全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (3): 307~316　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0002 307
收稿 2015-01-04　　修定 2015-02-02
资助 转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08009-003-003)
和“十二五”农村领域国家科技计划(2012AA10A302-2)。
* 通讯作者(E-mail: zyshisippe@163.com; Tel: 021-54924078)。
OsRAMOSA2基因调控水稻的粒形
卢寰1,2, 黎凌3, 张景六1, 时振英1,*
1中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 植物分子遗传国家重点实验室, 上海200032; 2中国科学院大学, 北
京100039; 3上海交通大学生命科学技术学院, 200240
摘要: 高产优质是水稻研究的重要目标, 水稻产量由单株穗数、每穗粒数、结实率和千粒重等因素决定, 而粒长、粒宽和粒
厚是影响千粒重的三要素。本研究中, 我们克隆到一个影响水稻粒形的基因OsRAMOSA2, 通过遗传转化方法, 分别获得了
OsRAMOSA2基因表达下调(dsRNAiOsRA2)转基因植株和超表达(pUbi::OsRA2)转基因植株。dsRNAiOsRA2转基因种子长宽
比增加, 粒厚和千粒重降低; 而pUbi::OsRA2转基因种子长宽比减小, 粒厚及千粒重增加。利用原位杂交的方法揭示出OsRA-
MOSA2在未成熟种子的幼胚、胚乳、种皮、背部维管束、珠心表皮、珠心突起处、幼胚内的盾片、胚芽、胚根、胚芽鞘、
胚根鞘、外胚芽中均有表达。野生型‘ZH11’种子的胚乳细胞中, 淀粉粒呈现多面体, 形状均一、排列紧密; 而在dsRNAiOs-
RA2转基因种子中, 胚乳细胞的淀粉粒变为球状, 排列松散。淀粉合成途径中关键酶类编码基因OsSSIIa、OsGBSSI和OsSSIVb
在dsRNAiOsRA2转基因植株中的表达被上调, 而在pUbi::OsRA2转基因种子中的表达被下调; pUbi::OsRA2转基因种子中的表
观直链淀粉含量(apparent amylose content, AAC)相比‘ZH11’显著降低, 而dsRNAiOsRA2转基因种子的AAC显著增加。说明
OsRAMOSA2可能通过调控淀粉合成途径中关键基因的表达影响籽粒内直链淀粉的合成积累过程进而正调控粒重。
关键词: OsRAMOSA2基因; 粒形; dsRNAiOsRA2; pUbi::OsRA2
Regulation of OsRAMOSA2 Gene on Rice Grain Size
LU Huan1,2, LI Ling3, ZHANG Jing-Liu1, SHI Zhen-Ying1,*
1National Key Laboratory of Plant Molecular Genetics, Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes
of Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China; 2University of Chinese Academy of Sciences, Bei-
jing 100039, China; 3School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
Abstract: Rice research is aimed to improve the yield and the quality of the grain. The number of panicle per plant,
grains per panicle, the efficiency of seed setting and 1 000-grain weight contribute mostly to grain yield, while seed
length, seed width and seed thickness determine 1 000-grain weight. Here, we reported the cloning and functional
characterization of rice OsRAMOSA2 gene which could influence grain size. We constructed dsRNAiOsRA2 and
pUbi::OsRA2 plasmids, and genetically transformed them into wild type ‘ZH11’ (Oryza sativa L. subsp. japonica)
respectively. dsRNAiOsRA2 transgenic plants displayed increased length-to-width ratio in the seeds, reduced grain
thickness and 1 000-grain weight; while pUbi::OsRA2 transgenic plants showed reduced length-to-width ratio in
the seeds, increased grain thickness and 1 000-grain weight. In situ hybridization revealed that the OsRAMOSA2
transcript accumulated in embryo, endosperm, pericarp, dorsal vascular bundle, nucellar epidermis, nucellar projec-
tion, scutellum, shoot, coleoptile, radicle, coleorhizae and epiblast of immature seeds. In ‘ZH11’ endosperm, the
starch granules were uniformly sized and compact; in contrast, those of the dsRNAiOsRA2 transgenic plants were
round and loosely packed in the endosperm. Expression of several genes in starch biosynthesis including OsSSIIa,
OsSSIVb and OsGBSSI were up-regulated in dsRNAiOsRA2 transgenic plants while down-regulated in pUbi::Os-
RA2 transgenic plants. The apparent amylose content (AAC) of dsRNAiOsRA2 transgenic plants increased while
the AAC of pUbi::OsRA2 transgenic plants reduced. These results suggested that OsRAMOSA2 might be involved
in the biosynthesis of amylose through influencing the starch synthesis genes to promote grain weight.
