全 文 ：组蛋白脱乙酰化酶(Histone deacetylase, HDAC)
通过去乙酰化作用移除染色质组蛋白上的乙酰基，
从而改变染色质的结构并抑制基因的转录[1–4]。目
前，已有多种 HDACs 在不同在植物中被鉴定出
来，根据它们与酵母 HDACs 序列的相似性，可划
分为 3 大类，一是与酵母 RPD3 和 HDA1 同源的
RPD3/HDA1 超 家 族；二 是 从 玉 米(Zea mays)中 首
次鉴定出来的一类植物特有的 HD2 家族；三是与
酵母 SIR2 蛋白同源的 SIR2 家族[5]。植物 HDACs
广泛参与植物的生长发育及对逆境的响应过程
中[6]。目前在水稻中已鉴定出 18 个 HDACs 成员，
HDA705 属于 RPD3/HDA1 家族成员[7]。
启动子是一段位于基因上游，能与 RNA 聚
合酶及转录因子特异结合、决定基因转录起始的
DNA 序列。启动子由核心元件和上游元件构成[8]。
植物基因工程中常用的启动子按功能及作用方式
收稿日期： 2013–04–17　　　　接受日期： 2013–05–22
基金项目： 广东省科技计划项目(2011A020102008)资助
作者简介： 张伟，女，博士。E-mail: huangzengwei521@126.com
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: duanj@scib.ac.cn
热带亚热带植物学报　2014， 22(1)： 77 ~ 82
Journal of Tropical and Subtropical Botany
水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDA705启动子的克隆
与表达特性分析
张伟1,2, 刘勋成1, 赵金会1, 张建霞1, 段俊1*
(1. 中国科学院华南植物园， 广州 501650; 2. 中国科学院大学， 北京 100049)
摘要： 为探讨水稻(Oryza sativa)组蛋白脱乙酰化酶基因 HDA705 的功能和表达特性，根据 NCBI 上登录的水稻 HDA705 基因
(GenBank 登录号：AK111861)的序列，克隆了 5′ 端 2 kb 的启动子片段 proHDA705，并构建了 proHDA705:GUS 表达载体。通过
农杆菌介导法转化水稻，并获得了转基因株系。GUS 检测结果表明，proHDA705 仅在水稻的根、茎、叶及部分颖壳的表皮毛等
器官中表达，而在花器官中不表达，这表明 HDA705 具有组织表达特异性。
关键词： 水稻； 组蛋白脱乙酰化酶； 启动子； GUS
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2014.01.012
Cloning and Expression Characterization of Histone Deacetylase Gene
HDA705 Promoter in Rice (Oryza sativa)
ZHANG Wei1,2, LIU Xun-cheng1, ZHAO Jin-hui1, ZHANG Jian-xia1, DUAN Jun1*
(1. South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 501650, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract: In order to understand the function and expression character of histone deacetylase gene HDA705
in rice (Oryza sativa), 5′ terminal promoter sequence was cloned with length of 2 kb based on rice HDA705
sequence (GenBank accession No.: AK111861), named proHDA705. The expression vector of proHDA705:GUS
was constructed. The proHDA705:GUS vector was transformed to rice by Agrobacterium-mediated assays. GUS
staining assays of transgenic rice showed that proHDA705 expressed only in root, stem, leave and some epidermal
hair of seed coat, but did not in flower. It was suggested that HDA705 had tissue specific expression in rice.
