全 文 ：核 农 学 报 。 , 上 了刊
涯 ’ 。 腼亡 。 ,
由质粒介导的豌豆根瘤菌
动
向棕色固氮菌
一
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一 二
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王惠贤
的转移
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一 一
尤崇构
中国农业科学院原子能利用研究所 北京
荷兰 农业大学分子生物学系
通过助 移质拉 “ ’‘“ 的推动 ,
’
实现 了携带豌豆根瘤 菌 刀 ‘ 。。 幼 , ￡
一
卯邻川 ”汀 只 ” 的质拉 即 。”由 大肠 杆菌 “ 。“ 向棕 色固 氮 菌 “
” 如“‘ ” ￡” ” “ 的转 移
, 转 移须率为每受休 一 · 进一 步将与 不
,相容的质拉 转 入这个转 移接合子
, 筛选得到 了两林相
一
同的棕 色固氮菌的突 变
菌椒 由表型特征分析和 活性 互补 实验证 明该 突 变菌株在来色体中含有碗豆根瘤 菌
孙冬 是两不月种 固氮微生物 的固氮墓 因即豌豆根瘤菌”汀 与徐 色固氮
百 菌呵 之间发生 同源性重组的结果
一 ‘ , ·
。 ‘ 关健词 质粒精移 碗豆根瘤菌 了 之 扛 棕 色固氮菌
前 言
棕色 固氮菌是一种能够固定气态氮的自生需氧细菌 〔‘ , 而豌豆根瘤菌财是一种依靠根瘤
菌和豆科植物细胞间的共生作用表达 固氮能力的原核生物 “ ’
。 棕色固氮菌的生理学特性已获
得了较为深入的研究 〔 , 但其遗传学研究却开展的 比较晚 , 对于该菌至今还难以建立 有 效
的基因转移系统 。 近年来 , 和 〔毛 曾
‘
使用
一
自杀载体将转座子 和 引入到拜
氏固氮菌 二 ’ , , , 等 “ 研究了含有限定固氮酶结构基因缺
失的各种棕色固氮菌的突变菌株
。 另一方面 , 由于农业生产上的重要性 , 根瘤菌的分子遗传
学的研究进行得比较多 , 涉及共生固氮基因转移的报道 已包括了各 种 转
一
移 方 法 的 应
用 〔 , , 气其中接合转移被认为是可以广泛应用于将共生固氮基因转移至不同种根瘤菌的一
种有效方法 。 但 是 , 将根瘤菌的固氮基因转移至 自生固氮菌 , 还未见有过报道 ‘ 本 文 作
者设计了一个系统 , 利用质粒作介导实现了豌豆根瘤菌 ’ 向棕 色 固 氮 菌 的 转
移 , 并证明部分豌豆根瘤菌 已写棕色固氮菌的部分。 基因交换而迹入了其染
色休
·
丛而得到了一个含豌豆根瘤菌叮 的拌色固氮菌突变种 ‘ 币 ” 价
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材 料 和 方 法
一 实脸菌株和质粒
·
细菌菌株和质粒列于表
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一
一
有 一一 刃一力
菌 株 和 质 粒
性 状 来源或文献
菌 株
月 才 野生型 文献
”
⋯ ⋯
弃 ” 几 文献
⋯
压
, 接合转移中的 基 因补体
, 接合用广泛寄主克隆载休
, 豌豆根瘤菌 , ’ 克隆于
得到的质粒
, 与 不相容
文献‘
文献
,
文献 一】
二 培养基和生长条件
棕色固氮菌于 无氮培养基中 , ℃ , 振动培养 天 ‘“ 〕 蔗糖为唯一 供 给 的 碳 源
克 升 醋酸铁 在需要时作为氮源加入
。 携带 , 和
的大肠杆菌质粒供体菌株于 培养基 每升含 克胰蛋 白栋 , 克酵母抽提 物 , 克