Key words: OsRAMOSA2 gene; grain size; dsRNAiOsRA2; pUbi::OsRA2
水稻是世界上最重要的粮食作物之一, 全球
有一半以上的人口以大米为主食。我国是人口大
国, 水稻的年消耗量和产量占全球总量的三分之
一。水稻粒形和粒重是影响产量的直接因素, 粒
植物生理学报308
重又主要由粒形决定, 而控制粒形的3个关键因素
分别为粒长、粒宽和粒厚(徐建龙等2002; Xing和
Zhang 2010)。目前已有很多研究结果证明在水稻
基因组中存在上百个与粒形和粒重紧密相关的数
量性状遗传位点(QTL) (Li等2011; Zhang等2012),
但其实很多QTLs大多为同一个基因座 (Fan等
2006), 仍旧需要通过构建近等基因系来验证这些
已初步定位得到的QTLs。
LBD基因家族(Lateral Organ Boundaries Do-
main gene family)是一类植物特有的基因家族, 编
码的蛋白中含有LATERAL ORGAN BOUNDAR-
IES (LOB)结构域。LBD基因在植物的多种发育过
程中发挥功能, 影响植物叶、花序、根和小孢子
等方面的发育过程。LBD基因能够调控植物侧生
器官原基的启动; 侧生器官的近-远轴极性建立; 侧
生器官与顶端分生组织之间边界的建立(Iwakawa
等2002; Shuai等2002; Chalfun-Junior等2005; Liu等
2005)等等; 家族内部分基因还可以与顶端分生组
织、侧生器官与顶端分生组织的边界处特异表达
的其他基因如KNOX基因、CUP-SHAPED COTE-
LYDON (CUC)基因、PETAL LOSS (PTL)基因相互
作用(Byrne等2000; Semiarti等2001; Lin等2003; Xu
等2003, 2008); 另外, LBD基因还参与调控植物体
内的激素积累以及植物花青素和氮素的代谢途径
等(Scheible等2004; Rubin等2009; Albinsky等2010;
Bell等2012)。
虽然针对LBD家族基因的功能已经研究了很
多, 但相对而言, 水稻LBD基因的研究相对较少, 同
时LBD家族基因影响水稻粒形发育的研究未见报
道。本研究中, 我们克隆了水稻OsRAMOSA2基因,
该基因编码LBD蛋白, 属于LBD家族基因。研究
结果表明, OsRAMOSA2基因具有调节水稻粒形的
功能。
材料与方法
1 植物材料
本研究用到的植物材料包括粳稻栽培品种
‘中花11’ (Oryza sativa L. subsp. japonica cv. ‘ZH11’)
和dsRNAiOsRA2、pUbi::OsRA2转基因植株。本
研究中所用到的转基因的受体材料均为‘ZH11’。
所有的植物材料根据需要种植于本所人工气候
室、上海市农业科学院上海实验田和海南南繁基
地(三亚), 人工气候室的种植条件光照强度为2 700
μmol·m-2·s-1, 温度(28±1) ℃, 湿度(50±5)%~(70±5)%,
光照时间7:00~19:00。种植于上海市农业科学院
上海实验田和海南南繁基地(三亚)的材料, 遵从自
然条件进行种植, 采取常规管理。
2 方法
2.1 pUbi::OsRA2和dsRNAiOsRA2载体构建
为从水稻中克隆OsRAMOSA2基因, 我们根据
NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
中OsRAMOSA2基因全长序列, 设计正向和反向引
物 (表1) , 以野生型水稻 ‘ZH11’的基因组DNA
(gDNA)为模板, 采用高保真DNA聚合酶KOD-plus
(TOYOBO, Japan)进行扩增。再用BamHI和KpnI双
酶切, 将OsRAMOSA2全长片段克隆到p1301Ubi的
多克隆位点, 获得Ubi启动子驱动下的OsRAMO-
SA2超表达质粒pUbi::OsRA2。
用TRIzol (购自Invitrogen公司)抽提野生型水
稻‘ZH11’旗叶的总RNA, 经DNaseI消化去除gDNA
后, 反转录得到cDNA。根据OsRAMOSA2基因5′端
的特异序列设计引物(表1), 以上述cDNA为模板,
采用高保真DNA聚合酶KOD-plus (TOYOBO, Ja-
pan)进行扩增, 得到OsRAMOSA2基因特异片段
(5′UTR部分区段和1~156 bp)。通过KpnI和BamHI
酶切将其正向克隆到p1301RNAi载体上, 之后将这
一特异片段通过SacI和SpeI酶切再反向克隆到前
述载体上。该结构转化植物体之后, 能够在植物
体内形成hair-pin loop RNA, 获得35S启动子驱动
下的双链干扰RNA质粒dsRNAiOsRA2。
2.2 OsRAMOSA2原位杂交探针制备及检测
用OsRAMOSA2全长cDNA序列在NCBI数据
库进行BLASTN分析, 选取从CDS区到3′末端特异
性最强的636 bp片段用于探针制备并设计引物(表
1)。以TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚植物总
RNA提取试剂盒抽提水稻‘ZH11’开花后15 d未成
熟种子总RNA, 测定光密度值(A260/280值), 计算RNA
浓度, 取2 μg反转录。按ReverTra Ace (TOYOBO,
Japan)反转录试剂盒说明书进行反转录 , 得到
‘ZH11’开花后15 d未成熟种子cDNA。以上述
cDNA为模板, 采用高保真DNA聚合酶KOD-plus
(TOYOBO, Japan)进行扩增, 得到OsRAMOSA2基
卢寰等: OsRAMOSA2基因调控水稻的粒形 309
因cDNA序列中的特异片段。通过EcoRI和BamHI
双酶切连入pBSK(-), 获得pBSK-OsRA2质粒。
分别用BamHI和EcoRI酶切质粒, 将线性化的
