全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 9 期，2009 年 9 月 869
收稿 2009-07-01 修定 　2009-08-03
资助 国家 “ 十一五 ” 科技支撑计划(2006BAI06A12-04)。
* 通讯作者(E-mai l: zzwa ng@snnu .edu.cn; Tel : 02 9-
8 5 3 1 0 2 6 0 )。
丹参中硫堇基因 SmTHI的克隆和表达分析
曹晓燕, 王 之 *
陕西师范大学药用资源与天然药物化学教育部重点实验室, 西北濒危药材资源开发国家工程实验室, 西安 710062
提要: 丹参 EST序列的 Blast分析表明, 一条序列与硫堇(thionin, THI)基因有较高的同源性, 该序列长 575 bp, 包含 1个长
366 bp的开放阅读框(ORF), 编码 121个氨基酸, 命名为 SmTHI, GenBank登陆号为DQ212984。在此基础上设计引物, 分别
从 cDNA和gDNA水平上克隆到该基因的全编码区序列的结果表明, 该基因无内含子。序列分析表明, 该编码蛋白与大多
数植物的 THI蛋白前体高度同源, 并符合植物硫堇类蛋白的序列模式和特征: C-C-X(5)-R-X(2)-[FY]-X(2)-C, N端具 17个
氨基酸的信号肽, 中间 46个氨基酸为成熟THI部分, C端的58个氨基酸为酸性多肽部分。成熟的THI蛋白带正电荷, 偏碱
性, 推测可能有抗病原微生物活性。实时定量 PCR检测 SmTHI在丹参不同组织部位的表达以及在黄瓜细菌性角斑病菌
(PSL)、NaCl和水杨酸(SA)溶液诱导下的表达结果表明: SmTHI在植物的根、茎和叶中均有不同程度的表达, 其表达丰度
为叶>茎>根; 在 PSL、NaCl和 SA溶液诱导下该基因的表达呈上调趋势。
关键词: 丹参; 硫堇; 克隆; 实时定量PCR
Cloning and Expression of SmTHI from Salvia miltiorrhiza Bge.
CAO Xiao-Yan, WANG Zhe-Zhi*
National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China, Key Laboratory
of the Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry, Shaanxi Normal University, Xi’an
710062, China
Abstract: By blasting EST sequences of Salvia miltiorrhiza, one sequence named as SmTHI, was found to
have high homology with thionin. The sequence of SmTHI was 575 bp, and contained a 366-bp open reading
fram (ORF) encoding a 121-amino acid peptide (GenBank accession number: DQ212984). The full-length
sequences were cloned from cDNA and gDNA on the base of the sequence, respectly, and no introns existed in
the encoding region. The deduced amino acid sequence of SmTHI protein shared high identity with THI precur-
sor in most plants. The protein precursor of SmTHI possessed a conserved signature sequence of “C-C-X(5)-
R-X(2)-[FY]-X(2)-C” and could be divided into three distinct domains, including an amino-terminal (N-terminal)
signal peptide, a mature THI, and a carboxy-terminal (C-terminal) acidic domain, composed of 17, 46 and 58
amino acid, respectively. The mature THI had positive charge and showed slightly high basic, which was
presumed involving in antimicrobial activity. Real-time quantitative PCR showed that expression of SmTHI is the
highest in leaf, followed by in stem, and lowest in root. The expression of SmTHI was obviously increased
under the induction of Pseudomonas lachrymans, sodium chloride (NaCl) and salicylic acid (SA).