中 , ℃ , 充气振动培养过夜 。 在此步培养时加入四环素 , 。微克 毫升 , 但不 加 入
卡那霉素 。 携带 的大肠杆菌质粒供体菌株 , 在同样条件下培养 , 培养基 中 加
入庆大霉素 , 微克 毫升 。
固体培养时 , 加入 的琼脂 以形成平板 。
为从接合产物中筛选期望的棕色固氮菌 , 根据需要在培养基中加入 。 微克 毫升 ,
微克 毫升 或 微克 毫升 。
三 质较转移
助移质粒推动下 和 的转移 使用了 助移质粒 ‘ 以使
有关质粒从大肠杆菌供体菌移向棕色固氮菌 。 由于大肠杆菌不能在蔗糖为唯一碳源的培养基
上生长 , 为使供体大肠杆菌和受体菌棕色固氮菌共同生长 , 使用了经 培养基 , 葡萄糖和醋酸
钱补充的 蔗糖琼脂平板 ‘ 通过一滴分别处于对数生长期的携带 和
放大肠杆菌以及棕色固氧菌的液体培养混合物 在以上平板平面逃行三亲接合 携 带 ”
由质粒介导的碗豆根瘤菌 凡’ 。 。 夕 用 ￡。 。
卿 万 , , , 向棕色固氮菌 右 二 , 宕 的转移
的大肠杆菌供体菌细胞数与棕色固氮菌受体菌细胞数之比约为 二 。 接合平板在 ℃保温培
养 小时 , 收获接合后的细胞 , 悬浮于水 中 , 振荡片刻使聚集的细胞分离 用此悬浮液在含
有 。的 无氮培养基平板上接种 , 筛选已接合转移了 的棕色固氮菌较移 接 合 子
丸于 封的 ”。的菌落
。 一
一 厂
用完全相同的方法进行携带 和 的大肠杆菌以及棕色固氮菌的三 亲 接
合 , 在含有 和 的 无氮培养基平板上筛选已接合转移了 的棕色固氮菌转 移
接合子 将筛选出的菌株在同样条件的平板上划线培养若干次 , 以 检 验
所筛选出菌株的稳定性并得到纯化的棕色固氮菌转移接合 子 的菌株 。
与 不相容的 的转移 棕色固氮菌转移接合子 进一
步与携带 的大肠杆菌供体菌按同样方法进行双亲接合 , 并筛选具有 ’和 谊 ’ 的 棕
色固氮菌 , 即 已于 发生了交换的棕色 固氮菌交换接合子 。 将此交换结合子 复
印 , 选择 ’ , ’的棕色固氮菌交换接合子菌株 。
’
一
四 夹变盆株的获褥
在含与不含醋酸按 , 但都含有 和 的两组 蔗糖琼脂平 板 上 次 级 培 养 ’
’ 的棕色固氮菌交换接合子若干代 , 并 比较每一子代的生长情况 , 最后获得能 在 含
醋酸按豹平板上生长
, 但完全不能在无醋酸钱平板上生长的棕色固氮菌的突变菌株
五 固抓阵组分的体外互补活性
将棕色固氮菌的突变菌株 , 在 毫升含
、
和醋酸钱的丑 蔗糖 液 体 培 养 中 ,
℃ , 振荡培养 天 、 取其 毫升转移至一个 。毫升锥型瓶中 , 并以相同液体培养基稀释至
毫升 , 然后激烈振荡培养过夜 。 离心 , 以无按及抗菌素的 蔗搪液体培养基洗涤细 胞
两次 然后用同样培养基 , ℃下 , 激烈振荡培养 小时 。 再次离心分离 , 并将细胞悬 浮 在
毫升 的 一 中 。
氛气下超声破碎 以上细胞 , 获得的无细胞提取液用于测量固氮酶的 乙炔还原活性 。 使用
纯化的棕色固氮菌固氮酶组分在常规条件下进行互补活性测量 〔‘ 。 ’ ‘ ’棕色固氮菌固氮 酶 组
分 和 的分离和纯化采用 等的方法 〔‘“ 〕。
结 果
一 质较由大肠杆 , 向稼色固盆 , 的转移
为了由供体菌大肠杆菌向棕色固氮菌转移质粒 叨和 , 试验了多种接合转移
方法 , 结果表明只有“ 材料和方法 ” 中描述的固体表面接合系统有效转移质粒的频率较高而且
稳定 。 如表 所示 , 在助移质粒 的推动下 , 和 分别 以 一 吕和约 “ ‘ 的
