全 文 ：植物叶绿体富含色素，是重要的光合作用细胞
器，其 DNA 以半保留方式进行自我复制，与核基因
组相比，叶绿体基因组为单亲遗传，保守程度高，因
此叶绿体 DNA 的简单重复序列(SSR)分子标记已
成为群体遗传结构、亲缘关系评价、细胞质遗传特
性、叶绿体单倍型划分等的强有力工具。自 Powell
等[1]首次开发了大豆(Glycine max)、水稻(Oryza sativa)
等 6 种植物的叶绿体 SSR 以来，叶绿体 SSR 分子
收稿日期： 2013–08–19　　　　接受日期： 2013–12–11
基金项目： 国际竹藤中心基本科研业务费项目(1632013009)，“十二五”农村领域国家科技支撑计划项目(2012BAD23B05)资助
作者简介： 杨丽，女，博士研究生，研究方向为竹藤的品种改良。E-mail: yangli0817@yeah.net
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: gaozhimin@icbr.ac.cn
热带亚热带植物学报　2014， 22(3)： 263 ~ 269
Journal of Tropical and Subtropical Botany
竹子叶绿体基因组SSR分子标记的开发及其应用
杨丽1, 赵韩生1, 彭镇华2, 董丽莉1, 高志民1*
(1. 国际竹藤中心， 竹藤科学与技术重点开放实验室， 北京 100102； 2. 中国林业科学研究院林业研究所， 北京 100091)
摘要： 为探讨观赏竹叶片异质性的机理，根据麻竹(Dendrocalamus latiflorus)和绿竹(Bambusa oldhamii)叶绿体基因组序列开发
SSR 分子标记。结果表明，在麻竹和绿竹叶绿体基因组中分别存在 87 和 86 个 SSR 位点，其中三核苷酸重复类型最多，其次为
单核苷酸重复类型。根据 SSR 位点设计 21 对引物，其中 11 对引物对 6 竹种能够扩增出稳定、清晰的条带，且具有多态性，引
物有效率达到 52.4%。聚类分析表明，6 竹种可分为两大类群，与形态学分类结果基本一致。有 4 对引物在菲白竹(Pleioblastus
fortunei)和白纹椎谷笹(Sasaella glabra f. albo-striata)的花叶中具有多态性，可作为区分观赏竹叶片异质性的分子标记。
关键词： 竹子； 叶绿体 SSR； 异质性
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2014.03.008
Development and Application of SSR Molecular Markers from the
Chloroplast Genome of Bamboo
YANG Li1, ZHAO Han-sheng1, PENG Zhen-hua2, DONG Li-li1, GAO Zhi-min1*
(1. International Center for Bamboo and Rattan, Key Laboratory on the Science and Technology of Bamboo and Rattan, Beijing 100102, China; 2.
Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China)
Abstract: In order to reveal the heterogeneity mechanism of ornamental bamboo leaves, the SSR molecular
markers were developed from chloroplast genome of Dendrocalamus latiflorus and Bambusa oldhamii. The results
showed that there were 87 and 86 SSR loci in chloroplast genome of D. latiflorus and B. oldhamii, respectively,
in which the trinucleotide type was the most, followed by mononucleotide type. Based on the sequences of SSR
loci in chloroplast genome, 21 pairs of SSR primers were designed. Six bamboo species could be amplified stable
and clear bands with polymorphism by 11 pairs of primers, accounting for 52.4%. The cluster analysis indicated
that 6 bamboo species could be divided into two groups, which was consisted with morphological classification.
Meanwhile, polymorphism bands could be amplified in different parts of colorful leaves from Pleioblastus fortunei
and Sasaella glabra f. albo-striata by 4 pairs of primers. So, it was suggested that these SSR markers could be
used to distinguish the leaf heterogeneity of ornamental bamboo.
