全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (7): 671~681 671
收稿 2013-06-04　　修定 2013-06-19
资助 国家转基因专项(2011ZX08002-002)。
* 通讯作者(E-mail: minqinwang2002@sdu.edu.cn; Tel: 0531-
88364997)。
TaCHP耐盐转基因小麦新种质创制
刘晓华, 王敏琴*, 夏光敏
山东大学生命科学学院, 植物细胞工程与种质创新教育部重点实验室, 济南250100
摘要: 为提高小麦的耐盐性,以农杆菌介导的生长点转化法将TaCHP基因导入小麦品种‘济南17’和‘济麦22’中。经潮霉素涂
抹和PCR检测, T0代转基因植株的阳性率分别为6.7%和5.8%; T1代阳性率为11.1%和19.0%; T2代阳性率为4.3% (JN17, 1个株
系)和9.4% (JM22, 5个株系)。转基因株系现已种植到T5代, 遗传分析表明该基因已在T5代转基因株系中稳定表达。T5代阳
性株系显示了明显耐盐性, 已进行盐碱地的安全性中间试验。抗逆生理指标分析显示, NaCl胁迫下, 与亲本小麦对照相比,
转基因株系的脯氨酸含量升高, MDA含量降低, POD和CAT酶活都有所增加。表明TaCHP基因通过渗透调节和维持氧化还
原稳态提高了小麦对盐胁迫的耐受性。
关键词: 普通小麦; 盐胁迫; TaCHP基因; 生长点转化; 转基因植株
Creation of New Transgenic Wheat Germplasm with Salt Tolerance of TaCHP
LIU Xiao-Hua, WANG Min-Qin*, XIA Guang-Min
The Key Laboratory of Plant Cell Engineering and Germplasm Innovation, Ministry of Education, School of Life Science, Shan-
dong University, Jinan 250100, China
Abstract: To obtain salt tolerant wheat, a salt-tolerance TaCHP gene was introduced into two wheat varieties
‘Jinan17’ (JN17) and ‘Jimai22’ (JM22) under Agrobacterium inoculum to shoot apical meristem of wheat seed-
ling. 29 (JN17) and 32 (JM22) T0 transgenic plants were obtained by hygromycin resistant and the PCR identi-
fication respectively. The average transformation efficiency of T0 generation was 6.7% and 5.8% in two wheat
varieties respectively. The transformation frequency of T1 generation was 11.1% and 19.0% respectively.
The positive transgenic rate of T2 was 4.3% and 9.4% individually. Genetic analysis shows that one transgenic
line of JN17 and five transgenic lines of JM22 in T2 transgenic plants were obtained. Now, the positive trans-
genic plants have been cultivated to T5 generation and showed more salt tolerance than control plants grown on
salt-alkaline area. The salt tolerance analysis of the transgenic lines shows that the proline content in the trans-
genic wheat was higher than in control, the MDA content was lower in the transgenic wheat than in control.
With the increasing of salinity, the activity of POD and CAT were higher in the transgenic wheat than in nega-
tive control.