质粒模板1 μg, 溶于RNase-free的双蒸水中, 补齐至
11 μL, 管中加入5 mmol·L-1 ATP、GTP、CTP以及
1 mmol·L-1 DIG-UTP各2.5 μL, 10×Transcription
buffer 2.5 μL, RNase inhibitor 0.5 μL和T3 RNA
polymerase或T7 RNA polymerase 1 μL。轻柔混匀
后, 37 ℃, 温育2 h, 加入75 μL 1×MS, 2 μL tRNA, 1
μL RNase-free的DNaseI, 37 ℃温育15 min, 消化
DNA模板。再加入100 μL 3.8 mol·L-1的NH4Ac和
600 μL无水乙醇, 混合后, –20 ℃沉淀过夜; 4 ℃
13 000 r·min-1离心10 min, 弃上清; 沉淀用冰预冷
的70%乙醇-0.15 mol·L-1 NaCl洗涤, 4 ℃ 13 000
r·min-1离心10 min, 弃上清。真空干燥后, 加入50
μL 2×碳酸缓冲液(pH 10.2), 60 ℃水解60 min后加
入10 μL 10%醋酸, 12 μL 3 mol·L-1 NaAC (pH 4.8)
和312 μL冰预冷的无水乙醇于–20 ℃沉淀2 h; 重复
4 ℃离心洗涤步骤, 沉淀经真空干燥后溶于50 μL
TE (pH 8.0)中, –70 ℃备用。
取DIG labeling RNA标准品做梯度稀释, 浓度
依次为: 1、5、10 ng·μL-1。取标记好的探针, Os-
RAMOSA2 (BamHI) (反义探针), OsRAMOSA2
(EcoRI) (正义探针)各1 μL点在带正电的尼龙膜
(Amersham)上, 自然吹干。
将膜放在小培养皿中, 用5 mL地高辛缓冲液1
浸湿, 再将地高辛缓冲液1倒出, 倒入5 mL地高辛
缓冲液2室温水平震荡30 min; 倒出液体用5 mL地
高辛缓冲液1冲洗; 倒出液体, 在5 mL地高辛缓冲
液1中加1 μL地高辛抗体(Anti-DIG-Ap, Roche)室
温下轻摇30 min; 倒出液体, 用5 mL地高辛缓冲液5
稍加冲洗; 倒出液体, 加入地高辛缓冲液6 (5 mL地
高辛缓冲液5加入7 μL NBT和5 μL BCIP)暗处显色
10 min以上, 当显色结束, 用地高辛缓冲液5或蒸馏
水冲洗膜的正反面终止显色反应。以DIG labeling
RNA标准品的显色强度为标准, 计算正义、反义
探针的浓度, –70 ℃保存备用。
2.3 半定量RT-PCR
用TRIzol法抽提转化植株与野生型‘ZH11’相
同生长时期旗叶的总RNA, 用试剂盒(TOYOBO,
Japan)消化提纯后, 取2 μg反转录。反转录按Rever-
Tra Ace (TOYOBO, Japan)反转录试剂盒说明书进
行。通过RT-PCR (引物见表1)分别检测转基因植株
中是否出现OsRAMOSA2的下调表达和超量表达。
2.4 定量PCR
用TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚植物总
RNA提取试剂盒抽提水稻开花后不同天数的未成
熟种子总RNA, 测定OD值, 计算RNA浓度, 取2 μg
反转录。反转录按ReverTra Ace (TOYOBO, Japan)反转
录试剂盒说明书进行。以水稻持家基因UBIqUITIN
(LOC_Os05g06770)为内参基因(何永明和曾晓春
2012), 反转录的cDNA为模板, 用目标基因和内参
基因特异引物(表1)进行qRT-PCR扩增, 分析野生
型‘ZH11’、dsRNAiOsRA2和pUbi::OsRA2转基因
植株开花后不同天数的种子中淀粉合成途径相关
基因的表达变化。
2.5 原位杂交
剥取水稻开花后不同天数的未成熟种子, 用
表1 本研究中用到的引物
Table 1 Primers used in this study
转基因质粒构建
引物序列
淀粉合成途径
引物序列
及定量PCR检测 相关基因
pUbi::OsRA2 5′-GGGATCCAAATGGCATCCTCGTCGAGCACC-3′ OsSSIIa 5′-GCTTCCGGTTTGTGTGTTCA-3′
5′-GGGTACCATCAAGGCCAAAGCGCAGAT-3′ 5′-CTTAATACTCCCTCAACTCCACCAT-3′
dsRNAiOsRA2 5′-GGGAGCTCGGATCCGAAATGGCATCCTCGTCGAGCACC-3′ OsGBSSI 5′-AACGTGGCTGCTCCTTGAA-3′
5′-GGGACTAGTGGTACCGCGGGAAGTAAGGAGCGAACACG-3′ 5′-TTGGCAATAAGCCACACACA-3′
pBSK-OsRA2 5′-GGGAATTCATGGCATCCTCGTCGAGCACC-3′ OsSSIVb 5′-ATGCAGGAAGCCGAGATGTT-3′
5′-GGGGATCCTCACATGCTGCTGTCTCCTCCTTCC-3′ 5′-ACGACAATGGGTGCCAAGAT-3′
OsRAMOSA2 5′-GTCCTACCTTACGCTTCC-3′ UBIqUITIN 5′-TGGTCAGTAATCAGCCAGTTTGG-3′
5′-TCTCTGATCCTGAGTTGG-3′ 5′-GCACCACAAATACTTGACGAACAG-3′
ACTIN 5′-CAGCCACACTGTCCCCATCTA-3′
5-AGCAAGGTCGAGACGAAGGA-3′
植物生理学报310
RNase free的多聚甲醛固定液进行固定, 真空抽气
至材料沉底, 更换一次新鲜固定液, 4 ℃静置过夜;
4 ℃乙醇逐级脱水; 依次更换至50%二甲苯-50%乙
醇1次、100%二甲苯3次以透明化植物组织, 将植
物材料置入50%二甲苯-50%石蜡(Sigma)中, 60 ℃
过夜; 最后更换为纯石蜡浸蜡; 60 ℃保温, 每12 h