Key words: Bamboo; Chloroplast SSR; Heterogeneity
264 第22卷热带亚热带植物学报
标记在农作物的研究中得到了广泛应用，如应用叶
绿体 SSR 分子标记证明了单倍体型栽培大豆是独
立起源的[2]；红花菜豆(Phaseolus coccineus)的细胞
质遗传具有多样性[3]等等。同时，叶绿体 SSR 分子
标记也逐渐在林业资源研究中得到应用，如利用叶
绿体 SSR 分子标记对日本落叶松(Larix kaempferi)
的研究表明，其遗传变异主要来自于群体内个体
间，群体间的变异较小[4]；对香蕉(Musa paradisiaca)
种群的分析表明，野生蕉材料表现出明显的差异[5]。
竹子属于禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae)
植物，有 1250 余种，是森林资源中重要的类群，具
有极高的生态、经济价值，尤其是在生态文明建设
中，观赏竹种在园林绿化中的作用日趋受到重视。
目前，分子标记已在竹类植物的遗传多样性、种质
资源收集与保护、良种选育等方面得到广泛应用，
包 括 SSR[6–7]、RFLP[8–9]、AFLP[10–12]、RAPD[13–14]、
ISSR[15–17]等，其中 SSR 分子标记是基于 EST、核基
因组等开发的。目前，有关竹子叶绿体基因组的
SSR 分子标记的开发和应用研究尚未见报道。因
此，本研究根据已有的麻竹和绿竹叶绿体基因组序
列[18]，开发 SSR 分子标记，以探讨竹叶绿体基因组
SSR 分子标记的可行性，为获得区分观赏竹花叶条
纹的分子标记和揭示花叶的异质性奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
所选用的 6 竹种均为实验室盆栽培养，包括
刚竹属的毛竹(Phyllostachys edulis)、牡竹属的麻竹
(Dendrocalamus latiflorus)、簕竹属的绿竹(Bambusa
oldhamii)、苦 竹 属 的 菲 白 竹(Pleioblastus fortunei)
和铺地竹(P. argenteastriatus)、以及东芭竹属的白
纹椎谷笹(Sasaella glabra f. albo-striata)。其中，毛
竹、麻竹和绿竹的叶片绿色，均为笋材两用竹种；菲
白竹的叶片具白色或淡黄色条纹；铺地竹的叶片翠
绿，新叶具白色条纹；白纹椎谷笹的叶片彩色，新
叶黄白色具绿条纹。菲白竹、铺地竹和白纹椎谷
笹均为观赏竹种。培养温度为 25℃，光照强度为
200 μmol m–2s–1，光周期为光 / 暗 = 16 h /8 h。
1.2 麻竹和绿竹叶绿体SSR的开发及引物设计
从 GenBank 公共数据库中下载麻竹和绿竹的
叶绿体基因组序列，利用 SSR Hunter 软件搜索序
列中的 SSR 位点，参数设置：核苷酸重复数位为 2、
3、 4，对应重复次数为 5、 3、 3；利用 TRF 在线软件
搜索单核苷酸重复序列，设置重复次数≥10。应用
软件 Vector NTI 9.0 设计引物，预扩增片段在 200 ~
300 bp 之间，引物由华大基因公司合成(表 1)。
1.3 DNA提取及检测
采用改良的 CTAB 方法[19]提取 6 竹种叶片的
基因组 DNA，同时对菲白竹、铺地竹和白纹椎谷笹
花叶叶片的绿色部分和白色部分分别提取 DNA，
在紫外分光光度计下测量 A260 和 A280，检测 DNA
的质量。提取的 DNA 于 –20℃保存。
1.4 PCR扩增及数据统计
PCR 扩增体系共 20 µL：包含 10 × LA Buffer
(MgCl2) 2.0 µL，dNTPs (2.5 mmol L
–1) 3.2 µL，正、
反 向 SSR 引 物(10 mmol L–1)各 1.0 µL，模 板 DNA
(100 ng µL–1) 2.0 µL，LA Taq DNA 聚合酶 1.0 U，超
纯水 9.8 µL。扩增反应程序为：95℃预变性 5 min；
然后 95℃ 30 s，52℃ ~ 58℃ 30 s，72℃ 30 s，共
28 个循环；最后 72℃延伸 7 min。经预实验，确定
退火温度后，用每对引物分别对 12 个样品进行扩
增，扩增产物采用 8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，
电压为 200 V，60 min 后银染显色。拍照采集电泳
图像，统计扩增条带，有共迁移条带记为 1，无带记
为 0，形成[0, 1]的原始数据矩阵，用 DPS 软件中的
UPGMA 法进行数据系统聚类获得遗传距离矩阵，
利用 MEGA4 软件进行系统进化树分析[20]。
2 结果和分析
2.1 麻竹和绿竹叶绿体基因组SSR分析
在麻竹 139350 bp 的叶绿体基因组序列中搜索
到 87 个 SSR 位点，平均每 1602 bp 出现 1 个 SSR
位点；在绿竹 139365 bp 叶绿体基因组序列中搜索
到 86 个 SSR 位点，平均每 1621 bp 出现 1 个 SSR
