Hyp的材料[6，7】。Hyp抗性系对高温胁迫是否也
具有较强的抗性，能否通过选择Hyp耐性系来培养
耐热新品种，目前很少研究。本文通过对一个菜心
耐 Hyp变异的耐热性进行分析研究，以探明耐Hyp
系的对高温胁迫的响应和Pro在抗热中可能的生理
作用，并为建立耐热新品种筛选新途径提供依据。
1材料和方法
菜心耐Hyp和离体培养系的建立 菜心品
种 ‘六十天特青’一个耐 Hyp幼苗选择系，代号
Hypr01。由无菌种子于含 5 mgml。Hyp的 1／2MS培
养基上萌发和培养，选择存活株于不含Hyp的培养
基上恢复生长，经连续三个培养周期淘汰，选择生长
正常植株作为选择系。选择系于分化培养基上增殖
芽苗和诱导愈伤组织供鉴定分析实验。以平行培养
的 ‘六十天特青’(以下简称 ‘六十天’)和耐热品
种 ‘四九’菜心作对照。愈伤组织的继代培养基为
MS+2mgL-。BA+0．2mgL‘。NAA+0．2mgL-。GA3+
7 g L。琼脂 +30 g L。蔗糖，无菌苗生长培养基为
1／2MS+7 g L-。琼脂+30 g L-。蔗糖。
温度逆境处理 高温胁迫温度35c，去胁迫
后培养和对照温度2 ℃，于LHR-250-H恒温光照培
养箱中进行，光照强度 l0_l4 i~mol I1- 。，光照12 hd-。
游离脯氨酸含量测定 参照张殿忠IS]方法。
称取鲜重约0．1 g的样品，用 5 ml 3％(w／w)磺基水
杨酸煮沸提取60 min，酸性茚三酮染色。
电导率测定 取组织培养茎尖苗或愈伤组
织，用重蒸水漂洗三次，于装有 l0 ml重蒸水的试管
中，摇动2 h后用DDS-IIA电导仪测定电导值，然
后煮沸30 min冷却至25 cI=测定总电导值，重复 3
次。按下式计算：相对电解质渗出率(％)=处理电导
值／总电导值x100％
愈伤组织热胁迫下鲜重相对增量测定 称
取鲜活愈伤组织fw0)约 180-240 mg分成 6-8小
块接种于三角瓶，35~C下连续培养，第2l天称取鲜
重(FwI)，统计褐变块数和生根数，重复4次，鲜重相
对增量(ray )=(Fw广FWo)／FWo
PoD、CAT和SoD活性测定 样品用pH7．8
PBS冰浴研磨提取，于BECKMAN高速离心机上
15 000×g，-4~C离心20 rain，上清液用于测定酶活
性和其它指标。POD活性用愈创木酚显色法；SOD
活性用NBT还原法；CAT活性参照 Beens和 Sizer
的方法：可溶性蛋白质含量用考马斯亮兰法，具体
测定同前文[5]。
MDA含量测定 用 IO％TCA(含0．5％TBA)
煮沸30 min后快速冷却，4 000xg离心 15 min，取上
清液于 532 nnl和600 nnl处测定OD值，含量按
OD53z-ODa~=1 55x 10 换算。
高温对生长的影响 模拟大田高温生长条
件于Heraeus2000(Germany)人工气候箱中进行。将
无菌苗每瓶5株称重，接种于 1／2 MS培养基上，置
于人工气候箱中处理，白天35~C，夜晚为25~C，交替
周期 12 h，光照强度600-800 u mol m‘2s一，空气湿度
80％，30 d后称取鲜重。取叶片测定电导值，重复3
次，计算同前。
试验按随机区组设计，结果显著性检验用SSR
法或 LSR法。
2结果
2．1游离Pro含量及热胁迫下 Pro的积累
游离Pro含量分析结果表明，选择系Hypr01愈
伤组织有较高的Pro含量(表 1)，是未经选择的对
照品种 ‘六十天’含量的3倍多。在35~C下热胁迫
培养 24 h后，Hypr01愈伤组织游离Pro含量明显增
高，而 ‘六十天’则增量很少，两者此时含量相差 4
倍多，比耐热的 ‘四九’品种还高。去热胁迫48 h后
Hypr01的Pro含量明显下降，甚至低于对照温度
