全 文 ：收稿日期： 2013–07–19　　　　接受日期： 2013–10–18
基金项目： 四川省育种攻关项目(2011YZGG-11); 国家现代牧草产业技术体项目(CARS-35-05); 教育部博士点新教师基金项目(20115103120004);
　四川农业大学大学生科研兴趣计划项目(20131155)资助
作者简介： 黄秀(1991 ~ ），女，硕士；研究方向为草类植物资源及育种研究。E-mail: huangxiu4017@163.com
* 通讯作者 Corresponding authors. E-mails: 3165443@qq.com; zhangxq@sicau.edu.cn
热带亚热带植物学报　2014， 22(2)： 165 ~ 171
Journal of Tropical and Subtropical Botany
牛鞭草品种EST-SSR指纹图谱构建及遗传多样性
分析
黄秀, 曾捷, 聂刚, 刘欢, 黄琳凯*, 张新全*, 蒋晓梅, 张瑜, 张博涛
(四川农业大学草业科学系，四川 雅安 625014)
摘要： 为探讨牛鞭草(Hemarthria spp.)品种间的遗传多样性，从 86 对 EST-SSR 引物中筛选出 8 对引物对牛鞭草属 6 个品种进
行指纹图谱的构建及遗传多样性分析。结果表明，8 对 EST-SSR 引物对牛鞭草属 6 个品种共扩增出 193 条清晰条带，多态性
条带 161 条，多态性比例为 83.4%。每条引物的多态信息含量(PIC)为 0.480 ~ 0.695，平均为 0.602。UPGMA 聚类分析表明，牛
鞭草属 6 个品种在相似系数为 0.652 处可分为两大类群。8 对 EST-SSR 引物均能将 6 个品种完全区分开，以 3 对 EST-SSR 引
物扩增的电泳图谱为基础，建立了牛鞭草属 6 个品种的指纹图谱标准模式图，每个品种都有唯一的指纹图谱。牛鞭草属 6 个
品种的平均 Nei’s 基因多样性指数为 0.333，平均 Shannon 信息指数为 0.496，品种间的相似系数介于 0.399 ~ 0.782 之间。可见，
牛鞭草属植物品种的遗传多样性较丰富，种间差异明显。
关键词： EST-SSR； 牛鞭草属； 品种； DNA 指纹图谱； 遗传多样性
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2014.02.009
Construction of Fingerprinting and Genetic Diversity Analysis of
Hemarthia Cultivars by EST-SSR
HUANG Xiu, ZENG Jie, NIE Gang, LIU Huan, HUANG Lin-kai*, ZHANG Xin-quan*, JIANG Xiao-mei,
ZHANG Yu, ZHANG Bo-tao
(Department of Grassland Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)
Abstract: In order to understand the genetic diversity of Hemarthria cultivars, the DNA fingerprints of six
Hemarthia cultivars were constructed by using 8 pairs of EST-SSR primers screened from 86 pairs, and the genetic
diversities among them were analyzed. The results showed that eight pairs of ESR-SSR primers totally amplified
194 bands, in which 161 bands were polymorphic bands, accounting for 83.4%. The polymorphic information
content (PIC) ranged from 0.480 to 0.695, with an average of 0.602. The UPGMA analysis showed that six
cultivars of Hemarthia could be divided into two groups at the similarity coefficient of 0.652, and 6 cultivars
could be completely separated by eight pairs of ESR-SSR primers. Based on electrophoretogram amplified by 3
pairs primers, the standard DNA fingerprinting for 6 Hemarthia cultivars were constructed, and each cultivars had
an unique fingerprint. The average Nei’s genetic diversity and Shannon’s information index were 0.333 and 0.496,
respectively. The similarity coefficient of 6 cultivars of Hemarthia ranged from 0.399 to 0.782. Therefore, it was
suggested that 6 cultivars of Hemarthia had rich genetic diversity and significant differences between species.