位点。在麻竹的 87 个 SSR 位点中，有单核苷酸重
复 28 条，二核苷酸重复 5 条，三核苷酸重复 36 条，
四核苷酸重复 18 条，出现的频率分别为 32.2%、
5.7%、41.4%、20.7%；在绿竹的 86 个 SSR 位点
中，有单核苷酸重复 29 条，二核苷酸重复 4 条，三
核苷酸重复 38 条，四核苷酸重复 15 条，出现的频
率分别为 33.7%、4.7%、44.2%、17.4% (表 2)。可见，
第3期 265
表 1 麻竹和绿竹叶绿体 SSR 的引物
Table 1 Chloroplast SSR primers of Dendrocalamus latiflorus and Bambusa oldhamii
位点 Locus 重复基序 Repeat motif 引物 Primer (5′ ~ 3′) 退火温度 Annealing temperature (℃ )
Dl-190 (T)15 F: AAAGCAATTGATCATGATCA
R: GGATCATTTAAGTCAGGTTTC
52
Dl-191 (T)11 F: CCTTTGGGGGATGGATCCTA
R: CGGGAAAGAAGTACCACTCG
57
Dl-210 (TCT)4 F: CAGTTTCTTCGTAGTAACGC
R: TCTCGTCGTTAACTGAATTC
52
Dl-211 (TTC)3 F: TTGTGAATCCACCATGCGCG
R: TGGCTAGGTAAACGCCCCGT
59
Dl-221 (T)11 F: ATAGTTCATGGCCTATTAGAAGTAG
R: CCCTGCAATCAAATAGATTG
54
Dl-287 (A)12 F: AAGTTGTTGATATTCAACAACT
R: AATATTCAAATACCCCAAAG
49
Dl-325 (A)13 F: ACCCTGCAATCAAATAGATTG
R: TAGTTCATGGCCTATTAGAAG
52
Dl-326 (A)13 F: CAAAACATTTCTAACGGATTCC
R: AACTTGGAACGAGCATGAAG
52
Dl-42 (GAGG)3 F: CGAACTAGGGTTCAATGAAT
R: TCGAATAGGAAGTTAAGATG
52
Dl-74 (TTTA)3 F: TTCTTCTGATTCTGACGTAAC
R: ACGGAATTTATTTCTTTTTG
52
Bo-204 (TTCT)3 F: CTTGTTTCAAGTTACGATTTCG
R: ATCATATAGTTGTAGCAACTGC
52
Bo-253 (T)11 F: ATCTTCATTGTTCAACTCTTTGAT
R: TATCATTCTGGCATCGAGCTAT
54
Bo-284 (TTA)3 F: ATGAAACTTTGACCAATGTACC
R: AAGATGGACTTTACCCAGGATG
54
Bo-294 (A)17 F: GCTACAGGCCCACCCCGTCTC
R: GGGGAGGTCCTGCGGCAAAAT
65
Bo-295 (A)10 F: TATCATTCTGGCATCGAGCTAT
R: TTCATTGTTCAACTCTTTGATG
54
Bo-33 (AT)5 F: CCCTTTGGCCTTTTCTCTTATAT
R: TCACTTGCACAAAGTAGAGGTTT
54
Bo-34 (T)113 F: ATTGAATCATATTTGTTTCCCTCC
R: TTATTCATGGCAAGGTTCAAAAT
54
Bo-56 (T)10 F: GCCTCAGATAGCGAGCGAATC
R: GTTCCATCTTGCAAATAGGGC
59
Bo-8 (TTC)3 F: TTCCTTACTAACAAAGGATTTATTG
R: ACGAATCCACTTTTCTAGGAAG
54
Bo-210 (TTC)4 F: ACAGTTTCTTCGTAGTAACGC
R: ATCTCGTCGTTAACTGAATTC
54
Bo-211 (TTTG)3 F: TTGTGCTTTGAAAACCCGTTC
R: TATGGTAGGTCGCAAATTGGG
56
杨丽等：竹子叶绿体基因组SSR分子标记的开发及其应用
266 第22卷热带亚热带植物学报
麻竹和绿竹叶绿体基因组中 SSR 的核苷酸重复数
量及出现频率基本一致，单核苷酸重复以基序 A 和
T 出现的次数最多，没有 G 或 C 的单核苷酸重复；
二核苷酸重复基序以 AT/TA 出现的次数最多，分
别占二核苷酸重复总数的 80.0% 和 75.0%；三核苷
酸重复基序中出现最多的是 AAG/TTC，分别占三
核苷酸重复总数的 25.0% 和 31.6%，其次为 AAC/
TTG、AGA/TCT；四核甘酸重复基序中出现较多
的是 AATA，分别占四核甘酸重复总数的 22.3% 和
26.7%。
2.2 麻竹和绿竹叶绿体SSR的多态性分析
根据麻竹和绿竹叶绿体基因组序列信息，针
对不同的 SSR 类型设计了 21 对引物，以 6 竹种的
