全 文 ：核 农 学 报 , 比一 。
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水稻联合固氮菌质粒的鉴定
一 及固氮 基因定位
王惠贤 苑红丽 尤崇构
中国农业科学院原子能利用研究所 北京
应 用改进的 法提取质拉 , 鉴定 了供试 菌袜的质粒 存 在 情 况 高 玄和
培养 的 。 。 。 ‘。 一 ,
,
和吞口 ‘ 夕了 分别携有 一 个 大质拉 , 分子量在 一
丫迁之何丫 了 汀 和 含有小质 杜 才
不携质拉 。 供试 菌袜中 与 探针 和 一 均具 有同源
性
。
, 和 二少 的 基因位 于染 色体
上 , 币丑声扔 仰卫 。的抓 基因则位 于一个较大质粒上
。
关镶词 水稻联合 固氮菌
’
质粒 基 因
前 言
粪产碱菌 卯了 。。。 。。 ’ 等联合固氮菌广泛分布在水稻 田中 , 具有较 强 的固
氮能力 , 是水稻的潜在肥源“ 丁
。
但是 , 由于土壤中环境条件的变化 , 特别是结合氮的存在 ,
影响其面氮效率 〔“ ’。 随着分子遗传学的发展和应用 , 遗传操作已成为提高 固 氮效率的重要
途径 , 固氮基因的遗传学 分析是迸行遗传操作的基础
。
木工作对儿种水稻联合固氮菌的质粒进行了分离和鉴定 , 井对共 丛 囚进行 了定 位 分
析 。
补 料 和 方 法
材料 术工作所采用的菌 株 和质粒如表
。
’
亩体培养 了 。。 采用修改的 。 培养基 ‘ , , 在 ℃一卜振荡培养
。
其
‘
己九种供试固氮 断采用的培养基 每升含蔗糖 , ‘ 铭 , 、 ‘ , 柠檬
酸铁 , ‘
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此文于 年 月 日收到
· 现在工作单位 中国农科院作物所 ,
核 农 学 报 卷 夜
, , 在 ℃下振荡培养 。 。。 ’菌株在 培养塞中
,
基中加氯霉素 , 氨节青霉素
。
培养基中加入 的琼脂 。
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半 固 体培养基是在上述
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菌株和质粒 来源和参考文献
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」 儿 广东微生物所 , 本所
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国际水稻所
中国科学院植物生理所
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一 荷兰瓦格宁根农业大学
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圈抓吮清诊斌定 采用乙块还原法 〔竺将待测菌株接种于相应的半固体培养基中 , 两天后
注人占气柑体积功 的 , 、 继续培养 小时后 , 用 “ “ 。 型气相色谱测定
质较 的提取与电泳鉴定 采用改进的 方法 〔。 ’提取质粒
。 。。。。八 等
固氮菌按 法培养至 。 。值为 一 。时收集菌体
。
用 缓冲液 ,
, 洗涤 次 , 然后将 菌体悬浮于 缓冲液中 , 加 入 。 垃 溶 菌
产
水稻联合固氮菌质粒的 鉴定及固氮 鉴 因定位
液 , , , 连 , 搅拌混合 秒
, 然后在
℃下保 温 一 溶菌
, 待 温度降至室温后 , 再加入 。 缓冲液 进
行中和 , 搅拌 , 混匀后加入 至最终浓度为 。 , 室温放置 。。
后 , 加入等体积及 饱 和酚溶液 , 士 搅宇卜混合 秒后 , 再 搅拌混合 ,
离心 , 取上清液 , 加入 体积 。 混匀 , 再加入 体积无水
乙醇 , 在一 ℃下过 夜 , 离心收集沉淀 , 真空干燥后 , 溶于 等冲液中
。
电泳采用水 平式 电泳槽 。
·
琼脂搪浓度为 。
,
, 电泳缓冲液为 硼酸 ,
, 。 邻 质粒粗提液与 时样品指示液 澳酚 兰一 甘 油 混 匀 ,