Key words: Rice; Histone deacetylase; Promoter; GUS
78 第22卷热带亚热带植物学报
可分为 3 大类，即组成型、诱导型和组织特异型启
动子。目前在植物表达载体中常用的是组成型启
动子，如花椰菜(Brassica oleracea var. botrytis)花叶
病毒 CaMV 35S 启动子、玉米的 Ubiquitin 启动子
和水稻的 ActinI 启动子[9]。在组成型启动子的控制
下 , 外源基因在转基因植物体内组成性表达，不受
时间和空间的限制[10]。然而，外源基因在受体植物
内持续、高效的表达往往会引起植物的形态发生改
变，从而影响植物正常的生长发育[11–12]。组织特异
性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器
官或组织部位积累，增加局部表达量，同时也可以
避免植物营养的不必要浪费[13]，因此，对组织特异
型启动子的研究极为重要。
本研究中，我们克隆了 HDA705 的启动子，并
构 建 了 proHDA705:GUS 表 达 载 体，初 步 分 析 了
HDA705 启动子的表达模式，为 HDA705 基因功能
的解析及 HDA705 启动子在转基因研究中的应用
奠定基础。
1 材料和方法
1.1 水稻材料
以 粳 稻(Oryza sativa subsp. japonica)品 种‘日
本晴’基因组 DNA 为模板克隆 HDA705 的启动子
片段，构建好的融合载体转化到粳稻品种‘中花 11’
中。用于定量 RT-PCR 分析的材料为萌发 14 d 的‘日
本晴’幼苗，经 25 μmol L–1 ABA 处理 6 h 和 12 h 后，
分别提取水稻各器官的 RNA。
1.2 菌株、载体以及生化试剂
大 肠 杆 菌(Escherichia coli) JM109、农 杆 菌
(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 和 载 体
pCAMBIA1301 是 由 本 实 验 室 保 存；PMD18-T
载 体 连 接 试 剂 盒、限 制 性 内 切 酶、Ex Taq DNA
Polymerase、rTaq DNA Polymerase 购于宝生物公
司，2 × Reaction Mix、DNA Ladder Marker 购于天
根生化科技有限公司，Trizol 购自 Invitrogen 公司，
M-MLV 逆转录酶购自 Promega 公司，定量 PCR 试
剂 iQTM SYBR® Green 试 剂 盒 购 自 Bio-Rad 公 司。
引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.3 启动子序列的克隆
根 据 NCBI 上 登 录 的 水 稻 HDA705 基 因
(GenBank 登录号：AK111861)的序列，从起始密码
子前面 2 kb 的区域设计引物，以粳稻品种‘日本晴’
的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增。水稻基因
组 DNA 采用 CTAB 法提取[14]。PCR 扩增的引物
有上游引物 F: 5′-CGAAGCTTGAGGAGGTTGGG-
GAAAACGA-3′ 和 下 游 引 物 R: 5′-CGCCATGGT-
TCGGAGGATTTCTTCTTCT-3′。PCR 反应体系为
50 μL：包含 2 × Reaction Mix 25 μL, rTaq DNA 聚
合酶 1 μL, 上下游引物各 1 μL, 模板 DNA 1 μL,
H2O 21 μL，反应程序为：94℃预变性 5 min；94℃变
性 30 s，58.9℃退火 45 s，72℃延伸 2 min，循环
35 次；72℃后延伸 5 min。PCR 扩增产物经 1.0%
琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化，克隆到 pMD18-T
载体中，然后采用热激法转化大肠杆菌感受态细胞
JM109，对单克隆菌落进行 PCR 鉴定，选取阳性克
隆送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.4 RNA的提取、逆转录及定量RT-PCR分析
参 考 Trizol 试 剂 盒 说 明 书 的 操 作 方 法 提 取
水稻 RNA。采用 M-MLV 逆转录酶和 2 μg RNA
并 参 照 试 剂 说 明 书 进 行 逆 转 录 反 应。 定 量 RT-
PCR 采 用 iQTM SYBR® Green 试 剂 盒 进 行，在