频率转入受体得到转移接合子 , 它们携带的 。 ’ , ’和 ’在受体菌 转移接合子 中得 到
到表达 而不使用助移质拉时 , 则转移不能发生 。 与 和 不相容的质粒
可以约 ’ 今的频率直接转入受体得到交换接合子 , 其携带的 二和转座子 的 在 受 体
菌 交换接合子 中得到表达 由表 还可看出 , 、显示质粒所带抗性和转座子所带抗性 两 个
势 标记的转移 , 比只显示质粒抗性的转移频率小
。 此外 , 和 在棕色固氮菌中的 抗 性 水
平与在大肠杆菌中的基础水平相比约低一个数量级
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表 质粒由大肠杆菌向棕色固氮菌的转移
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双亲接合
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二 含有碗豆根瘤菌 ’ 的徐色固氮菌突变株的获得
是将豌豆根瘤菌 克隆于接合用广泛寄主载体 后得到的质
粒 表 列出了利用这一质粒作介导将豌豆根瘤菌瓜 转移到棕色固氮 菌 染 色 体
上的过程中 , 供体
、
受体
、
转移结合子
、
交换接合子以及最后突变菌株的表型特征
。
突变菌
株的获得 , 是在有无按条件下分别对 个不同的 ’ “的棕色固氮菌交换接合子 进
行次级培养的结果 在这一过程中于第四子代发现了两个相同的 一 表现型菌株 , 这就是 豌
豆根瘤菌 ’ 已重组到棕色固氮菌染色体 基因所有拷贝的突变株 , 命名为棕色
固氮菌 ’ 击‘ 而在无铰的棕 色固氮菌培养基上仍 能 生 长 的
’ ’ “的交换接合子 , 是因为其染色体 ’ 基因的有些拷贝尚未重组入豌豆根 瘤 菌
耐 , 因此可继续合成固氮酶而生长
三 徐色固氮 , 的固氮醉体外互补活性
将纯化的野生型棕色固氮菌 固氮酶 组 分 和 分 别
与厌氧条件下得到的突变种棕色固氮菌 去阻遏培养的无细胞提取液互补 , 进行活性 测 量
的结果如表
。
单一棕色固氮菌 的无细胞提取液和其加入 后的混合溶液 , 均未观察 到
乙炔还原活性 , 但加入 后的混合溶液则有明显的重组固氮酶活性 。 这一 结 果 表 明 , 在
耐 区域含有 的突变种棕色固氮菌 , 不能产生固氮酶组分 , 因此无固氮 活性 但
仍能产生一定数量的固氮酶组分 , 因此具有与 体外互补的固氮活性 。
讨 论
转座子插入诱变 已成功地应用到若干种革兰氏阴性细菌 ‘ 。 , “ 。 , 但尚未有效地应 用 于 沙
固氮菌属 月 , 。 虽然有转座子 , 和 向拜氏 固 氮 菌 。
‘ 翻 转移的报道 “ , 但所得大多数 转移分离菌具有反常的形态 , 并 在 次 级 入
培养时迅速失活
。 这种情况限制了 在该菌的进一步应用
。
等 〔“ ‘ , 曾描述了另一 种
由质粒介导的豌豆根瘤菌 刀几￡ 。邢 夕。爪 。拼
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衰 由质拉介导的碗豆根启苗川了 向惊色固抓菌特移中各接合子的裹型特性
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使用载体质粒 和大肠杆菌 进行转移 的技术 , 但 等 “ 报道 , 这
种方法具有很高的整合频率 、 而不是发生双向的同源重组 。
本文作者根据 和 〔“ 提出的原理 , 设计了一个新的接合系统 , 成 功 地