DNA 样品为模板进行 PCR 扩增，扩增产物的电泳
分析结果表明，有 19 对引物能扩增出清晰的条带，
其中 11 对引物的条带具有多态性(图略)，多态性引
物占 SSR 引物总数的 52.4%。
2.3 基于叶绿体SSR分子标记的聚类分析
采 用 11 对 叶 绿 体 SSR 引 物 对 6 竹 种 进 行
表 2 麻竹和绿竹叶绿体 SSR 类型及频率
Table 2 Type and frequency of chloroplast SSR in Dendrocalamus latiflorus and Bambusa oldhamii
麻竹 Dendrocalamus latiflorus 绿竹 Bambusa oldhami
类型 Type 重复单元 Repeat motif 数目 Number % 类型 Type 重复单元 Repeat motif 数目 Number %
单核苷酸
Mononucleotide
(32.2%)
A 13 46.4 单核苷酸
Mononucleotide
(33.7%)
A 14 48.3
T 15 53.6 T 15 51.7
二核苷酸
Dinucleotide
(5.7%)
AG/TC 1 20.0 二核苷酸
Dinucleotide
(4.7%)
AG/TC 1 25.0
AT/TA 4 80.0 AT/TA 3 75.0
三核苷酸
Trinucleotide
(41.4%)
AAG/TTC 9 25.0 三核苷酸
Trinucleotide
(44.2%)
AAG/TTC 12 31.6
AGA/TCT 6 16.7 AGA/TCT 5 13.2
AAC/TTG 9 25.0 AAC/TTG 8 21.1
AAT/TTA 2 5.5 AAT/TTA 3 7.9
ATA/TAT 3 8.3 ATA/TAT 3 7.9
ACG/TGC 3 8.3 ACG/TGC 3 7.9
AGT/TCA 1 2.8 AGT/TCA 1 2.6
AGG/TCC 1 2.8 AGG/TCC 1 2.6
CGG/GCC 1 2.8 AGC/TCG 1 2.6
CTA/GAT 1 2.8 CAG/GTC 1 2.6
AGC/TCG 1 2.8
CAG/GTC 1 2.8
四核甘酸
Tetranucleotide
(20.7%)
ATAC 1 5.5 四核甘酸
Tetranucleotide
(17.4%)
ATAC 1 6.7
AAAG 1 5.5 AAAG 2 13.3
TCCT 1 5.5 TCCT 1 6.7
AATA 4 22.3 AATA 4 26.7
GTAG 1 5.5 GTAG 1 6.7
TCGT 1 5.5 TCGT 1 6.7
TTTA 4 22.3 AGAA 2 13.3
AAAC 1 5.5 TTTA 1 6.7
AACG 1 5.5 AAAC 1 6.7
GAGG 1 5.5 AACG 1 6.7
GAAA 1 5.5
AGAA 1 5.5
第3期 267
PCR 扩增，将扩增产物的电泳结果数字化，并计算
竹种间的遗传相似性系数，并进行聚类分析。结果
表明，供试 6 竹种分别聚为两个大类，其中铺地竹
和菲白竹聚在一起，在竹子形态学分类上，这两竹
种均为苦竹属，白纹椎谷笹与铺地竹、菲白竹聚为
一个大的分支上，说明这 3 竹种的亲缘关系较近，
且都为温带竹种；麻竹和绿竹在一个小分支上，其
都为丛生竹，与散生竹——毛竹的亲缘关系相对较
远(图 1)。整体而言，对 6 竹种的聚类结果与竹子
的形态学分类基本一致，说明从麻竹和绿竹叶绿体
序列中挖掘出的 SSR 引物具有较好的通用性，可
用作竹子种间的 SSR 分子标记分析。
图 1 6 种竹类植物基于叶绿体 SSR 标记的聚类图
Fig.1 6 Cluster analysis of 6 bamboo species based on SSR markers from chloroplast
图 2 4 对引物对 3 竹种的扩增结果。M：2 kb DNA marker; 1：菲白竹； 2：菲白竹绿色部分；3：菲白竹白色部分； 4：铺地竹； 5：铺地竹绿色部分； 6：
铺地竹白色部分； 7：白纹椎谷笹； 8：白纹椎谷笹绿色部分； 9：白纹椎谷笹白色部分。
Fig. 2 PCR results of 3 bamboo species by 4 pairs of primers. M: 2 kb DNA marker; 1: Pleioblastus fortunei; 2: Green part of P. fortunei; 3: White part
of P. fortunei; 4: P. argenteastriatus; 5: Green part of P. argenteastriatus; 6: White part of P. argenteastriatus; 7: Sasaella glabra f. albo-striata; 8:
Green part of S. glabra f. albo-striata; 9: White part of S. glabra f. albo-striata.
