全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，14(4)：307—31 1
Journal ofTropical and Subtropical Botany
低温预处理对水稻花药培养中
花药壁褐变的结构影响
姚 焱 ，刘向东2，汪珍春 ，张桂权2，张 平
(1．广州大学生命科学学院，广州 510006；2．华南农业大学植物分子育种研究中心，广州510642)
摘要：药壁褐变是影响花药离体培养效率的因素。研究了粳稻品种台中 65(Oryza$oltlaL．)花药培养前低温预处理对
药壁褐变的影响，观察了花药褐变前后药壁各层的变化及褐变对小孢子发育的作用。结果表明：药壁褐变主要发生在
表皮与药室内壁。10~C~温预处理在花药培养前期可有效延缓表皮与药室内壁膜结构的降解速度，减缓褐变发生；花
药经低温处理后，药壁中层细胞膨大，绒毡层降解速度减缓，有利于花粉脱分化。药壁褐变会影响药腔内小孢子的活力
和继续发育，但不是制约花粉愈伤组织形成的关键因素。
关键词：水稻：花药培养：低温处理；花药壁褐变；解剖学
中图分类号：Q944．42 文献标识码 ：A 文章编号：1005—3395(2006)04—0307—05
Efects of Cold Pretreatment on the Structure of Anther W all
Browning in Japonica Rice during Anther Culture
YA0 Yan ， L I U X i ang—dong ， WANG Zhen—chun ， ZHANG Gu i—quan ，ZHANG P i ng
(1．College of￡ Science，Guangzhou University，Guangzhou510006，China；2．Plant Molecular B~edingResearch Center，
South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)
Abstract：Anther wal browning in variety Taichung 65 ofjaponica rice(Oryza s~iva L．)was studied through cold
pretreatment of anthers at late uninucleate stage． Some microstmctural and ultrastructural changes in the an ther
wal were found during an ther culture．An atomical observation showed that an ther wal brown ing took place
mainly in epidermis and endothecium． Cold pretreatment of anthers at 1 0℃ could efectively reduce the brown ing
rate during the early culture period and delay degradation of the membran e structures of epiderm is an d endo—
thecium，and thus postpone brown ing in an ther wal1．M ean while，cold pretreatment contributed to stimulating cell
enlargement in the middle layer an d delaying tapetum degrada tion， which produced positive efects on the
microspore dediferentiation．Although anther wal brown ing favored microspore in vigor and development，it was
not the key factor in reducing the ability ofpollen callus induction．
Key words：Oryza sativa L．；An ther culture；Cold pretreatment；An ther wall brown ing；An atomy
水稻花药培养过程中，药壁组织对促进花粉愈
伤组织的形成有积极作用[1,21。但培养时药壁经常发
生褐变，大大影响了花粉愈伤组织的形成。为了提
高花药培养效率，常采用低温预处理花药的方法。