25℃时的含量；‘四九’品种是菜心中较耐高温的品
种，在热胁迫下出现Pro积累和去胁迫后大幅度下
降，Hypr01的Pro变化趋势与之相同。
2．2热胁迫下愈伤组织的分化和褐变
高温胁迫下，愈伤组织的表现反映出选择系在
组织和细胞水平上的耐热性。从图 1中可以看出在
35~C下持续热胁迫 15 d后，Hypr01愈伤组织具有显
著强的生存和生长活力，形成了较多鲜活愈伤组
织，并分化出了根系，表现出了良好的耐热性。热胁
迫下培养21 d后，‘六十天’愈伤组织的鲜重相对
增长量很小，仅为 1．27，明显受高温抑制，而 Hypr01
的相对增量高达 3．46，两者差异极显著；但 Hypr01
与耐热的 ‘四九’菜心的增量(3．77)无显著差异，可
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第 4期 塞飞雄等：菜 耐羟脯氪酸初选系的耐热性
囊1 3s℃24 h热胁迫下Hypr0]愈伤组织游冉瞳曩馥音●H g FW)
TaBle1 The contents offiee pro]ineinHypr0I ca]n underheat stress
at 35Ec Ibr 24 h
见HyprOI在高温条件下能有较好的细胞分裂和生
长能力。耐热性还表现在愈伤组织褐变程度和分化
能力上(图2)，选择系表现出了更强的耐高温能力，
在高温胁迫下褐变率低，程度轻，并保持较强的分
化的能力，有23 81％的愈伤组织块分化产生了根
选择系和 ‘四九’菜心完全褐变的愈伤组织所占比
率均低于 ‘六十天’
2．3热胁迫下HyprOl愈伤组织细胞膜稳定性和膜
保护酶活性
相对电解质渗出率和丙二醛含量反映出逆境
下细胞膜的稳定性 从表 2可见热胁迫 21 d后，
HyprO1愈伤组织相对电解质渗出率显著低于 六
天’，也比 四九’菜心略低，说明选择系在长期热
胁迫后，能使细胞膜保持较好的稳定性．防止电解
质的渗漏。细胞丙二醛 (MDA)含量同样比‘六
天’低，差异极显著，与 ‘四九’菜心的差异不显著．
说明受胁迫后HyprO1的细胞膜过氧化程度远低于
‘六十天’，也在一定程度上低于耐热品种 ‘四九’
菜心，结果与相对电解质渗出率一致。细胞保护
酶活性在一定程度上也反映出选择系抗性的增强．
Hypr01的 SOD 活性 (68．95 U mg～Protein min )
和CAT恬性 (1．32AODmg Proteinmin- )高于 ‘六
十天’的活性 (64．78和 1．28)，但均略比 ‘四九’
菜心 (71．06和 1．42)低。而 HyprOI的POD活性
(45．07 ODmg- Proteinmin )高于 ‘四九’菜心
(36．98)，但与 六十天’(45．89)没有差异。
襄2热胁迫下Hypr01细胞雎嚣性和MDA音量
Table 2 Cel membrane permeabilit~and MDA content in
Hypr~l cali uI rheat s ssat 35 for 21d
不同字母示极显著差异DLfer~*,letters thinaColumni~ieate
signifcam diference p(0 01
2．4模拟胁迫下 HyptO1再生苗的耐热性
在人工气候箱中模拟接近实际栽培中的高温
胁迫条件，对选择系再生瓶苗进行培养。表3结果
表明HyprO1在35％／25~C交替下生长良好，能发根，
形成完整植株和正常生长；叶色深绿，无伤害症状
出现 其植株鲜重相对增量高于 ‘六十天’，差异显
著；相对电解质渗出率也极显著低于 六十天 ，说明
与原品种相比，HyprO1较能适应高温的生长条件。
3讨论
小麦 一、马铃薯[31和柑桔 等抗Hyp选择系有较
强的低温抗性，但对高温抗性研究较少 存活率、生长
量和膜透性等是植物耐热性鉴定和生理研究中的最