更换一次石蜡, 共6次; 包埋, 4 ℃保存。切片、粘
片、杂交、显色、脱色、封片等按Coen等(1990)
的方法进行。
2.6 表观直链淀粉含量测定
根据双波长分光光度法测定野生型‘ZH11’、
dsRNAiOsRA2-2和pUbi::OsRA2-2转基因植株的成
熟种子内表观直链淀粉含量(郭华和周建平1988)。
2.7 水稻胚乳细胞淀粉粒形态的电镜观察
取野生型‘ZH11’、dsRNAiOsRA2-2和pU-
bi::OsRA2-2转基因植株的成熟种子经70% FAA固
定24 h。酒精梯度脱水后将种子横切, 经二氧化碳
临界点干燥, 固定于铜台上喷金, 用扫描电镜观察
拍照。
实验结果
1 OsRAMOSA2基因的克隆以及dsRNAiOsRA2和
pUbi::OsRA2转基因植株的获得
我们在研究水稻重要农艺性状的过程中, 克隆
了调控水稻粒形的OsRAMOSA2基因, 该基因具有
明显的影响粒形的表型(见下文)。KOME (http://
cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中的基因号为AK105527,
该基因在水稻基因组中没有同源基因。OsRAMO-
SA2基因编码LBD蛋白。我们构建了OsRAMOSA2
基因的双链干扰质粒, 并通过农杆菌介导的方法
转化野生型水稻‘ZH11’。从15株T0代表型明显的
表达下调转基因植株中随机选取3株, 对OsRAMO-
SA2基因的表达进行RT-PCR检测, 结果显示3株转
基因植株中OsRAMOSA2基因的表达被不同程度
地下调(图1-A), 最终获得5株OsRAMOSA2基因的
dsRNAiOsRA2表达下调转基因植株。
同样, 我们还从20株T0代表型明显的OsRA-
MOSA2基因的超表达转基因植株中随机选取3株,
进行RT-PCR检测, 发现3株转基因植株中OsRA-
MOSA2基因的表达均被显著上调(图1-B), 据此我
们获得了OsRAMOSA2基因的pUbi::OsRA2超表达
转基因植株。
2 OsRAMOSA2基因对水稻种子发育的影响
dsRNAiOsRA2和pUbi::OsRA2转基因成熟种
子的形态相比‘ZH11’发生了显著变化(图2-A)。我
们分别对dsRNAiOsRA2和pUbi::OsRA2转基因植
株T2代纯合种子的粒长、粒宽、粒厚、长宽比及
千粒重等指标进行了统计, 发现相比‘ZH11’, dsR-
NAiOsRA2转基因植株的种子变窄(图2-C), 长宽比
增加(图2-D), 同时, 粒厚和千粒重也显著降低(图
2-E、F), 而pUbi::OsRA2转基因植株的种子不仅粒
宽增加(图2-C), 长宽比减小(图2-D), 同时粒厚和千
粒重也显著增加(图2-E、F)。综合上述分析, Os-
RAMOSA2基因表达下调后造成粒厚和千粒重降
低, 相反, OsRAMOSA2基因超表达后会导致粒厚及
千粒重增加。
3 OsRAMOSA2基因在‘ZH11’各时期未成熟种子
中的时空表达模式
转基因植株的表型分析说明OsRAMOSA2基
因影响水稻种子的形态发育。鉴于基因功能和表
达具有统一性, 我们首先通过定量RT-PCR的方法
检测了OsRAMOSA2基因在开花后不同天数的未
成熟种子内的表达, 发现在水稻种子发育过程中,
OsRAMOSA2基因的表达呈现出先升后降的趋
势。OsRAMOSA2基因在开花后第10天的未成熟
种子中的表达量最高, 在此之前, OsRAMOSA2基因
图1 OsRAMOSA2基因在dsRNAiOsRA2和pUbi::OsRA2转
基因植株的检测
Fig.1 Analysis of OsRAMOSA2 expression in dsRNAiOsRA2
and pUbi::OsRA2 transgenic plants
A: 在dsRNAiOsRA2表达下调转基因植株中检测OsRAMOSA2
基因的表达, 其中1~3为随机的3株dsRNAiOsRA2转基因植株, 4为
‘ZH11’, 检测的组织为相同生长时期的水稻旗叶; B: 在pUbi::Os-
RA2超表达转基因植株中检测OsRAMOSA2基因的表达, 其中1~3
为随机的3株pUbi::OsRA2转基因植株, 4为‘ZH11’, 检测的组织为
相同生长时期的水稻旗叶。
卢寰等: OsRAMOSA2基因调控水稻的粒形 311
的表达呈现逐渐上升的趋势, 而在此之后, OsRA-
MOSA2基因的表达量又开始下降(图3)。
既然OsRAMOSA2基因能调控粒形的发育, 那
么它在未成熟种子中的表达模式是怎样的？我们利
用原位杂交技术检测了OsRAMOSA2基因在‘ZH11’未
成熟种子中的表达模式, OsRAMOSA2在开花后第
3天、第5天、第8天和第10天的未成熟种子的幼
胚、胚乳和种皮内均有表达(图4-A~D), 并在开花
后第7天的未成熟种子的背部维管束、珠心表
皮、珠心突起处有集中的表达(图4-E、F), 同时在
第8和10天的未成熟种子的幼胚内的盾片、胚
根、胚芽鞘、胚根鞘、外胚芽中也有表达 (图
4-C、D)。
OsRAMOSA2基因的转录本集中于未成熟种
子胚和胚乳中的表达特征, 暗示OsRAMOSA2基因
可能参与籽粒胚乳内淀粉的合成过程。
4 OsRAMOSA2基因影响胚乳细胞内淀粉粒形态
与分布
dsRNAiOsRA2转基因籽粒透明度降低, 且籽
粒有较多垩白(图5-A)。我们对pUbi::OsRA2-2、
图2 ‘ZH11’种子, dsRNAiOsRA2, pUbi::OsRA2转基因种子表型及种子相关性状统计
Fig.2 Seed morphology of ‘ZH11’, dsRNAiOsRA2 and pUbi::OsRA2 transgenic lines and comparison of some seed traits
among them