低温可有效抑制花药壁的衰退，有益于花粉脱分
化[31。但低温处理是否能抑制药壁褐变，而且药壁褐
变对花粉发育如何产生作用没有相关报道。
植物培养物的褐变是由于多酚氧化酶 (PPO)
收稿日期：2005—12-29 接受日期：2006-05·10
基金项目：国家自然科学基金 (39970048)和霍英东教育基金 (71021)资助
维普资讯 http://www.cqvip.com
热带亚热带植物学报 第 14卷
催化酚类物质生成褐色醌类物质而造成的。一般多
酚氧化酶分布于细胞质体中，酚类物质存在于液泡
中，培养过程中细胞结构损伤，会打破 PPO与酚类
物质的区域化分布，造成培养物褐变[4】。
目前相关褐变研究集中在培养物褐变的理化
基础[5I6]、离体培养条件下如何减少褐变 等方面，果
实贮存与加工过程中的褐变现象[8】也有较多涉及。
但针对花药培养过程中药壁褐变发生的细胞学机
理研究甚少。为此，我们采用低温预处理水稻花药，
研究低温对花药壁褐变的效应，旨在揭示低温对水
稻离体培养条件下花药壁组织结构的影响，并对药
壁与花粉愈伤组织形成的关系进行探讨。
1材料和方法
材料 粳 稻 品种 台 中 65(Oryza sativa L．
subsp．japonica)。
花药培养 依据穗的外部特征和镜检核对，
在晴天露水干后采取小孢子晚期 (又称单核晚期或
单核靠边期)稻穗，经过 10d低温 (10±I~C)预处理
后接种 (以直接培养作对照)。每处理接种花药3 000
枚左右。培养基为N6+2，4．D2mgL- +NAA3mgL- +
KT 1 mg L- +麦芽糖 5％+水解乳蛋白500 mg L- 。
26—28~C下暗培养，诱导产生花粉愈伤组织。接种
8d、18d和 28d统计花药褐变率。
显微和超微结构观察 定期随机取培养中
的花药，固定、脱水、渗透、包埋和切片等均参照冯
九焕 的方法。先进行半薄切片观察，选定合适观察
材料制备超薄切片 (每类样本选 3—5枚花药)，醋
酸双氧铀 ．柠檬酸铅双重染色，JEM．1010型透射电
子显微镜下观察并拍照。
2结果
2．1花药褐变率
花药在离体培养条件下，逐渐由接种时的淡黄
色转为深褐色，统计直接培养与处理培养条件下的
花药褐变率 (表 1)。
培养 8 d，处理培养花药的褐变率显著低于直
接培养的花药；但随着培养时间的延长，花药抗褐
变能力下降，培养 18 d时，与直接培养的差异己不
明显。
表 1直接培养和低温处理培养条件下的花药褐变率
Table l Anther browning rates(％)in cold pretreated and
untreated rice anthers
2．2花药壁的显微和超微结构
培养前的正常花药壁结构：表皮、药室内壁、中
层、绒毡层等各层明显，小孢子处于小孢子晚期 (图
版 I：1)。表皮、药室内壁与中层有中央大液泡，将细
胞器挤压至靠细胞壁侧；绒毡层细胞质浓 (图版 I：
2)。
直接培养时的花药壁变化：培养 1 d后，表皮细
胞内膜系统被破坏，胞质异常；药室内壁受破坏程
度较轻，液泡基本完整。中层、绒毡层仍存在 (图版
I：3)：培养 4 d后，表皮细胞和药室内壁降解严重，
集聚大量黑色颗粒物；药室内壁垂直向壁逐渐加
厚，有助于花药开裂散粉。中层与绒毡层已降解消
失 (图版 I：4)。结合显微切片，直接培养 4d时小孢
子干瘪死亡率为53．8％。
处理培养时的花药壁变化：在低温处理 10 d
后，小孢子大部分具有正常活力，药壁仍具明显四
层结构：表皮细胞存在大液泡，药室内壁细胞质浓，
含丰富的细胞器；中层、绒毡层存在(图版 I：5)。处
理花药培养 4 d后，表皮细胞存在大液泡；药室内壁
具有丰富细胞器；中层未降解消失反而异常膨大；
绒毡层仅存少量残迹 (图版 I：6)；结合显微切片，已
脱分化的多细胞花粉粒出现在中层膨大的药腔内
的几率达 83．9％(图版 I：8)：此时小孢子干瘪死亡
率为 38．2％。培养 6 d后，表皮细胞膜结构已破坏，
胞内聚集黑色颗粒物，药室内壁含丰富的质体，液
泡基本完整，还未有黑色物质生成：膨大中层逐渐
降解，绒毡层消失 (图版 I：7)。培养 8 d左右，表皮
与药室内壁均有黑色物质聚集，中层与绒毡层消失
(图版 I：9)。此时小孢子干瘪死亡率为 56．1％。
3讨论
3．1低温预处理抑制花药壁褐变的原因
水稻花药经低温预处理后可有效抑制培养早
维普资讯 http://www.cqvip.com
第4期 姚焱等：低温预处理对水稻花药培养过程中花药壁褐变的结构影响 309
期的药壁褐变。褐变是由于PPO催化酚类物质生成
褐色醌类物质而造成的[4]。通过对药壁结构的观察
发现：低温处理延缓了表皮与药室内壁细胞内膜系
统的降解速度，有利于多酚氧化酶 (分布在细胞质