2.4 基于叶绿体SSR分子标记的观赏竹叶片的异质
　性分析
电泳分析结果表明，具有多态性的 11 对引物
中，有 4 对引物在菲白竹和白纹椎谷笹叶片的不同
条纹中具有多态性，而在铺地竹中没有特异扩增
条带。引物对 Bo-211 在白纹椎谷笹的绿色叶片样
品中无扩增条带，而在其叶片的 DNA 混合样品及
在白色条纹样品中均有大小一致的条带；引物对
Bo-56 在菲白竹的绿色叶片样品中无扩增条带，在
其叶片的 DNA 混合样品及在白色条纹样品中条带
大小一致；引物对 Dl-74 和 Bo-284 在菲白竹白色
条纹样品中无扩增条带，在菲白竹叶片 DNA 混合
样品及在绿色叶片部分中有大小一致的条带。说
明这 4 个 SSR 位点可作为区分菲白竹和白纹椎
谷笹叶片条状斑纹及叶片绿色部分的分子标记
(图 2)。
杨丽等：竹子叶绿体基因组SSR分子标记的开发及其应用
268 第22卷热带亚热带植物学报
3 讨论
随着高通量测序技术的快速发展，有效促进
了对叶绿体基因组的研究。到目前为止，已有接
近 200 种植物的叶绿体全基因组在 NCBI 上发布，
其中已对 8 种竹类植物的叶绿体基因组进行了测
序[18,21]。本研究通过对麻竹和绿竹叶绿体基因组
序列进行分析，分别挖掘出 87 和 86 个 SSR 位点，
具有存在大量的 A 或 T 单核苷酸重复，并且二核
苷酸重复较少的特点，这与前期开发的大豆、水稻、
黑松(Pinus thunbergii)等叶绿体 SSR 标记的结果一
致[1,22]。但是麻竹和绿竹的叶绿体 SSR 中不存在 G
或 C 单核苷酸重复的微卫星标记，且三核苷酸的重
复类型较多，这与拟南芥(Arabidopsis thaliana)[23]、
大豆[2]等叶绿体 SSR 重复类型不一致，这可能是物
种原因造成的。
叶绿体基因组的保守性强，含有特征性重复顺
序，它的遗传形式多样，且以母系遗传为主。对主
要以无性繁殖为主的竹类植物来说，叶绿体 SSR 分
子标记在竹类植物研究中具有重要价值。已有用
叶绿体基因 ndhF[24]、rps4[25]以及 rpl16 的内含子[26]
进行竹类植物系统进化研究的报道。本研究首次
利用叶绿体基因组 SSR 分子标记分析了其在不同
竹种间的通用性，并获得较好的多态性。因此，本
研究开发的叶绿体基因组 SSR 分子标记对于研究
竹类植物的系统分类有重要参考意义。毛竹属于
温带竹种，本研究中却与热带竹种麻竹和绿竹聚在
一起，没有与温带竹种菲白竹、铺地竹和白纹椎谷
笹聚在一起。究其原因，本研究的聚类分析结果是
基于 11 对叶绿体 SSR 标记对 6 竹种之间的遗传相
似性数据得到的，并非严格的系统发育方法，可能
是研究中 SSR 数据较少，有一定的偏向性，因此还
需要做进一步的分析核实。
花叶条纹是观赏竹的重要观赏性状，应用石
蜡切片及超薄切片对观赏竹花叶结构进行观察，在
菲白竹、白纹阴阳竹(Hibanobambusa tranquillans f.
shiroshima)和白纹椎谷笹 3 种竹子的条状斑纹内
的叶绿体结构均发生了变异，这意味着叶绿体结构
变异可能是花叶形成的重要因素[27–28]。为从分子
水平来探讨观赏竹花叶的异质性，本研究借助从麻
竹和绿竹叶绿体基因组中开发的 11 对 SSR 分子标
记，对铺地竹叶片不同条纹样品进行扩增，均未获
得特异性条带，这意味着铺地竹花叶条纹性状与现
有的 SSR 分子标记并不关联，其形成是由于叶绿
体结构变异还是功能基因突变引起的，还有待于进
一步研究；而对于菲白竹和白纹椎谷笹不同条纹的
样品，4 对叶绿体 SSR 引物有特异扩增，且具有多
态性，能够有效地区分不同颜色条纹的异质性，这
为有效开展观赏竹的分子标记辅助育种和新品种
的 DUS 测试奠定了基础。
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