Key words: EST-SSR; Hemarthria; Cultivar; DNA fingerprinting; Genetic diversity
166 第22卷热带亚热带植物学报
牛 鞭 草 属(Hemarthria R. Br.)植 物 是 禾 本 科
(Gramineae)黍亚科(Panicoideae A. Br.)多年生草本，
分布较广，种类较多，全世界有近 20 种，其中扁穗
牛 鞭 草(H. compressa)和 高 牛 鞭 草(H. altissima)的
产量高、品种好、适应能力强，是我国热带、亚热带
地区重要的多年生禾本科牧草之一[1]。目前世界
范围内牛鞭草属共登记了 7 个品种，分别为我国
育成登记的 3 个扁穗牛鞭草栽培品种‘广益’、‘重
高’和‘雅安’以及美国登记的 4 个高牛鞭草品种
‘Redalta’、‘Greenalta’、‘Bigalta’ 和 ‘Floralta’[2–5]。
牛鞭草因其具有生长速度快、再生力强、产量高、适
应性和抗逆性较强、水土保持能力优良等优点，已
在热带、亚热带地区得到广泛利用，为当地畜牧业
发展和生态环境建设作出了突出贡献，在草地农业
系统中占有重要地位[6–8]。
遗传资源的开发和利用对促进牛鞭草生产十
分重要，目前对牛鞭草属种质资源的基础研究相对
薄弱，登记品种均为野生驯化而来[2]。长期的引种
和自然选择使牛鞭草属品种间形态相似，造成识别
牛鞭草属品种困难。因此，对牛鞭草属品种资源进
行正确的评价，开展牛鞭草属品种资源遗传多样性
和资源鉴定研究，对其品种真实性进行鉴定、知识
产权的保护和新品种培育具有重要意义。
分子标记技术由于具有快速简便，不受环境
影响等优点，已被广泛应用于种质资源遗传多样性
分析[9–11]、品种指纹图谱及纯度鉴定[12–14]、遗传连锁
图谱构建[15–16]等方面。利用分子标记技术进行遗
传多样性分析及建立 DNA 指纹图谱则是正确评
价种质资源、鉴别品种品系和选择杂交亲本的有
力工具。目前用于种质资源遗传多样性分析和资
源鉴定研究的标记技术主要有 RFLP (Restriction
fragment length polymorphism，限制性片段长度多
态 性)、SSR (Simple sequence repeat，简 单 重 复 序
列)、AFLP (Amplified fragment length polymorphism，
扩增片段长度多态性)、RAPD (Randomly amplified
polymorphic DNA，随机扩增多态性 DNA)及小卫星
等。EST-SSR (Expressed sequence tags SSR)是存在
于表达序列标签(Expressed sequence tags)中的简单
重复序列，EST-SSR 兼具了 SSR 共显性、多态信
息含量高、简单快速、重复性好的优点以外，还克服
了 SSR 开发费用昂贵的缺点，且可在近缘物种之
间通用，目前已经在植物上得到广泛应用[17–21]。
陈 永 霞 等[22]和 范 彦 等[23–24]利 用 EST-SSR 和
RAPD 等分子标记仅对扁穗牛鞭草的遗传多样性
进行了分析。目前尚没有关于牛鞭草属品种 EST-
SSR 指纹图谱构建及遗传多样性分析方面的研究
报道。因此，本研究以牛鞭草属 6 个品种为研究对
象，通过 EST-SSR 标记技术建立牛鞭草属品种的
DNA 指纹图谱标准模式图，并对其遗传多样性进
行分析，以期为牛鞭草属植物的种质资源管理、新
品种选育、以及品种的知识产权保护等方面的研究
提供一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 供试材料
本 研 究 选 取 世 界 范 围 内 登 记 的 牛 鞭 草 属
(Hemarthria)植物 6 个品种(表 1)，‘Floralta’因在生
产上利用较少，暂时没有收集到。其中 3 份品种材
料营养体来自美国基因库，其余 3 份品种材料采自
四川农业大学草业科学系科研基地。2013 年 1 月