Key words: wheat (Triticum aestivum L.); salt tolerance; TaCHP gene; transformation of shoot apical
meristem; transgenic plant
小麦(Triticum aestivum L.)是世界上分布最
广、最重要的粮食作物之一, 为人们提供了丰富
的能量和蛋白质。随着环境的日益恶化, 小麦等
粮食作物的种植和产量受到严重限制, 据统计我
国有可利用潜力的盐渍土面积约1.33×107 hm2, 占
全国耕地面积的10%左右(王佳丽等2011)。利用转
基因技术培育抗盐性小麦品种, 改良作物对盐胁
迫的耐受性, 在未来农业生产中应用前景广阔。
转基因技术突破了传统育种种质资源交流的
限制, 增强了小麦育种种质资源的利用和育种改
良技术的可操作性(欧巧明等2005)。自1993年
Vasil等利用基因枪法将GUS/Bar基因转入小麦愈
伤组织, 获得了可育转基因植株以来, 人们尝试通
过基因枪、农杆菌介导、花粉管通道及PEG介导
等方法转化小麦, 涉及的受体材料包括幼胚、成
熟胚、花药愈伤组织、幼穗、芽尖和花器官等(欧
巧明等2005; 叶兴国等2011)。在抗病虫害、耐
盐、旱、涝及冷逆境胁迫, 品质改良等转基因小
麦研究中取得了许多突破(薛哲勇等2003; Zhao等
植物生理学报672
2006; 张彦等2012)。
与其他禾本科植物相比, 小麦转基因的成功
率非常低, 主要原因是小麦愈伤组织培养及高频
再生受到外植体来源、基因型及培养基组成等多
种因素影响, 成为限制获得可育转基因植株的“瓶
颈” (Filippov等2006; Ren等2010)。为了避开转基
因技术对组织培养的过分依赖, Zhao等(2006)利用
农杆菌介导的茎生长点转化法(transformation by
Agrobacterium inoculum to shoot apical meristem),
首次获得转β-1,3-葡聚糖酶基因的可育小麦转基因
株系, 经PCR、Southern和Northern检测证明该基
因已整合到小麦基因组中, 转基因植株对白粉病
表现一定抗性。Supartana等(2006)尝试用蘸有农
杆菌的细针穿刺浸泡1 d的小麦种子芽尖部位, 2 d
后进行灭菌和春化处理, Southern杂交鉴定出5个
农艺性状表现差异的转基因株系。梁欣欣等
(2007)通过农杆菌介导的茎尖转化法实现DREB1A
基因导入小麦。Yang等(2008)用农杆菌侵染刺伤
处理的小麦幼苗芽尖, 比较了苗龄和农杆菌侵染
时间对小麦茎尖转化效率的影响。董福双等
(2009)利用基因枪轰击芽生长点法, 将BADH基因
导入小麦获得T1代抗性转基因植株。赵同金等
(2010)通过农杆菌介导, 将大麦Mlo反义基因导入
小麦获得了具有白粉病抗性的转基因株系, T0代平
均转化率达13.58%, 体现了生长点转化法简单、
快速、高效的特点。胡晓晴等(2013)比较了农杆
菌介导的小麦芽生长点和分蘖节遗传转化, 认为
芽生长点法高于分蘖节法的转化率。
‘山融3号’ (Shanrong No.3, SR3)是本实验室创
建的高产耐逆小麦体细胞杂种新品种, 通过对SR3
及其亲本‘济南177’ (Jinan 177, JN177)经不同时间
盐胁迫后不同组织的诱导表达谱分析, 发现一个
在SR3和JN177中有明显特异表达的锌指蛋白
(zine finger protein)基因TaCHP (Li等2010)。前期
的实验结果表明, TaCHP受胁迫诱导, 其在小麦和
拟南芥的过表达导致转基因株系耐逆能力明显上
升。本实验采用农杆菌介导的小麦茎尖生长点转
化技术, 获得了稳定遗传的转基因株系。表型、
遗传及理化分析表明, 转基因小麦株系耐盐性明
显高于亲本对照株系, 已经用于生物安全性中间
试验。
材料与方法
1 实验材料
1.1 受体材料
选用山东省推广种植的优质小麦(Triticum
aestivum L.)品种‘济南17’ (Jinan17, JN17)及‘济麦
22’ (Jimai22, JM22) (由山东省农业科学院作物所
提供)为受体。
1.2 表达载体
将本实验室前期从SR3 cDNA中克隆到的
TaCHP基因(Li等2010), 经过限制性内切酶(SacI和
KpnI)双酶切连接到pUN1301载体上构成pUN-
1301-ubi-TaCHP, 并转化大肠杆菌DH5α完成载体
构建, 经测序无误后转化农杆菌(Li等2010)。
1.3 药品与试剂
克隆基因所用的引物合成及测序由上海生工
公司完成。凝胶回收试剂盒, 质粒提取试剂盒购