Key words: Salvia miltorrhiza Bge.; thionin; cloning; real-time quantitative PCR
硫堇是一类小分子量多肽, 具有热稳定性高、
带正电荷和巯基含量高等特性(Lee等2000; Bohlmann
和Apel 1991), 在植物防御系统中起作用(Bohlmann
等1988), 是植物抗病基因工程研究中的理想材料。
迄今, 已从拟南芥、烟草、大麦、小麦、辣椒、
欧洲板栗、白菜和番茄等多种植物中克隆到植物
硫堇基因。Epple 等(1997)的研究表明, 内源硫堇
基因过量表达的拟南芥对病原真菌镰刀霉菌的抗性
增强; Iwai 等(2002)曾报道, 过量表达橡胶细胞壁
富集型硫堇的转基因水稻对细菌的抗性提高; 薛哲
勇等(2004)将大麦叶片中特异的 α- 硫堇基因 DB4
导入到普通小麦中后, 获得的转基因植株后代对小
麦白粉病的抗性明显提高。
丹参为唇形科(Labiatae)鼠尾草属多年生草本
植物, 是我国的传统中药材。随着中药丹参在治疗
心脑血管疾病、降低 “氧化疲劳 ”和抗病毒中的广
泛应用, 其需求量和种植面积越来越大。本文从丹
参中克隆出硫堇基因 SmTHI 并分析了其在丹参不
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同部位及在黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas
lachrymans, PSL)、水杨酸(SA)和盐(NaCl)胁迫下的
表达, 以期为进一步研究和应用这一基因提供参考。
材料与方法
丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)种子用 0.1% 的
HgCl2溶液灭菌处理10 min, 无菌水冲洗 4遍后, 接
种在加有MS固体培养基的三角瓶中, 放在人工气
候箱(宁波江南仪器厂, 型号为 RXZ-500D)中萌发,
温度为 25 ℃, 湿度为 48%, 光照强度为216 μmol·m-2·
s-1, 光照时间为 12 h·d-1, 长出 6 片真叶时取样用于
实验。
黄瓜细菌性角斑病原菌(Pseudomonas lachry-
mans Smith et Bryan)菌株购自北京农业科学院, 培
养于KB (金氏)培养基(20 g蛋白胨, 1.5 g K2HPO4,
1.5 g MgSO4, 20 g琼脂, 加水至 1 L, pH为 7.0~7.2),
于 28 ℃下培养活化, 菌落生长至指数生长期时用
于实验。
Biozol试剂购自BioFlux公司; Bio RT逆转录试
剂盒购自杭州博日科技有限公司; SYBR Premix Ex
Taq购自TaKaRa公司; PCR产物回收试剂盒购自北
京天为时代科技有限公司; 克隆载体pGEM-T Easy
vector 购自 Promega 公司; 大肠杆菌 DH5α 由我们
实验室保存。
丹参基因组 DNA 提取采用常规的 CTAB 法。
用Biozol试剂(BioFlux)提取丹参的总RNA; 以提取
的总RNA为模板, 按照反转录试剂盒(博日)说明书
进行合成 cDNA 第一链。
依据丹参EST序列(GenBank登录号CV167327,
长度为 575 bp)设计特异性引物, 5-ATGGGTGCT-
CTTTTGGTGA-3和5-GTATAGCCCTTCGATCA-
TCTTTA-3。以基因组DNA 和 cDNA为模板扩增
SmTHI 基因。PCR 扩增程序为: 94 ℃变性 3 min;
94 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 30个
循环; 72 ℃延伸 10 min。PCR 产物回收与 pGEM-
T Easy vector 连接。用 TSS 法转化 DH5α, 将细
菌涂布于含α-氨基苄青霉素 /IPTG/X-Gal的LB固
体培养基上, 在37 ℃下培养过夜, 于24 h内挑取白
色单菌落; 以菌落PCR检测为阳性的菌落送北京澳
科生物技术有限公司测序。
根据 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://
www.cbs.dtu.dk/ 和 http://cn.expasy.org/ 网站提供
的各类生物信息学软件进行在线分析。氨基酸序
列的组成成分分析、理化性质分析、开放阅读框
(open reading frame, ORF)的查找和翻译用 Prot
Param和ORF Finder在线工具进行; 氨基酸序列的
同源性比对用Blastx在线工具完成; 蛋白质信号肽
的预测用在线工具 SignalP 3.0 完成; 应用 Scan
Prosite 和 Motif Scan 程序进行结构域和基序分析;
ClustalW 软件进行多序列比对; Mega3.1 分析软件