ABI 7500 型 荧 光 定 量 PCR 仪 上 进 行 反 应。 用
于 HDA705 表 达 分 析 的 引 物 分 别 为 HDA705-F:
5′-GAGTGAGATTGCAGAGCC-3′ 和 HDA705-R:
5′-GAGTGAGATTGCAGAGCC-3′。 以 组 成 性 表
达 的 水 稻 Actin (GenBank 登 录 号： X15863) 为
内 参 基 因。 扩 增 Actin 的 引 物 分 别 为 ACTIN-F:
5′-CGTGACCTTACCGACAACCT-3′ 和 ACTIN-R:
5′-GCACCTGAACCTTTCTGCTC-3′。
1.5 proHDA705:GUS融合表达载体的构建
利 用 测 序 正 确 的 单 克 隆 大 量 提 取 质 粒，将
提 取 得 到 的 质 粒 和 载 体 pCAMBIA1301 同 时
用 Hind III 和 Nco I 进行酶切，回收目的片段、连
接，即 可 得 到 带 有 proHDA705:GUS 的 表 达 载 体
pCAMBIA1301:HDA705P。采用冻融法将载体转
入农杆菌 EHA105，并挑取菌落进行 PCR 鉴定，阳
性克隆用于水稻的转化。
1.6 农杆菌转化水稻成熟胚愈伤组织
以粳稻品种‘中花 11’的成熟胚诱导的愈伤组
织为受体，采用农杆菌介导的方法，并参照刘巧泉
第1期 79张伟等：水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDA705启动子的克隆与表达特性分析
等[15]的方法将表达载体 proHDA705:GUS 转化到水
稻中。
1.7 转基因水稻植株的PCR检测
按 照 CTAB 法[14]从 水 稻 新 鲜 叶 片 中 提 取 总
DNA。根据表达载体上 GUS 序列设计引物，引物序
列 为 GUS-F：5′-GAGAAACTGCATCAGCCGAT-3′;
NOS-R：5 ′-GACCGGCAACAGGATTCAAT-3 ′。
PCR 反应程序为：94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，
55℃退火 45 s，72℃延伸 60 s，共 30 次循环；最
后 72℃延伸 5 min。PCR 扩增产物经 1.0% 琼脂
糖凝胶电泳分离鉴定。预期 PCR 产物片段长度为
443 bp。
1.8 GUS活性的分析
GUS 活 性 的 组 织 化 学 染 色 分 析 参 照
Jefferson[16]的方法。将待测水稻样品浸入 GUS 染
液中，37℃保温过夜，叶片等绿色组织用 90% 乙
醇脱色后观察。
2 结果和分析
2.1 启动子的克隆及表达载体的构建
根 据 GenBank 中 搜 索 HDA705 基 因 的 启
动子序列设计特异引物，对水稻基因组 DNA 进
行 PCR 扩 增 得 到 全 长 的 启 动 子 片 段，命 名 为
proHDA705(图 1: A)。经双酶切(Hind III 和 Nco I)
后将启动子片段连接到 pCAMBIA1301 载体中。
对 构 建 的 pCAMBIA1301-proHDA705 载 体 再 用
Hind III 和 Nco I 进行酶切，得到约 2 kb 大小的片
段，经 Hind III 和 Spe I 双酶切后，获得约 600 bp 大
小的片段，由于在 pCAMBIA1301 载体上没有 Spe I
酶切位点，而在 proHDA705 片段的 600 bp 处有 1
个 Spe I 酶切位点，因此可以判断 HDA705 启动子
已经成功连接到目的载体中(图 1: B)。同时，测序
结果也表明该片段与 NCBI 网站上登录的 HDA705
基因启动子序列一致，表明 proHDA705:GUS 载体
构建成功。
2.2 启动子序列分析
经 PlantCARE 在线生物信息学软件分析，在
HDA705 启 动 子 区 域 内 含 有 TATA-box 和 CAAT-
box 等启动子特有的作用元件和多个水杨酸和茉莉
酸等的调控元件(图 2)，表明 HDA705 可能参与水
杨酸和茉莉酸诱导表达的代谢途径。此外，在启动
子区域中还含有受干旱及 ABA 诱导的元件，表明
HDA705 还可能参与水稻对逆境的响应过程。
2.3 ABA对水稻HDA705基因表达的影响
在 HDA705 的启动子中含有 ABA 和 JA 等植
物激素响应的顺式作用元件，表明 HDA705 的表达
可能被这些植物激素调控。萌发 14 d 的水稻幼苗
经 25 μmol L–1 ABA 处理 6 h 和 12 h 后 HDA705 的
表达水平均被抑制(图 3)。
2.4 proHDA705:GUS的水稻转化及PCR检测