A: dsRNAiOsRA2和pUbi::OsRA2转基因种子表型, 标尺为5 mm; B~F: dsRNAiOsRA2和pUbi::OsRA2转基因种子的粒长、粒宽、籽粒
长宽比、粒厚、千粒重农艺性状统计。“*”和“**”号分别表示dsRNAiOsRA2和pUbi::OsRA2转基因种子的粒长、粒宽、籽粒长宽比、粒
厚、千粒重等数值相比‘ZH11’经t-test后P<0.05 (显著差异)和P<0.01 (极显著差异)。
植物生理学报312
dsRNAiOsRA2-2转基因种子以及野生型‘ZH11’种
子进行横切, 并对其中胚乳细胞的淀粉粒结构进
行了扫描电镜观察。发现在‘ZH11’胚乳细胞中, 淀
粉粒的形状均一且为多面体, 形状规则并且排列
紧密(图5-D)。而在dsRNAiOsRA2-2转基因植株的
种子的胚乳细胞中, 淀粉粒则变为球状, 并且排布
松散, 淀粉粒与淀粉粒之间的空隙增加(图5-C)。
pUbi::OsRA2-2转基因种子的淀粉粒没有肉眼可见
的明显变化(图5-B)。dsRNAiOsRA2转基因种子腹
部垩白增多与其种子胚乳细胞内淀粉粒形态变圆
的细胞学结果紧密相关。
5 OsRAMOSA2基因可能参与淀粉合成调控
由于dsRNAiOsRA2转基因种子变细长, 而
pUbi::OsRA2转基因种子变宽(图2-A、图5-A), 并
且dsRNAiOsRA2转基因种子有明显可见的淀粉粒
形态变化(图5-C)。我们推测OsRAMOSA2可能通
过调控种子内淀粉的合成和积累过程进而影响成
熟种子的形态。水稻中直链淀粉的含量主要由
OsGBSSI (Waxy)基因编码的淀粉颗粒合成酶I控制
(Hanashiro等2008), OsSSIIa主要负责调控水稻淀
粉品质的修饰改良、支链淀粉结构的分化、粳稻
和籼稻淀粉质量的差异化等过程(Nakamura等
2005), 淀粉合成途径内的其他关键酶类如OsSSI、
OsSSIIIa、OsISA1、OsPUL、OsBEI和OsBEIIb等
则在水稻淀粉结构和种子的理化成分方面发挥重
要调控功能(Nishi等2001; Fujita等2003, 2006, 2007,
2009; Satoh等2003)。因此我们分别以‘ZH11’、
dsRNAiOsRA2和pUbi::OsRA2转基因植株开花后
第7天的未成熟种子的胚乳为材料, 检测了一系列
淀粉合成途径内的关键酶的编码基因OsGBSSI、
OsSSIIa、OsAGPS2b、OsAGPL1、OsAGPL2、
图3 OsRAMOSA2基因在开花后不同天数的未成熟种子内
的表达
Fig.3 OsRAMOSA2 expression in seeds at different develop-
mental stages, indicated by days after fertilization
将OsRAMOSA2基因在开花后第一天的未成熟种子内的表达
量设为1, 其他的开花后不同天数的相对表达量用其与开花后第一
天的未成熟种子内的表达量的比值表示。生物学样本重复3次, 内
参基因为ACTIN基因。
图4 原位杂交显示OsRAMOSA2在水稻不同发育时期种子中的表达
Fig.4 Expression pattern of OsRAMOSA2 during rice seed development revealed by RNA in situ hybridization analysis
A~D: 受精后3 d (A)、5 d (B)、8 d (C)、10 d (D)的水稻种子纵切; E: 受精后7 d的水稻种子横切; F: E图中方框指示位置的放大; G: OsRA-
MOSA2正义探针的杂交片。A~G中的标尺为200 μm。EM: 胚; EN: 胚乳; P: 果皮; RA: 胚根; CR: 胚根鞘; EP: 外胚叶; SH: 幼芽; SC:
盾片; CO: 胚芽鞘; DV: 背部维管束; NP: 珠心突起处; NE: 珠心表皮。
卢寰等: OsRAMOSA2基因调控水稻的粒形 313
OsAGPL3、OsSSI、OsISA2、OsSSIIIA、OsS-
SIVb、OsBEI和OsPUL的表达, 结果表明OsSSIIa在
dsRNAiOsRA2转基因植株的未成熟种子中的表达
上调, 而OsGBSSI在pUbi::OsRA2转基因植株的未
成熟种子中的表达下调, OsSSIVb在pUbi::OsRA2
转基因植株的未成熟种子中的表达稍有下调, 但
差异不显著(图6-A~C), 而OsAGPS2b、OsAGPL1、
OsAGPL2、OsAGPL3、OsSSI、OsISA2、OsSSIIIA、
OsBEI和OsPUL等基因在pUbi::OsRA2和dsR-
NAiOsRA2转基因种子中表达变化的差异不明
显。而且, OsGBSSI在pUbi::OsRA2未成熟种子中
表达下调的程度非常大。OsGBSSI主要负责调控
水稻胚乳内直链淀粉的合成过程。因此, OsRA-
MOSA2可能通过负调控OsGBSSI基因的表达来影
响水稻胚乳内直链淀粉的累积过程。
利用双波长分光光度法分别测定了dsRNAiOs-
RA2-2和pUbi::OsRA2-2转基因种子中的表观直链
淀粉含量(AAC) (郭华和周建平1988), pUbi::Os-
RA2-2种子的AAC为13.299%, dsRNAiOsRA2-2种
子的AAC为17 .937%, 分别比 ‘ZH11’种子的
AAC15.286%显著下调和上调(图7), 说明OsRA-
MOSA2能够负调控种子内直链淀粉的含量。
讨　　论
1 OsRAMOSA2基因影响水稻籽粒形态
水稻是一种重要的粮食作物, 籽粒形态是影
响水稻产量和食味品质的关键因素, 因此针对籽
粒形态的研究具有重要意义。直链和支链淀粉含
量在总淀粉含量中所占的比例决定水稻的食味品
质, 而直链和支链淀粉含量的改变, 一般或多或少
会影响到水稻的粒形。目前, 通过构建近等基因
系的方法已经得到了一部分控制籽粒形态的关键
位点, 但这些位点多为数量性状位点, 精细定位克