采摘各材料的新鲜幼嫩叶片，放入装有变色硅胶的
收集带中干燥，叶片彻底干燥后存放于 –80℃冰箱
保存。因牛鞭草为严格营养体繁殖材料，品种内单
株间遗传背景一致，故 1 个品种只选取 1 株提取
DNA。
表 1 牛鞭草属的 6 个品种
Table 1 Six cultivars of Hemarthria tested
编号 No. 登记号 Accession No. 来源 Resource 物种 Species 品种 Cultivar
1 PI299993 南非德兰士瓦 Transvaal, South Africa 高牛鞭草 H. altissima ‘Redalta’
2 PI299994 南非林波波河 Limpopo, South Africa 高牛鞭草 H. altissima ‘Greenalta’
3 PI299995 南非德兰士瓦 Transvaal, South Africa 高牛鞭草 H. altissima ‘Bigalta’
4 广西广益 Guangyi, Guangxi 扁穗牛鞭草 H. compressa ‘广益’ ‘Guangyi’
5 四川雅安 Ya’an, Sichuan 扁穗牛鞭草 H. compressa ‘雅安’‘Yaan’
6 重庆 Chongqing 扁穗牛鞭草 H. compressa ‘重高’‘Chonggao’
第2期 167
1.2 基因组DNA的提取
对每份牛鞭草属品种材料选取健康幼嫩叶片，
采用植物基因组 DNA 提取试剂盒(天根生化科技
有限公司)提取 DNA。并用分光光度计及 1% 的琼
脂糖凝胶电泳对 DNA 的浓度与纯度进行检测。将
合格 DNA 样品放置于 –20℃冰箱中保存备用。
1.3 EST-SSR的PCR扩增与检测
牛鞭草属植物 EST-SSR 标记引物序列参考
Kantety 等[25]开发的禾本科通用引物，由上海生工
生物工程技术服务有限公司合成。PCR 扩增反应
优化体系总体积为 15 μL：模板 DNA 1.2 μL，2 ×
Taq PCR MasterMix (康 为 世 纪 生 物 科 技 有 限 公
司) 7.5 μL，正 反 向 引 物 各 1.2 μL (10 pmol μL–1)，
ddH2O 补齐体积。EST-SSR 的 PCR 扩增程序为：
94℃预变性 5 min；然后 94℃变性 1 min，52℃退
火 1 min，72 ℃ 延 伸 1.5 min，共 35 个 循 环；最 后
72℃延伸 10 min，于 4℃保存。PCR 扩增产物用 6%
变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺 =
19∶1，7.5 mol L–1 尿素，1 × TBE缓冲液)进行检测。
样品点样 5 μL，以博瑞克公司的 D2000 Marker 为
对照，400 V 电压下电泳 140 min，银染法显影，照
相保存。
1.4 数据统计和处理
对 EST-SSR 标记扩增产物的电泳图谱进行人
工比对、校正，统计强带或清晰弱带，按照扩增条带
的分子量从大到小编号和读取，有扩增条带出现记
为“1”，无条带出现记为“0”，建立原始距阵。根据
原始距阵，统计 EST-SSR 标记扩增产物的条带总
数和多态性条带数，计算多态性条带百分率(PPB)
和引物多态性信息含量(PIC)，PICi = 1 – ∑Pij
2，其
中，PICi 表示标记 i 的多态性信息含量，Pij 表示
标记 i 的第 j 个带型出现的频率，标记 i 的总带型
从 1 到 n。利用 NTSY-PC2.10 软件对建立的原始
矩阵采用 UPGMA 法进行聚类分析。对能完全区
分开牛鞭草属 6 个品种的 EST-SSR 引物用于指纹
图谱构建，由 1 和 0 组成的字串即构成数字指纹，
用 Excel 2007 软件转换为指纹图谱标准模式图。
采用 POPGEN v1.32 软件计算 Shannon 信息多样
性指数(I)，Nei’s 遗传多样性指数(He)等群体遗传
参数。
2 结果和分析