采用农杆菌介导法将 proHDA705:GUS 导入水
稻愈伤组织，并通过侵染、共培养、筛选、分化以及
生根等步骤获得转基因植株。用 CTAB 法提取转
基因植株的基因组 DNA，设计特异引物进行 PCR
扩增，获得了目的条带，表明 proHDA705:GUS 成功
转入水稻植株中(图 4)。
2.5 proHDA705:GUS融合基因的表达
对 PCR 检 测 结 果 为 阳 性 的 转 基 因 植 株 的
叶、茎、根 和 花 进 行 GUS 染 色 检 测。 结 果 表 明，
proHDA705:GUS 在转基因水稻的叶、茎、颖壳的部
分表皮毛和根等器官中有表达(图 5: A,B,D,E)，而
图 1 HDA705 启 动 子 的 PCR 扩 增(A)和 proHDA705:GUS 表 达 载
体的双酶切检测(B)。M: 2 kb DNA marker；1: HDA705 启动子； 2:
Hind III 和 Nco I 双酶切；3: Hind III 和 Spe I 双酶切。
Fig. 1 PCR of HDA705 promoter (A) and proHDA705:GUS digested
by two enzymes. M: 2 kb DNA marker; 1: HDA705 promoter; 2:
Digestion with Hind III and Nco I; 3: Digestion with Hind III and Spe I.
80 第22卷热带亚热带植物学报
图 2 HDA705 启动子序列。黑色方框：TATA box；阴影：CAAT box；#: 水杨酸应答元件；*: 茉莉酸应答元件；▲: 干旱诱导元件； ◊: 脱落酸应答
元件。
Fig. 2 Sequence of HDA705 promoter. TATA box were framed by black box, and shadows showing CAAT box; #: Salicylic acid responsive element; *:
Jasmonic acid responsive element; ▲: Drought inducible element; ◊ : ABA responsive element.
图 3 RT-PCR 分 析 ABA 处 理 对 水 稻 HDA705 基 因 表 达 的 影 响。
Actin 为内参基因。
Fig. 3 Effect of ABA on expression of HDA705 in rice by quantitative
RT-PCR. Actin was used as an internal control.
图 4 转基因水稻植株的 PCR 检测。M: 2 kb DNA marker; 1: 非转基
因植株；2,3,4: 转基因植株。
Fig. 4 PCR detection of transgenic plants. M: 2 kb DNA marker; 1:
Non-transgenic plant; 2,3,4: Transgenic plants.
第1期 81张伟等：水稻组蛋白脱乙酰化酶基因HDA705启动子的克隆与表达特性分析
在花中不表达(图 5: C)，表明 HDA705 的表达具有
组织特异性。
3 讨论
HDAC 通过调节染色质组蛋白的乙酰化状态
而调控基因的转录，广泛参与植物的生长发育与
对逆境响应过程[6]。研究 HDAC 的表达模式对于
解析 HDAC 的功能具有重要的指导意义。在水稻
HDAC 基因家族启动子的研究方面，目前仅报道
HDA702 启动子在叶片中有表达[17]，还未见有关其
它 HDAC 基因启动子的研究报道。在本研究中，
我们克隆了水稻 HDA705 的启动子片段，该启动子
区域具有一系列的水杨酸，茉莉酸，脱落酸及干旱
等生物及非生物胁迫相关的应答元件(图 2)。Chen
等[18]的研究表明，拟南芥中与水稻 HDA705 同源的
基因 HDA6 参与了对 ABA 及盐胁迫的响应。我
们的研究结果表明，ABA 处理能抑制 HDA705 的
表达(图 3)，同时，茉莉酸处理能诱导水稻 HDA705
的表达[7]；这些结果表明 HDA705 可能参与到水稻
对多种植物生长调节剂及非生物逆境的响应途径。
对 proHDA705 转基因水稻阳性植株的 GUS 染色
检测结果表明，HDA705 在根、茎、叶及部分颖壳
的表皮毛等器官中表达，而在花器官中不表达(图
5)，这与拟南芥中与之同源的基因 HDA6 的启动子
的表达特性相似，拟南芥 proHDA6 也只在拟南芥
的下胚轴、子叶及成熟叶片和茎中表达，在雄蕊中
不表达[19]。拟南芥 HDA6 参与叶片的形态发育过
程[20]，表明水稻的 HDA705 可能也特异性参与抗逆