体中)与酚类物质 (分布于液泡中)的区域化，推迟
了PPO催化酚类的速度，因此延缓了花药壁褐变。
对培养物褐变的生理机制有零星报道。Tang等
发现松树培养物褐变时会造成多胺物质含量的下
降【5】；褐变发生前后，外植体细胞内的PPO、抗氧化
物酶含量会发生变化[5,61；褐变外植体总酚含量和苯
丙胺酸解氨酶 (PAL1活性会随褐变程度的加重逐
渐增加【姗。Laukkanen等同、许传俊等【 D】还分析了褐变
物质的化学成分，其中含有有毒的鞣质～单宁。至于
水稻花药壁褐变的生理生化机制还需进一步研究。
3．2 花药壁结构与花粉愈伤组织诱导的关系
药壁组织对花粉愈伤组织的形成有重要影
响【I 2]，尤其是绒毡层对小孢子脱分化的作用。其它
药壁结构对花粉脱分化的影响和作用却了解不多。
通过观察发现，表皮、药室内壁和中层对花粉愈伤
组织的形成具有不同程度的作用。首先，位于花药
外围的表皮与药室内壁发生褐变后，褐变的有毒物
质会对药腔花粉产生毒害，造成小孢子死亡或抑制
花粉愈伤组织的形成和发育。但这种影响和抑制是
在药壁褐变后产生的，如果采取一定方法延缓或阻
止褐变，那么这种抑制作用会降低；其次，我们观察
到中层在离体培养早期出现了异常膨大现象，这可
能与小孢子脱分化有关。Cl6ment C和 Audran认为
中层是控制糖类由外围药壁转运至药腔内小孢子
的营养输送通道[1】。本研究也发现中层膨大有助于
多细胞花粉粒的形成。
值得注意的是，花药培养的早期是中层与绒毡
层发生较大变化的时期，这往往也是小孢子脱分化
的关键时期。结合前人研究，我们认为中层和绒毡
层是诱导花粉愈伤组织的主要药壁因子，而表皮与
药室内壁的褐变，只能对己分化小孢子的继续分裂
和发育造成影响，不是制约花粉愈伤组织形成的关
键因素。
参考文献
【1】Hebefle-Bo~E．Isolated polen culture in tobaeoo：plant reprodue-
rive development in a nutshel【J】．Sex Plant Reprod，1989，2：1—
10．
[2] Yao Y(姚焱)，Lu Y G(卢永根)’Liu x D(刘 向东)，et a1．
Cyt0lo西cal studies on the polen and anther ofTaichung 65(Oryza
sativaL．subsp．j~onica)duringtheantherculture【J】．Chin JRice
Sci(中国水稻科学)，2004，l8(2)：ll3一ll8．(in Chinese)
【3】 Zhong H x(钟华鑫)’Fang G w(方国伟)，Liang H M(梁海曼)．
Efects ofcoldpretreatment onthe eficien cy ofindica riceanther
culture【J】．Aeta Phytophysiol sin(植物生理学报)，1987，l3(2)：
144—153．(in Chinese)
【4】 Luo X F(罗晓芳)’Tian Y T(田砚亭)，Yao H J(姚洪 军)．
Polyphenol oxidase activities and phenol contents in tissue culture
[J]．J Beijing For Univ(北京林业大学学报)，1999，21(1)：92—95．
(inChinese)
【5】TangW，NewtonR J．Increaseofpolyphenol oxidaseanddecrease
of po lyamines correlate witIl tissue browning in Virginia pine
(P／nus virginians Mil1．)[J】．Plant Sci，2004，(167)：621-628．
【6】 Laukkanen H，Rautiainen L，Taulavuori E，et a1．Changes in
cellular structures an d enzymatic activities during browning of
Scots pine calus derived from mature buds【J】．Tree Physiol，
2000，(2o)：467-475．
【7】 Wu H C，Toit E S．Reducing oxidative brown ing during／n vitro
establishment ofProtea cynaroides[J]．Sci Hort，2004，(100)：355-
358．
【8】Duan X w(段学武)，Jiang Y M(蒋跃明)，Su X G(苏新国)I et a1．