进行系统聚类分析。
采用实时荧光定量PCR的方法, 检测SmTHI基
因在植物根、茎、叶不同部位和接种黄瓜细菌性
角斑病原后的表达情况。取处于指数生长期的
PSL菌落, 用10 mmol·L-1 MgCl2液悬浮制成菌悬浮
液, 测得波长 600 nm处光的吸收值为 0.231, 接种
于生长健壮的丹参叶片上, 并用接种环适当在叶表
面造成创伤, 丹参放入人工气候箱中继续培养, 分
别在接种后 24、48、72、96 h 取样, 样品置于
液氮中冷冻后放在-80 ℃冰箱中保存。NaCl和SA
处理: 将丹参幼苗分别浸泡于200 mmol·L-1 NaCl溶
液和 300 mmol·L-1 水杨酸(SA)溶液中, 于 0、1、
2、4 和 6 h 分别取样, 液氮速冻, -80℃储藏备用。
进行实时荧光定量PCR检测时, 以丹参持家基
因GAPDH (3-磷酸甘油醛脱氢酶)为内参(引物为5-
CCACCGTCCACTCCATCACT-3 和 5-TGGGAA-
CTCGGAACGACATAC-3), 检测SmTHI (引物为5-
AAGTGAAGTTGTGAATGGAGCAGC-3 和 5-
AATTATTGAAAGCCAGAAAAGCGAT-3)的表达
量。反应条件: 95 ℃变性 3 min; 95 ℃变性 10 s, 60
℃退火 20 s, 40 个循环。每个样品 3 个重复。
实验结果
1 丹参硫堇基因 SmTHI的克隆及序列特征分析
丹参 EST 序列的 Blast 分析表明, GenBank登
录号为CV167327的一条序列与硫堇(thionin, THI)
基因有较高的同源性, 该序列长 575 bp, 包含 1 个
长 366 bp的开放阅读框(ORF), 编码 121个氨基酸,
推测该基因可能是一种新的硫堇基因, 命名为
SmTHI, GenBank 登录号为 DQ212984。在此基础
上设计引物, 分别从 cDNA和gDNA水平上克隆到
该基因的全编码区序列, 从 cDNA和gDNA水平克
隆到的序列完全一致, 长 431 bp, 说明该基因无内
含子。
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Prot Param、SignalP 3.0 和 Scan Profile 程序
分析的结果显示, 硫堇蛋白前体的等电点(IEP)为5.4,
分子量(MW)为 12.4 kDa。N 端第 1~17 位氨基酸
区段疏水性很强, 第17位丙氨酸(A)和第18位精氨
酸(K)为信号肽切割位点, 这一段具典型信号肽特
征, 为信号肽部分。第 18~63位氨基酸区段为成熟
硫堇部分, 亲水性较强, 具 6个半胱氨酸, 占成熟硫
堇氨基酸数量的13%, 带正电荷, 呈碱性, IEP为8.92,
MW 为 4.9 kDa。靠近 C 端的第 64~121 位氨基酸
区段为酸性多肽部分。这些特征与大多数植物硫
堇前体一致, 推断SmTHI在丹参中是以此三部分构
成的前体形式存在的(图 1)。
图 1 SmTHI 的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig.1 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of SmTHI
斜体部分的 17 个氨基酸为信号肽; 底纹部分为 46 个氨基酸的成熟硫堇蛋白; 其他部分氨基酸为酸性多肽部分; 方框内为开放阅
读 框 。
Motif Scan程序分析显示, 成熟THI部分的第
4、5、17、26、32 和 40 位的 6 个半胱氨酸(C)
残基是植物硫堇极为保守的 3 个二硫键的形成位
点, 第 11 和 14位氨基酸分别为植物硫堇保守的精
氨酸(R)和芳香族氨基酸[这里为酪氨酸(Y)], 具有显
著的植物硫堇标签(plant thionins signature) C-C-
X(5)-R-X(2)-[FY]-X(2)-C 序列特征。C 端酸性多
肽部分第14~19位氨基酸区段为许多植物硫堇保守
的酰基化序列 GCASSV 位点(图 2)。
2 丹参硫堇基因SmTHI所编码的蛋白前体序列与
其他物种的硫堇蛋白前体序列的比较
用NCBI中的Blastx对丹参硫堇基因SmTHI编
码的蛋白前体序列与燕麦(Avena sativa)、大麦
(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)、水
稻(Oryza sativa)、白菜(Brassica rapa)、郁金香
(Tulipa gesneriana)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)
这7种植物中的硫堇蛋白前体序列进行同源性比较
的结果显示: 丹参与拟南芥( G enB a nk 登录号