隆所得的基因实际并不多。本文克隆的OsRAMO-
SA2基因已通过转基因实验证明能够调控水稻籽
粒形态的变化, 表达下调能造成粒长增加, 粒宽、
粒厚、千粒重减小; 而超表达能造成粒长缩短, 粒
宽、粒厚、千粒重增加。另外, OsRAMOSA2超表
达转基因植株呈现明显的密穗表型(研究结果已另
外投稿)。因此, OsRAMOSA2基因能够影响水稻的
粒形, 可能具有潜在的育种价值。
2 OsRAMOSA2基因影响水稻籽粒形态的可能机制
目前的研究结果证实很多途径都可以调控水
稻籽粒形态, 例如OsGS3通过编码一类跨膜蛋白负
向调控粒长, 其中OsGS3蛋白氨基端的organ size
图5 pUbi::OsRA2、dsRNAiOsRA2转基因种子和‘ZH11’种子外观及淀粉粒形态的扫描电镜观察
Fig.5 Seed morphology of pUbi::OsRA2, dsRNAiOsRA2 and ‘ZH11’ seeds and scanning electron microscope analysis of the
starch granules in the endosperm of them
A: pUbi::OsRA2、dsRNAiOsRA2转基因种子和‘ZH11’种子的外观, 从左到右依次为: pUbi::OsRA2、dsRNAiOsRA2转基因种子
和‘ZH11’种子, 箭头表示dsRNAiOsRA2转基因种子的腹部垩白, 标尺为2 cm; B~D: 依次为pUbi::OsRA2、dsRNAiOsRA2转基因种子和
‘ZH11’种子中淀粉粒形态的扫描电镜观察。标尺为10 μm。
植物生理学报314
图6 水稻胚乳淀粉合成酶编码基因OsSSIIa、OsGBSSI和
OsSSIVb在dsRNAiOsRA2和pUbi::OsRA2转基因种子中
的表达
Fig.6 Expression of starch synthesis enzyme encoding genes
OsSSIIa, OsGBSSI, OsSSIVb in rice immature seeds of
dsRNAiOsRA2 and pUbi::OsRA2 transgenic plants
‘ZH11’、dsRNAiOsRA2和pUbi::OsRA2转基因材料开花后第7
天的未成熟种子内的淀粉合成酶OsSSIIa (A)、OsGBSSI (B)和OsS-
SIVb (C)的表达变化。A: “**”表示OsSSIIa基因在dsRNAiOsRA2转基
因植株中的表达水平相比其在‘ZH11’中的表达水平经t-test后P<0.01
(极显著差异)。B: “**”表示OsGBSSI基因在pUbi::OsRA2转基因植株
中的表达水平相比其在‘ZH11’中的表达水平经t-test后P<0.01 (极显
著差异)。生物学样本重复3次, 内参基因为UBIqUITIN基因。
regulation结构域(OSR domain)可以拮抗nerve growth
factor receptor (NGFR) family cysteine-rich跨膜结
构域(NGFR domain)以及羧基端的von Willebrand
factor type C结构域(VWFC domain)的功能, 负向
调控水稻籽粒长, 将OSR结构域内的氨基酸位点突
变后, 突变体粒长增加(Mao等2010), 而OsGW2、
OsGW5、OsGS5和OsGW8则主要调控粒宽(Song
等2007; Weng等2008; Shomura等2008)。OsGW2编
码具有E3泛素连接酶活性的RING蛋白(Song等
2007), 通过抑制种皮细胞分裂负向调控粒宽。
OsGS5通过编码丝氨酸羧肽酶促进细胞分裂正向
调控粒宽(Li等2011)。OsGW8 (OsSPL16)通过促进
细胞增殖, 使种子粒形变大(Wang等2012)。在本
文的研究中, pUbi::OsRA2转基因种子变宽, 长宽
比显著下降, 而dsRNAiOsRA2转基因种子变细长,
长宽比显著增加。说明OsRAMOSA2基因影响水
稻的粒形。dsRNAiOsRA2 T2代纯合转基因种子出
现腹部垩白。在dsRNAiOsRA2转基因种子内胚乳
细胞中, 淀粉粒则变得大而圆, 并且淀粉粒在胚乳
细胞中的排布变得松散, 淀粉粒与淀粉粒之间的
空隙增加。说明OsRAMOSA2基因影响到水稻胚
乳细胞中的淀粉粒形态和分布。这些表型的改变,
可能源于其中基因表达的变化, 因此, 我们进行了
一些淀粉合成酶相关基因的表达检测, 发现OsSSI-
Ia、OsGBSSI和OsSSIVb这3个基因的表达在dsR-
NAiOsRA2转基因植株的未成熟种子中被上调, 而
在pUbi::OsRA2转基因植株中被下调。而且, 其中
OsGBSSI基因的表达变化程度最明显。OsGBSSI
图7 ‘ZH11’、pUbi::OsRA2和dsRNAiOsRA2转基因种子的
表观直链淀粉含量
Fig.7 Apparent amylose contents (AAC) of ‘ZH11’,
pUbi::OsRA2 and dsRNAiOsRA2 transgenic plants
“**”表示pUbi::OsRA2和dsRNAiOsRA2转基因植株成熟种子
的表观直链淀粉含量相比‘ZH11’经t-test后P<0.01 (极显著差异)。
卢寰等: OsRAMOSA2基因调控水稻的粒形 315
基因特异调控水稻种子内直链淀粉合成过程, 是
调控直链淀粉含量的主效基因(王震等2010)。那
么OsRAMOSA2基因可能通过负调控OsGBSSI基因
进而负调控胚乳细胞内直链淀粉的积累过程, 相
应地, pUbi::OsRA2和dsRNAiOsRA2转基因种子的
表观直链淀粉含量分别比野生型‘ZH11’种子的表
观直链淀粉含量明显下调和明显上调(图7)。因此,
本文的研究结果初步证明, OsRAMOSA2基因可能
通过负调控OsGBSSI基因影响水稻籽粒胚乳细胞