屯温下 电泳 , 电压为 电泳时问为‘ 小时 。 电泳后把凝胶取出置于 含 随
的 中浸泡半小时 , 染色后用蒸馏水冲洗
, 紫外灯下 观察照相
。
。。 甘诊衬印迹杂交 一 总 制备 参照 。 法 〔 ’。
迄产忿 一 探 针 ’勺制备 质拉 , 川 按 裂解法 〔“ 抽 提 。 利 用 电
、眺脱槽回收质粒
, 经透析 , 乙 醇沉淀得到纯质粒 , 用缺刻翻译法 仁“ , 标记
, 通 过 。
一 柱 , 分离得到 一 “ “ 尽 标记的 , 放射 比活度为 一 卜
。
消解
、
电泳
、
转移和杂交 限制性 内叨晦将总 二笠 洲肖解 , 然 后在
凉脂糖凝胶 内含 件 上 电泳分离 , 紫外灯下 观察照相
。 再将凝胶置于 。
一 中 , 二三工从
一
卜 使 变性 , 蒸馏水冲洗后 , 在 一
一 缓冲液 五 中 , 室温下放置
。
按 。时 转移技术 将 转移到硝
酸纤维素膜上
, 将膜在 ℃下真空千燥 协“时 〔‘ 。 ’
。 ℃预杂交 一 小时后
, 杂交 小时 。
在室温下使膜干燥 , 用 光片进行放射 自显影 。
主要化学试剂 限制性核酸 内切酶 , , , 琼脂糖 华美生物工程 公司
。 , 酶 , 酶 , 聚 合
、
盗悠, 蛋 他步 加
, 溶菌酶 上海禽类蛋品,公司 , 一“ “ 福瑞公司 。 其它为因产分析
纯试剂 。
结 果 与 讨 论
, 质粒鉴定
川改进 法提取质粒 , 经 电泳分离结采表明 图版工 , 除 。二 任 玲
外 , 其 余供试菌株均携带质粒 。 其中 时 , 。。 及 和
分别携带 一 个大质粒
。 以大豆 根 瘤 菌 尺 ￡二 。 ,
质粒为标准 , 估测这些大质粒的分子量 , 其范围在 一 之间
。
二 基因的鉴定和定位
、
固氮酶 舌性测定 供试菌株的固氮酶活性如农 所示
。 除 支培养的 。。。。八
没有活性和尸
, 。。。人。 。夕沉 。活性很低外 , 其余菌株均具有固氮酶活 性
。
基因的 皇定 少携 有 玉质拉 不】拢有 。 一 质粒 为探
针 , 鉴定了供试菌株的 基 因 。 图版 、 图版 为供 试菌株的总 经不同内切 酶消解后
的电泳图谱和相应的杂交图谱 。 杂交结果表明 , 供试菌株的某些 片段与 探 针 和
核 农 学 报 卷
的 基 因有同源性 。 基 因同源性片段 的限制性分析列于表
。
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图版 不同菌株提取物中质粒 入琼脂据凝胶电泳谱
。
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表 供试菌株固氮旅活性
一
固氮酶活性
菌 株
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期 水稻联合 固氮菌质粒的 鉴定及固氮 基因定位
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多盆 蒸熟私忿、沈厂令、式
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参分
一 产 汾货
麟
争 、 认 终
图版 几种固氮菌中不同限制性 片段与 探针间的杂交作用
王 工
亡 刁 , ‘召 方 主
王
。
一 又 川
入一 。
囚氮 卜物之间 基囚是具有同源性的 〔“
。
水实验中 , 月 创 。 沁 等联 合固氮菌
株的 能与异源 杂交 , 而 非固氮生物的 入 则不能产生杂交信 号 , 可 以认
为 , 与固氮菌 杂交是 由于 基囚的存在及其特异性的结果
。
抽工固氮酶活性的 “ 关闭 ” 作用 已 有 证 明 〔‘ “ 」 , 但 在 高 玄连 续
墙养下是否能合成 固氮酶仍有争议
口 应 用 和 质粒为探针鉴定的结果表明 , 在
士连续培养下 , 沁 巧 与 培养 的左 川川司 , 都含有 基 因 ,
最近 , 严分离
、 纯化了 ” 产物 仁‘ “ ’
。 这说明 , 从丛囚与蛋 自质水
一
平上都证 实 了在 立