2.1 EST-SSR扩增多态性分析
用全部供试材料的基因组 DNA 对 86 对 EST-
SSR 引物进行多态性筛选，基于扩增条带清晰、多
态性丰富、稳定性强的原则，共选出 8 对多态性较
理想的 EST-SSR 引物(图 1)。8 对引物在供试材料
中共扩增出 193 条清晰可辨条带，其中 161 条多态
性条带，多态性百分率为 83.4%，扩增片段长度为
100 ~ 250 bp。平均每对引物扩增条带数为 24.1 条，
多态性条带为 20.1 条。同时，每条引物的多态信息
含 量(PIC) 为 0.480 ~ 0.695，平 均 0.602 (表 2)。 说
明 Kantety 等[25]开发的禾本科通用引物能应用于牛
鞭草的分子遗传多样性研究。
2.2 EST-SSR引物鉴别力分析与指纹图谱构建
利用 NTSY-PC2.10 软件对每对引物建立的原
始矩阵采用 UPGMA 法进行聚类分析，在遗传相似
度为 100% 时，各品种形成单独一支的数量即为每
图 1 部分 EST-SSR 引物的扩增结果。A: 引物 cn142; B: 引物 cn186; C: 引物 cn1119。
Fig.1 Amplification results by part of EST-SSR primer. A: cn142; B: cn186; C: cn1119.
黄秀等：牛鞭草品种EST-SSR指纹图谱构建及遗传多样性分析
168 第22卷热带亚热带植物学报
对引物所能区分开的供试品种数。引物区分的品
种数越多，鉴别力越强。本研究的聚类分析结果表
明，筛选出的 8 对 EST-SSR 引物均能将 6 个品种
全部区分开，表现出了很高的鉴别能力。因此，以
筛选出的 EST-SSR 引物扩增电泳图谱为基础，由 1
和 0 组成的字串构成数字指纹，再经 Excel 2007 软
件转换，建立了基于各引物扩增的 6 个牛鞭草属品
种指纹图谱标准模式图(图 2)，可见每个品种都有
唯一的指纹图谱(带型或基因型)，可以比较容易地
鉴定牛鞭草属的 6 个品种。
2.3 牛鞭草属品种的遗传多样性分析
利用 POPGENv1.32 软件对牛鞭草属 6 个品
种的群体遗传参数进行计算，结果表明，牛鞭草属
6 个品种的平均 Nei’s 基因多样性指数为 0.333，
平均 Shannon 信息指数为 0.496。就各位点而言，
Shannon 信息指数大于基因多样性指数，表明牛鞭
草属 6 个品种间存在丰富的遗传多样性。
2.4 聚类分析
以 牛 鞭 草 属 6 个 品 种 和 193 个 位 点 的 谱 带
数 据 为 原 始 矩 阵，品 种 间 的 遗 传 相 似 系 数 最 大
的 为 0.782 (‘广 益’与‘雅 安’)，最 小 的 为 0.399
(‘Greenalta’ 与‘广益’)。基于遗传相似系数的聚
类分析表明，在遗传相似系数为 0.652 处可以很明
显地把牛鞭草属 6 个品种分为两大类(图 3)。第Ⅰ
类有‘Redalta’、‘Greenalta’、‘Bigalta’品种，第Ⅱ类
由‘广益’、‘雅安’、‘重高’品种组成。在相似系数
为 0.724 处，第Ⅰ类又可分为 2 个小组，第 1 小组由
‘Redalta’和‘Greenalta’ 2 个品种组成，第 2 小组由
‘Bigalta’品种独自组成；第Ⅱ类也可分为 2 个小组，
第 1 小组由‘广益’和‘雅安’2 个品种组成，‘重高’
独自组成第 2 小组。可见，牛鞭草属品种间的差异
明显，来自同一种类、同一地域的牛鞭草品种都聚
为同一类。
3 讨论
近年来，以 DNA 分子标记为基础的指纹图
谱鉴定技术的不断发展与完善，弥补和克服了形
态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷
和难题，成为品种鉴定技术中潜力最大的技术，已
表 2 8 对引物序列
Table 2 Sequences of 8 pairs of primer
引物
Primer
序列
Sequence (5′ ~ 3′)