内直链淀粉的积累过程进而影响到籽粒形态。
参考文献
郭华, 周建平(1988). 多波长分光光度法测定稻米中的直链与支链
淀粉. 湖南农学院学报, 14 (3): 99~106
何永明, 曾晓春(2012). 开花期水稻颖花实时定量RT-PCR分析中内
参基因的选择. 江西农业大学学报, 34 (6): 1086~1092
王震, 魏祥进, 邵高能, 胡培松(2010). 稻米蒸煮品质及其淀粉合成
相关酶基因的研究进展. 中国稻米, 16 (5): 7~11
徐建龙, 薛庆中, 罗利军, 黎志康(2002). 水稻粒重及其相关性状的
遗传解析. 中国水稻科学, 16 (1): 6~10
Albinsky D, Kusano M, Hiquchi M, Hayashi N, Kobayashi M,
Fukushima A, Mori M, Ichikawa T, Matsui K, Kuroda H et al
(2010). Metabolomic screening applied to rice FOX Arabidopsis
lines leads to the identification of a gene-changing nitrogen me-
tabolism. Mol Plant, 3 (1): 125~142
Bell EM, Lin WC, Husbands AY, Yu L, Jaganatha V, Jablonska B,
Mangeon A, Neff MM, Girke T, Springer PS (2012). Arabidopsis
LATERAL ORGAN BOUNDARIES negatively regulates brass-
inosteriod accumulation to limit growth in organ boundaries.
Proc Natl Acad Sci USA, 109 (51): 21146~21151
Byrne ME, Barley R, Curtis M, Arroyo JM, Dunham M, Hudson
A, Martienssen RA (2000). Asymmetric leaves1 mediates leaf
patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature, 408:
967~971
Chalfun-Junior A, Franken J, Mes JJ, Marsch-Martinez N, Pereira A,
Angenent GC (2005). ASYMMETRIC LEAVES2-LIKE1 gene, a
member of the AS2/LOB family, controls proximal-distal pat-
terning in Arabidopsis petals. Plant Mol Biol, 57 (4): 559~575
Coen ES, Romero JM, Doyle S, Elliott R, Murphy G, Carpenter R
(1990). Floricaula: a homeotic gene required for flower develop-
ment in Antirrhinum majus. Cell, 63: 1311~1322
Fan C, Xing Y, Mao H, Lu T, Han B, Xu C, Li X, Zhang Q (2006).
GS3, a major QTL for grain length and weight and minor QTL
for grain width and thickness in rice, encodes a putative trans-
membrane protein. Theor Appl Genet, 112: 1164~1171
Fujita N, Kubo A, Suh DS, Wong KS, Jane JL, Ozawa K, Takaiwa F,
Inaba Y, Nakamura Y (2003). Antisense inhibition of isoamylase
alters the structure of amylopectin and the physicochemical
properties of starch in rice endosperm. Plant Cell Physiol, 44:
607~618
Fujita N, Yoshida M, Asakura N, Ohdan T, Miyao A, Hirochika H,
Nakamura Y (2006). Function and characterization of starch syn-
thase I using mutants in rice. Plant Physiol, 140: 1070~1084
Fujita N, Yoshida M, Kondo T, Saito K, Utsumi Y, Tokunaga T, Nishi
A, Satoh H, Park JH, Jane JL et al (2007). Characterization of
SSIIIa-deficient mutants of rice: the function of SSIIIa and pleio-
tropic effects by SSIIIa deficiency in the rice endosperm. Plant
Physiol, 144: 2009~2023
Fujita N, Toyosawa Y, Utsumi Y, Higuchi T, Hanashiro I, Ikegami
A, Akuzawa S, Yoshida M, Mori A, Inomata K et al (2009).