响应及营养器官发育等途径。
目前，组成型、诱导型和组织特异型启动子是
植物基因工程中 3 种常用的启动子[9]。组织特异性
启动子也称为器官特异性启动子，该类启动子所调
控的下游基因往往只在某些特定的器官或组织部
位表达。植物基因工程研究表明，组织特异型启动
子由于其表达具有空间特异性而能有效地提高转
图 5 proHDA705:GUS 融合基因在水稻中的表达。A: 叶片； B: 茎； C: 花； D: 颖壳； E: 非转基因(上)和转基因植株(下)的幼叶。
Fig. 5 Expression of proHDA705:GUS in rice. A: Leaf; B: Stem; C: Flower; D: Glume; E: Young leaf of non-transgenic plant (up) and transgenic plant (down).
82 第22卷热带亚热带植物学报
基因的效果，较组成型和诱导型启动子具有明显的
优越性[21]。如豌豆(Pisum sativum)的豆清蛋白基因
启动子 LeB4 专一性地在植物种子中表达[22]，而马
铃薯(Solanum tuberosum)块茎储藏蛋白基因启动子
B33 在块茎中优势表达[23]。在本研究中， HDA705
启动子在水稻的根、茎、叶等营养器官中表达，而
在生殖器官花中不表达，表明 HDA705 启动子具
有明显的组织特异性，属于组织特异型启动子，在
水稻基因工程研究和转基因工程中可能具有较好
的应用前景，例如，在水稻的抗逆育种中，可以将
HDA705 启动子驱动的抗除草剂目的基因导入到
水稻中，不但可以在提高水稻对除草剂的抗性，同
时还可避免抗除草剂这一性状因花粉扩散而发生漂
移的问题，从而使得水稻的抗除草剂育种更加安全。
综上所述，本研究鉴定的 HDA705 启动子的表
达特征对 HDAC 基因功能的分析及植物转基因研
究均具有重要的科学和实践意义。
参考文献
[1]　 Eberharter A, Becker P B. Histone acetylation: A switch between
repressive and permissive chromatin (second in review series on
chromatin dynamics) [J]. EMBO Rep, 2002, 3(3): 224–229.
[2]　 Kuo M H, Allis C D. Roles of histone acetyltransferases and
deacetylases in gene regulation [J]. Bioessays, 1998, 20(8): 615–626.
[3]　 Sterner D E, Berger S L. Acetylation of histones and transcription-
related factors [J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2000, 64(2): 435–459.
[4]　 Struhl K. Histone acetylation and transcriptional regulatory
mechanisms [J]. Genes Dev, 1998, 12(5): 599–606.
[5]　 Pandey R, Muller A, Napoli C A, et al. Analysis of histone acetyl-
transferase and histone deacetylase families of Arabidopsis thaliana
suggests functional diversification of chromatin modification
among multicellular eukaryotes [J]. Nucl Acid Res, 2002, 30(23):
5036–5055.
[6]　 Luo M, Liu X C, Singh P, et al. Chromatin modifications and
remodeling in plant abiotic stress responses [J]. Biochim Biophys
Acta, 2012, 1819(2):129–136.
[7]　 Fu W Q, Wu K Q, Duan J. Sequence and expression analysis of
histone deacetylases in rice [J]. Biochem Biophys Res Commun,
2007, 356(4): 843–850.