基本的指标 ，从这几个指标来看，菜心抗Hyp选
择系Hypr01热胁迫下有较大的鲜重增量、低的相对
电解质渗出率和较高的抗褐变力；在模拟高温逆境
下培养的再生苗也表现出了较好的耐高温特性，可见
Hypr01显示出了较强的耐热性 SOD和CAT等保
图I 35oc热胁迫 l5 d后．HyProl愈伤组织(中1具较强增穗和分化能力
对照为 ‘四九 菜心 (左)， 六 f天’(右)
Fig一1 The c u of H卿 I(m，ddle)under heat s雠ss毗35℃for1 5 days．
showing the wel differ~atiated cali．Shijiu cultlvar(1et~)and
Liushitian culfivar(ri )tbrcoa[1"o[．
●
Hypr01 ‘六+天’ ‘四九
LjL hl6￡m 8iiu
图2 35uC高温胁迫 F鲰伤组织生根率(口)和褐变睾(●)
Fig 2 Rooting(口)and brc~niag(一)ofH
．
~r01 ca[1i
cultured咀35℃
∞加∞∞帅∞∞加0
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362 热带亚热带植物学报 第 l2卷
裹3 35~C／25~C‘tg~tI~HyprOl再生苗的耐热性表现
Table 3 Heat tolerance ofHypr01 plantlets cultured at 35T．／25~C
(day／night)in phytotron‘
‘35~C／25~C=day／nighttemperaturefor 121V 12h．不同大写和小
写字母分别表示极显著和显著差异Diferentcapitalletersand small
leters within a column indicate signifcant diference at p<0 01 and
p<0．05，respectively．
护酶活性一定程度上的提高，也反映出其有较高的耐
热性。一些从培养细胞水平上筛选出的细胞突变，再
生植株后并非都能表达，常出现抗性消失的情况【眨旧。
耐Hyp选择系Hypr01是一个在整体水平上筛选出
来的株系，在细胞水平上是否具有抗性呢?本研究用
再生苗诱导出的愈伤组织进行耐热性分析，结果表明
愈伤组织表现出较强的耐热性，从而在组织和细胞水
平上证实了选择系耐热性的提高和变异的可能。
抗Hyp变异对盐胁迫、低温等逆境的抗性提高，
认为与Pro含量明显增高后，细胞渗透势下降，渗透
调节能力加强有 I-3】：短时间热激后，番茄培养细胞
和幼苗内【 ，高温逆境下甘蓝问和菜心圆中都出现Pro
的明显积累，表明Pro含量的提高是对高温逆境的
响应。菜心中耐热品种 ‘四九’中Pro含量和热胁迫
下的积累都高于不耐热的 ‘六十天’，本研究中抗
Hyp选择系Pro含量显著高于原品种和‘四九’菜心
品种，而且细胞膜的稳定性提高，说明其耐热性的提
高与Pro含量提高有关：但更可能与Pro合成与代谢
的活跃有关圆，与‘四九’菜心一样，选择系在热胁迫
下和去胁迫后愈伤组织细胞中Pro含量增加及去胁
迫后显著下降，也表现出大幅度的变化。但甘蓝茎尖
抗Hyp选择系却没有发现高Pro含量与耐热性提高
有关问，可能与所用的耐热性指标有关。
Hypr01移栽后生长良好，具浓绿的叶和苔色，
能正常开花结实，为一有潜力的种质。因此，可以看
出，通过用 Pro类似物Hyp作选择压力，从生理生
化机理上着手进行耐热性变异的筛选是可能的，而
且离体培养易操作和控制，有利于体细胞变异的纯
合，是有潜力的抗逆种质筛选途径。
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