培养下仍能合成 固氮酶 , 但无活性 表 。
基 因定位 将 ,
、 不日 的
在 琼脂糖凝胶 匕电泳分离后 , 转移到硝酸纤维索膜上 , 分别川 七述 和
一 探针杂交 , 结果表明 , 丛 囚旅 位于细 中的某一个复制 护上 。 图版 为杂交结果
。 月
八 , 时日 。 , 州 的杂交信 号在染 色体上
, 而 ‘
则位于一个较大的质粒上 。
期 水稻联合 固氮菌质粒的 鉴定及固氮 基因定位
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图版 几种固氮菌中不同限制性 片段与 探针间的杂交作用
王 工
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水实验中 , 月 创 。 沁 等联 合固氮菌
株的 能与异源 杂交 , 而 非固氮生物的 入 则不能产生杂交信 号 , 可 以认
为 , 与固氮菌 杂交是 由于 基囚的存在及其特异性的结果
。
抽工固氮酶活性的 “ 关闭 ” 作用 已 有 证 明 〔‘ “ 」 , 但 在 高 玄连 续
墙养下是否能合成 固氮酶仍有争议
口 应 用 和 质粒为探针鉴定的结果表明 , 在
士连续培养下 , 沁 巧 与 培养 的左 川川司 , 都含有 基 因 ,
最近 , 严分离
、 纯化了 ” 产物 仁‘ “ ’
。 这说明 , 从丛囚与蛋 自质水
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平上都证 实 了在 立
培养下仍能合成 固氮酶 , 但无活性 表 。
基 因定位 将 ,
、 不日 的
在 琼脂糖凝胶 匕电泳分离后 , 转移到硝酸纤维索膜上 , 分别川 七述 和
一 探针杂交 , 结果表明 , 丛 囚旅 位于细 中的某一个复制 护上 。 图版 为杂交结果
。 月
八 , 时日 。 , 州 的杂交信 号在染 色体上
, 而 ‘
则位于一个较大的质粒上 。
期 水稻联 合固氮菌质粒的 鉴定及固氮 基 因定位
已有报道 , 快生型根瘤菌和一些联合固氮菌如 讨 。了。 。 和
,、。 ,‘ , 等 〔‘ 毛 」的 基因位于少、质粒上
。
本研究表明 , 的 基 夕也位于其
一
扫一个大质粒上
。
至于这些 基因 的详细图谱 , 有待进一步研究
。
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图版万 供试菌株 入 与 或 迁 一 探针间杂交结果
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参 考 文 献
〔日 尤 崇构等 粪产碱菌的培养及其生理特性 。 原子能农业应用 ,
, 了一
。
〔幻 张跃林等 粪产碱菌 比与水稻根的 结合作用
。
植物生理学通讯 , , 一
。
〔 〕丘元盛等 水稻根际固氮细菌的研究
。 科学通报 , , 。。 。
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〔 〕 , 。。 。
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, 士 。 。。 , ,
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〔 〕 , 二 一
, 一 。。 一
〔 〕黄翠芬主编 遗传工程理论与方法
。 科学出版社 , 生
〔 〕 , 。 匕 。 、。 , 一 一 口 ,
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通 助 比 陇 入七 亡仁 万亡几止住
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〔‘“ 〕宋米等 么和 屯培养下粪产碱 菌固氮酶泪铁蛋 白的 合成及其特性
。 植物生理学报 , , , , 。 。 、盯一 , 了
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