将 引入到棕色固氮菌中 , 实验 中得到的 ’ “的棕色固氮菌交换接合子不外 乎
出于三种情况 一是 在细胞内由 跃至染色体上 , 但 由于 耐 只有 至 上 占了
染色体的极小部分 , 因牛这种随机跳跃进入 ’了 的概率极小 二是 ” 跃入质粒
。
主是 的豌豆根瘤菌耐了 与棕色 固氮菌染色体的耐了 之间发生了同 源 性
重组 见图 如果是前两种情况
, 由于固氮基因未受到破坏 , 则交换接合子将继续能够在无
氮的 培养基上生长 , 也就是说 , 我们不能得到 一 的突变菌株 此外 , 在进行固 氮 酶
体外互补活性实验时 , 由交换接合子次级培养得到的突变株的无细胞提取液将与 野 生 型 类
似 , 也应有一定的活性 而我们的实脸结果与这些推论相反 , 说明 ’ ’ 的棕色固
氮菌交换接合子不是前面两种情况导致的结果 实验结果说明只有第三种可能是真实的 , 即
通过质粒 作介导 , 两不同属 固氮微生物的固氮基因 了 之间发生了同源性重 组 ,
从而将携带转座子 的豌豆根瘤菌 转移到了棕色固氮菌的染色体上 这一结果 从 固
氮菌基因顺序的遗传进化保守性考虑也是不难理解的 。
我们设计的接合系统利用了大肠杆菌不能在蔗糖为唯一碳源的培养基中生长这一特点
艺 核 农 学 报 卷
‘
表
‘
徐色固氮 , 的固氮脚体外 , 组活性
公 ” 矛
比活性 红, 时
纯 纯 无细胞提 无细胞提取液加饱和纯 无细胞提取液加饱和纯
,
取液
‘
人
未测
注 比活性的单位为毫微克分子乙烯 毫克蛋白
· 分钟 重组活性实验中所用的 和 的活性分别为 。。。和
毫微克分子乙烯 毫克蛋白
· 分钟 棕色固氮菌 和 无细胞提取液的蛋白浓度分别为 毫克 毫升和
毫克 毫升 表中所列数值是两次重复测量所得结果的平均值 , 误差为平均值的士 肠
孟 一
一 念 毛
,
, 一 ,
直 , 五 ,
, 士 肠
从而使得简单地通过筛选 抗性和 抗性就可 以检测质粒 和 是否 已由大
肠杆菌接合到棕色固氮菌细胞 此外为了更好地实现接合 , 兼顾大肠杆菌和棕色固氮菌二者的 ,
生长条件是重要的
。 为此必须使用经过补充的棕色固氮菌的无机盐培养基 〔‘“ , 和将接合平
板保温培养的时间控制在 小时左右 因棕色固氮菌一般需要 一 天可获得好的生长
, 而大
肠杆菌过夜培养即可 还值得指出的是 , 野生型棕色固氮菌对 异常敏感 。 当为三亲 接 ,
合培养含 和 的大肠杆菌时 , 如果使用含有 的液体培养基 , 即使对大肠杆
菌细胞洗涤多次 , 由所得大肠杆菌和棕色固氮菌接合时也无任何转移接合菌落出现 反之
,
结果使用不加 的液体培养 基培养大肠杆菌 , 则接合获得成功 在后者的情况 , 转移接合
‘
菌也是在对 和 筛选的条件下得到的 , 这说明所有由质粒赋予的抗菌素抗性标记在棕色
固氮菌寄主细胞中都已得到了表达 。 以上事实指出 , 质粒 和 在大肠杆菌中
是稳定的 , 因此以上叙述的大肠杆菌质粒供体菌的培养方法是可以采用的 。
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图 质拉介导的豌豆根瘤菌 转入棕色固抓菌染色体的图解
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人 棕色固氮菌细胞内 质 粒 , 。。的豌豆根瘤菌耐了 与染色体的盯了 区域之间的同源性重组
与 “ 。。不相 容 的 质 粒 护“ “ ”转入同源性重组发生后的棕色固抵菌细胞
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