总条带 Number
of total bands
多态性条带 Number of
polymorphic bands
多态性百分率 % of
polymorphic bands
多态性信息含量 Polymorphic
information content
cnl42 F: ACCTGTGCGGCGATGAAT 23 19 82.6 0.581
R: CAGGAGCAGGAGAACGTGAA
cnl47 F: GTTGGTCTGCTGCTCACTCG 31 29 93.5 0.695
R: CCGACGATGTTGAAGGAGAG
cnl53 F: GACTCGCACGATTTCTCCTC 22 15 68.2 0.480
R: GCCAGACAACCAATTCAGGT
cnl86 F: CACGAGTGCAGAGCTAGACG 20 15 75.0 0.538
R: ACAACAACCCGACTGCTACC
cnl100 F: GGCTCGAGCTTAAAACCCTA 26 21 80.8 0.559
R: CTCCATCCATTCTTGCCATCT
cnl101 F: CAACAACGTCAACGCCTTC 22 19 86.4 0.614
R: GCGTCTTGAACCTCTTGTCC
cnl119 F: CGTCGTCCTCTGCTGTGAG 18 16 88.9 0.690
R: AGGTCGTCCATCTGCTGCT
cnl158 F: CTCATCCCACCACCACCAC 31 27 87.1 0.660
R: CCCTGAAGAA GTCGAACACG
总和 Total 193 161
平均 Average 24.1 20.1 83.4 0.602
第2期 169
图 2 基于部分 EST-SSR 引物扩增的牛鞭草属 6 个品种指纹图谱标准模式图。A: 引物 cn142; B: 引物 cn186; C: 引物 cn1119。
Fig. 2 EST-SSR fingerprinting for 6 cultivars of Hemarthria by part of primer pairs. A: cn142; B: cn186; C: cn1119.
成功运用于紫花苜蓿(Medicago sativa)[26]、马铃薯
(Solanum tuberosum)[27]、萝卜(Raphanus sativus)[28]等
植物中。SSR 标记已成为当前各个作物建库研究
的首选标记之一[29]，但其开发测序费用极高，限制
了它的开发利用。在国际公共数据库中呈指数级
增长的 EST 序列促进了 SSR 的应用，成为 SSR 标
记新的重要开发来源。EST-SSR 标记拥有 SSR 标
记的优势，且克服了其开发费用高的缺点，是较为
理想的分子标记之一[30]。本研究首次将禾本科保
守序列 EST-SSR 标记用于牛鞭草属 6 个品种的鉴
定上，结果表明，禾本科保守序列 EST-SSR 标记具
有较高的多态检出率，筛选出的 8 对引物均能将所
黄秀等：牛鞭草品种EST-SSR指纹图谱构建及遗传多样性分析
170 第22卷热带亚热带植物学报
有供试品种完全区分开，表现出很高的鉴别力。这
表明 EST-SSR 标记技术适用于牛鞭草属品种的指
纹图谱构建，能有效地鉴别牛鞭草属 6 个品种。
牛鞭草属主要靠根茎繁殖，品种内单株间遗传
信息一致，其构建的指纹图谱比多花黑麦草(Lolium
multifolorum)、紫花苜蓿等异花授粉植物构建的指
纹图谱重复性更好，鉴别作用明显。目前，构建指
纹图谱主要有单引物法、引物组合法[31–32]和特征谱
带法 3 种方式。本研究筛选出的 EST-SSR 引物具
有很高的鉴别能力，均能将所有供试品种完全区分
开。因此，本研究采用单引物法，利用能完全区分
供试品种的各引物，建立了牛鞭草属 6 个品种的指
纹图谱标准模式图，而且每个品种都有唯一的指纹
图谱(带型或基因型)。
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