Characterization of pullulanase (PUL)-deficient mutants of rice
(Oryza sativa L.) and the function of PUL on starch biosynthesis
in the developing rice endosperm. J Exp Bot, 60 (3): 1009~1023
Hanashiro I, Itoh K, Kuratomi Y, Yamazaki M, Igarashi T, Matsu-
gasako J, Takeda Y (2008). Granule-bound starch synthase I is
responsible for biosynthesis of extra-long unit chains of amylo-
pectin in rice. Plant Cell Physiol, 49: 925~933
Iwakawa H, Ueno Y, Semiarti E, Onouchi H, Kojima S, Tsukaya H,
Hasebe M, Soma T, Ikezaki M, Machida C et al (2002). The
ASYMMETRIC LEAVES2 gene of Arabidopsis thaliana, required
for formation of a symmetric flat leaf lamina, encodes a member
of a noval family of proteins characterized by cysteine repeats
and a leucine zipper. Plant Cell Physiol, 43 (5): 467~478
Li Y, Fan C, Xing Y, Jiang Y, Luo L, Sun L, Shao D, Xu C, Li X, Xiao
J et al (2011). Natural variation in GS5 plays an important role
in regulating grain size and yield in rice. Nat Genet, 43 (12):
1266~1269
Lin WC, Shuai B, Springer PS (2003). The Arabidopsis LATERAL
ORGAN BOUNDARIES-domain gene ASYMMETRIC LEAVES2
functions in the repression of KNOX gene expression and in
adaxial-abaxial patterning. Plant Cell, 15 (10): 2241~2252
Liu HJ, Wang SF, Yu XB, Yu J, He XW, Zhang SL, Shou HX, Wu P
(2005). ARL1, a LOB-domain protein required for adventitious
root formation in rice. Plant J, 43 (1): 47~56
Mao H, Sun S, Yao J, Wang C, Yu S, Xu C, Li X, Zhang Q (2010).
Linking differential domain functions of the GS3 protein to nat-
ural variation of grain size in rice. Proc Natl Acad Sci USA, 107:
19579~19584
Nakamura Y, Francisco PB Jr, Hosaka Y, Sato A, Sawada T, Kubo
A, Fujita N (2005). Essential amino acids of starch synthase IIa
differentiate amylopectin structure and starch quality between ja-
ponica and indica rice varieties. Plant Mol Biol, 58 (2): 213~227
Nishi A, Nakamura Y, Tanaka N, Satoh H (2001). Biochemical and
genetic analysis of the effects of amylose-extender mutation in
rice endosperm. Plant Physiol, 127: 459~472
Rubin G, Tohge T, Matsuda F, Saito K, Scheible WR (2009). Mem-
bers of the LBD family of transcription factors repress anthocy-
anin synthesis and affect additional nitrogen responses in Arabi-
dopsis. Plant Cell, 21: 3567~3584
Satoh H, Nishi A, Yamashita K, Takemoto Y, Tanaka Y, Hosaka Y,
Sakurai A, Fujita N, Nakamura Y (2003). Starch-branching
enzyme I-deficient mutation specifically affects the structure
and properties of starch in rice endosperm. Plant Physiol, 133:
1111~1121
Scheible WR, Morcuende R, Czechowski T, Fritz C, Osuna D, Pala-
cios-Rojas N, Schindelasch D, Thimm O, Udvardi MK, Stitt M
植物生理学报316
(2004). Genome-wide reprogramming of primary and secondary
metabolism, protein synthesis, cellular growth processes, and the
regulatory infrastructure of Arabidopsis in response to nitrogen.
Plant Physiol, 136: 2483~2499
Semiarti E, Ueno Y, Tsukaya H, Iwakawa H, Machida C, Machida Y
(2001). The ASYMMETRIC LEAVES2 gene of Arabidopsis thali-
ana regulates formation of a symmetric lamina, establishment of
venation and repression of meristem-related homeobox genes in
leaves. Development, 128: 1771~1783
Shomura A, Izawa T, Ebana K, Ebitani T, Kanegae H, Konishi S,
Yano M (2008). Detection in a gene associated with grain size
increased yields during rice domestication. Nat Genet, 40:
1023~1028
Shuai B, Reynaga-Peña CG, Springer PS (2002). The LATERAL OR-
GAN BOUNDARIES gene defines a novel, plant-specific gene
family. Plant Physiol, 129 (2): 747~761
Song XJ, Huang W, Shi M, Zhu MZ, Lin HX (2007). A QTL for rice
grain width and weight encodes a previously unknown RING-
type E3 ubiquitin ligase. Nat Genet, 39: 623~630
Wang S, Wu K, Yuan Q, Liu X, Liu Z, Lin X, Zeng R, Zhu H, Dong G,
Qian Q et al (2012). Control of grain size, shape and quality by
OsSPL16 in rice. Nat Genet, 44: 9
Weng J, Gu S, Wan X, Gao H, Guo T, Su N, Lei CL, Zhang X, Cheng
ZJ, Guo XP et al (2008). Isolation and initial characterization of
GW5, a major QTL associated with rice grain width and weight.
Cell Res, 18: 1199~1209
Xing Y, Zhang Q (2010). Genetic and molecular bases of rice yield.
Annu Rev Plant Biol, 61: 421~442
Xu B, Li Z, Zhu Y, Wang H, Ma H, Dong A, Huang H (2008). Ara-
bidopsis genes AS1, AS2, and JAG negatively regulate bound-
ary-specifying genes to promote sepal and petal development.
Plant Physiol, 146 (2): 566~575
Xu L, Xu Y, Dong A, Sun Y, Pi L, Xu Y, Huang H (2003). Novel
as1 and as2 defects in leaf adaxial-abaxial polarity reveal the
requirement for ASYMMETRIC LEAVES1 and 2 and ERECTA
functions in specifying leaf adaxial identity. Development, 130
(17): 4097~4107
Zhang X, Wang J, Huang J, Lan H, Wang C, Yin C, Wu Y, Tang H,
Qian Q, Li J et al (2012). Rare allele of OsPPKL1 associated
with grain length causes extra-large grain and a significant
yield increase in rice. Proc Natl Acad Sci USA, 109 (52):
21534~21539