[8]　 Nie L N, Xia L Q, Xu Z S, et al. Progress on cloning and functional
study of plant gene promoters [J]. J Plant Genet Res, 2008, 9(3):
385–391.
聂丽娜, 夏兰琴, 徐兆师, 等. 植物基因启动子的克隆及其功能
研究进展 [J]. 植物遗传资源学报, 2008, 9(3): 385–391.
[9]　 Pogue G P, Lindbo J A, Dawson W O, et al. Tobamovirus transient
expression vectors: Tools for plant biology and high-level expression
of foreign proteins in plants [M]// Gelvin S B, Schilperoort R
A. Plant Molecular Biology Manual. 2nd ed. Dordrecht, The
Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 1998: 1–27.
[10]　 Dessens J T, Lomonossoff G P. Cauliflower mosaic virus 35S
promoter-controlled DNA copies of cowpea mosaic virus RNAs
are infectious on plants [J]. J Gen Virol, 1993, 74(5): 889–892.
[11]　 Chen H, Nelson R S, Sherwood J L. Enhanced recovery of
transformants of Agrobacterium tumefaciens after freeze-thaw
transformation and drug selection [J]. BioTechniques, 1994,
16(4): 664–668, 670.
[12]　 Carrington J C, Freed D D. Cap-independent enhancement of
translation by a plant potyvirus 5′ nontranslated region [J]. J Virol,
1990, 64(4): 1590–1597.
[13]　 Song Y, Zhou J H, Zhang Y Q. Research on plant tissue-specific
promoters [J]. Biotechn Bull, 2007(6): 21–24.
宋扬, 周军会, 张永强. 植物组织特异性启动子研究 [J]. 生物
技术通报, 2007(6): 21–24.
[14]　 Liu Q Q, Zhang J L, Wang Z Y, et al. A highly efficient trans-
formation system mediated by Agrobacterium tumefaciens
in rice (Oryza sativa L.) [J]. Acta Phytophy Sin, 1998, 24(3):
259–271.
刘巧泉, 张景六, 王宗阳, 等. 根癌农杆菌介导的水稻高效转化
系统的建立 [J]. 植物生理学报, 1998, 24(3): 259–271.
[15]　 Yan M M, Wei G C, Pan X H, et al. A method suitable for extracting
genomic DNA from animal and plant: Modified CTAB method
[J]. Agri Sci Techn, 2008, 9(2): 39–41.
[16]　 Jefferson R A. Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene
fusion system [J]. Plant Mol Biol Rep, 1987, 5(4): 387–405.
[17]　 Hu Y F, Qin F J, Huang L M, et al. Rice histone deacetylase genes
display specific expression patterns and developmental functions
[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 388(2): 266–271.
[18]　 Chen L T, Luo M, Wang Y Y, et al. Involvement of Arabidopsis
histone deacetylase HDA6 in ABA and salt stress response [J]. J
Exp Bot, 2010, 61(12): 3345–3353.
[19]　 Wu K Q, Zhang L, Zhou C H, et al. HDA6 is required for
jasmonate response, senescence and flowering in Arabidopsis [J].
J Exp Bot, 2008, 59(2): 225–234.
[20]　 Luo M, Yu C W, Chen F F, et al. Histone deacetylase HDA6 is
functionally associated with AS1 in repression of KNOX genes
in Arabidopsis [J]. PLoS Genet, 2012, 8(12): e1003114.
[21]　 Fluhr R, Kuhlemeier C, Nagy F, et al. Organ-specific and light-
induced expression of plant genes [J]. Science, 1986, 232(4754):
1106–1112.
[22]　 Zakharov A, Giersberg M, Hosein F, et al. Seed-specific promoters
direct gene expression in non-seed tissue [J]. J Exp Bot, 2004,
55(402): 1463–1471.
[23]　 Naumkina E M, Bolyakina Y P, Romanov G A. Organ-specificity
and inducibility of patatin class I promoter from potato in
transgenic Arabidopsis plants [J]. Russ J Plant Physl, 2007,
54(3): 350–359.