Efects ofpure oxygen onbrowningin Litehifruitan d changesin
ultrastrueture ofpeel tissue during storage【J】．J Trop Subtrop Bot
(热带亚热带植物学报)，2004，12(6)：565—568．(in Chinese)
【9】 Feng JH(冯九焕)，LuYG(卢永根)，LiuXD(刘向东)’et a1．
Polen developmentandits stagesin rice(Oryza sativ口)【J]．Chin J
Rice Sci(中国水稻科学)，2001，15(1)：21—28．(inChinese)
【lO】xu C J(许传俊)，Li L(李玲)，Li H(李红)，et a1．Preliminary
studies on the elements ofbrowning an d the changes in cellular
texture ofleafexplant browning in Pha／aenops／s[J]．Acta Hort Sin
(园艺学报)，2005，32(6)：llll一1ll3．(inChinese)
【ll】C16mentC，Audran J C．Antherwall Layers control pollen sugar
nutritoninLilium[J】．Protoplasma,1995，187：l72-181．
图版说明
图版 I
EP：表皮；EN：药室内壁；／VIE：中层；TA：绒毡层；v：液泡：
P：质体：M：线粒体。
1．培养前正常花药壁结构及单核小孢子：x400
2．培养前正常花药壁超微结构：x3 000
3．直接培养 l d的药壁结构：表皮细胞膜结构破坏；x3 000
4．直接培养 4d的药壁结构：表皮、药室内壁积存黑色物质，中层、绒
毡层消失：x3 000
5．低温预处理 10d的花药；x3 000
6．处理后培养 4 d的药壁结构：膨大的中层：x4 000
7．处理后培养 6 d的药壁结构；x4000
8．处理后培养 4 d的药壁及小孢子的显微结构：膨大的中层及多细
维普资讯 http://www.cqvip.com
3l0 热带亚热带植物学报 第 l4卷
胞花粉粒：xl 000
9．处理后培养 8 d的药壁及小孢子的显微结构。xl 000
Explanation ofplates
PlateI
EP：Epidermis；EN：Endothecium； Middle layer,T Tapetum；
V：Vacuole；P：Plastid；M：Mitochondria．
I．Normal structure of allther wall and microspores before an ther
culture；x400
2．Normalultrastructureofantherwallbeforean therculture；x3 ooO
3．Anther wall after untreated culturefor l d：showingthe membrane
structure ofepidermis being destroyed；x3 000
4．Anther wal after untreated culture for 4 d：showing black substances
gath ng in epidermis and endothecium，middle layer an d tapetum
absent；x3Ooo
5．An therwall coldpretreatmentfor l0d：x3 ooO
6．An therwal afterpretreated culturefor4 d：showingthemiddlelayer
being enlarged；x4 000
7．An therwall afterpretreated culturefor6 d；x4000
8．An ther wall and microspores after pretreated culture for 4 d：showing
the enlarged middle layer and multicellular pollen；xl 000
9．An ther wall and microspores afterpretreated culture for 6 d．xl 000
维普资讯 http://www.cqvip.com
魂4晡 姚酶等：低 处 埘水稍fE药蚺f- -}】化药 鹊蹙问钻{壬J c
二
姚蠊等：I刊． YA()Yfil c1 a1
． Mate
豢
维普资讯 http://www.cqvip.com