NP_565038)、白菜(GenBank 登录号 AAF21800)、
水稻(GenBank登录号BAB93111)、大麦(GenBank
登录号 C AD 4 8 4 8 9 )、小麦( G e nB a n k 登录号
CAA65313)、燕麦(GenBank 登录号 BAB93112)、
郁金香(GenBank登录号CAA57350)的同源性分别
为 57%、56%、51%、44%、42%、39% 和 37%。
运用EBI网址中的ClustalW软件对这8种硫堇
蛋白前体进行多序列比对(图2), Mega3.1分析软件
对 8 种硫堇蛋白前体进行系统聚类分析(图 3)的结
果显示: 硫堇蛋白的部分序列较为保守, 丹参中的
硫堇与拟南芥、白菜中的硫堇同源性较高, 最先聚
在一起, 单子叶植物中的燕麦、小麦和大麦优先聚
在一起。　
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图 2 丹参与其他 7 种植物的硫堇蛋白前体序列比较
Fig.2 Comparison of amino acid sequence of thionin precursor of S. miltorrhiza with other seven plants
GenBank 登录号分别为 NP_ 565038 (拟南芥)、ABA871 07 (丹参)、AAF218 00 (白菜)、BAB93111 (水稻)、CAD4 8489
(大麦)、BAB93112 (燕麦)、CAA653 13 (小麦)和 CAA573 50 (郁金香)。
图 3 八种植物硫堇前体蛋白的系统进化树
Fig.3 Evolutionary tree of eight plant thionin precursor
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3 丹参硫堇基因 SmTHI表达水平的检测
SmTHI 在丹参植株根、茎、叶等不同部位的
表达分析的结果(图 4)表明, SmTHI 在植物的根、
茎、叶中均有不同程度的表达, 其中在叶中的表达
丰度最高, 分别为根和茎的 4.5 和 2.7 倍。丹参叶
片接种黄瓜角斑病病原菌后, SmTHI表达量上调, 在
检测时间段内, 接种 24 h 后的表达量达到最大, 为
不接种的 3.4倍(图 5)。在NaCl和 SA胁迫处理后,
SmTHI 表达量均发生了变化, 在 6 h 内该基因均呈
非线性增长趋势, 且都是在处理 1 h 后表达量最高
(图 6、7), 接着分别在 NaCl 和 SA 胁迫处理后的
6 h 和 4 h 出现表达量的再次升高。
图 4 SmTHI 在根、茎、叶中的表达量
Fig.4 Expression of SmTHI in the root, stem and leaf
图 5 黄瓜角斑病病原菌诱导 SmTHI 不同时间后的表达量
Fig.5 Expression of SmTHI after infected by P. lachrymans
图 6 NaCl胁迫下 SmTHI的表达
Fig.6 Expression of SmTHI under NaCl stress
NaCl 浓度为 200 mmol·L-1。
图 7 SA胁迫下 SmTHI的表达
Fig.7 Expression of SmTHI under SA stress
SA 浓度为 200 mmol·L-1。
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讨　　论
根据植物的种类、发生部位、总静电荷、氨
基酸的数量和成熟蛋白质中二硫键的位置, 硫堇至
少可以分为 4 类(Florack 和 Stiekema 1994)。I 型
硫堇主要在禾本科植物的胚乳中大量表达, 在45个
氨基酸中含有8个半胱氨酸, 形成4个二硫键; II型
硫堇主要是从大麦及寄生植物短柔毛檀梨的叶和坚
果中提取, 分别由 46 或 47 个氨基酸组成, 也形成
4个二硫键; III型硫堇来源于多种植物的茎和叶中,
种子中也可检测到硫堇, 由45或46个氨基酸组成,
可形成 3个或4个二硫键; IV型硫堇是从甘蓝的种
子中提取出来的, 由 46 个氨基酸组成, 含有 3个二
硫键。其中前 3 种均为碱性, 带正电荷, 具有抗菌
活性, 而第 4 种为中性, 不带电荷。经比较分析,
本文所克隆的SmTHI, 其所编码的成熟硫堇为III型
硫堇。
硫堇广泛存在于植物的种子、叶及根的表皮
细胞中, 可以抑制多种植物病原细菌以及20多种病
原真菌的生长(陈彤彤等2006), 越来越受到人们的关
注。本文从丹参中克隆到的硫堇基因受病原菌侵
害后可大量表达, 推测这一基因所编码的成熟硫堇
蛋白可能有抗菌活性。但是否有, 还待进一步研究。
参考文献
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