自上海生工公司。RNA提取所用的TRIzol、DNA
聚合酶、限制性内切酶、DNA Marker等购自Ta-
KaRa公司。过氧化氢酶检测试剂盒购自碧云天公
司。M-MLV反转录酶由Promega公司生产。Sou-
thern杂交所用尼龙膜为Amershan Biosciences公司
生产的Hybond-N+, 试剂盒为ROCHE生产的DIG
High Prime DNA Labeling and Detection Starter
Kit I。
2 实验方法
2.1 受体材料的准备
取饱满的JN17和JM22小麦种子, 0.1%升汞灭
菌15 min, 无菌水冲洗4~5遍, 加少量无菌水, 于摇
床(200 rpm)振荡浸泡12 h, 摆放在湿润无菌滤纸上
使其萌发, 置于4 ℃暗培养, 春化28~30 d。
2.2 农杆菌浸染液的制备
从YEP平板上挑取农杆菌的单菌落, 接种于
液体YEP培养基(含50 mg·L-1卡那霉素+50 mg·L-1
利福平 )中 , 于28 ℃、200 rpm培养到OD 600=
0.8~1.0, (1 359~2 124)×g离心15 min, 弃上清液, 沉
淀用等体积的含100 μmol·L-1乙酰丁香酮(actosy-
ringone, AS)的无菌水重新悬浮, 备用。
2.3 小麦茎尖生长点转化
用75%酒精擦拭过的刀片, 沿胚芽中轴切开
至基部, 去除一侧胚芽鞘和未展开的幼叶, 使生长
点暴露并造成创伤, 用注射器吸取侵染液, 滴于生
刘晓华等: TaCHP耐盐转基因小麦新种质创制 673
长点处, 反复侵染操作2~3次, 具体转化方法参见
Zhao等(2006)和赵同金等(2010)。将幼苗置于无菌
培养皿中, 室温下, 暗培养3 d, 光照培养至新叶长
出后, 移栽于土壤中。
3 转基因小麦的筛选和分子检测
3.1 转基因植株的抗生素筛选
移栽入土的转化植株生长3周后, 用100 mg·L-1
的潮霉素 B (hygromycin B, Hyg)溶液涂抹其新生
叶片, 并对涂抹部位进行标记, 2 d涂抹1次, 每次均
在标记处进行, 共进行2周。待T0代植株生长到4~5
片叶时, 剪取Hyg抗性植株的新生叶片进行PCR检
测, 以后每代均进行PCR阳性植株检测。
3.2 T1~T5代转基因株系的PCR检测
用改良的CTAB (Cetyltrimethyl Ammonium
Bromide)法(Doyle和Doyle 1990)提取T1~T5代转基
因株系基因组DNA, 根据Ubiquitin启动子和TaCHP
基因序列设计PCR检测引物UTA (5′-TTTATGATT-
A G A G T C C C G C - 3 ′ )和T F 8 S ( 5 ′ - T TA G C -
CATTTCTCCCATC-3′), 扩增片段大小为751 bp。
反应体系为20 µL, PCR扩增程序: 94 ℃ 5 min; 94
℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 35个循环; 72 ℃ 10
min。以1.0%琼脂糖凝胶100~120 V稳压电泳(北京
六一仪器厂, DYY-8C型电泳仪) 20 min, 溴化乙锭
(ethidium bromide, EB)染色10 min, 用自来水冲洗
干净, 置于凝胶成像仪(UVP Biospectrum Ac Sys-
tem with Gel Camera)上照相观察。
收获的阳性T0代种子种植于花盆中, 对T1植株
进行PCR阳性检测并单穗收获种子; 将收获的T1代
种子种植于实验室温室中进行加代, 同时进行T2代
转基因PCR阳性植株测定并单株、单穗收获T2代
种子。
3.3 耐盐转基因小麦T3~T5代的盐碱地种植筛选
为了检验转TaCHP基因植株在盐碱地的生长
状态, 挑选所得的6个转基因纯系的部分T2代转基
因植株和亲本小麦的种子, 于2010年10月至2011年
6月(T3代)、2011年10月至2012年6月(T4代)及2012
年10月至2013年 6月(T5代)种植于山东省林科院东
营实验站盐碱试验田中(含盐量0.3%~0.4%, pH 8),
每代种子均单株/穗收获。每年从来源于JN17和
JM22的6个转基因株系中分别随机选取部分植株
进行PCR阳性检测。
3.4 转基因小麦T5代的RT-PCR检测
选取T5代PCR阳性的转基因株系和亲本对照
植株, 用2.1的方法萌发后培养于1/2Hoagland培养
液中, 待其生长至三叶期, 以含200 mmol·L-1 NaCl
的1/2Hoagland培养液分别处理植株24 h后, 取植株
根系0.02 g, 液氮速冻并保存于–80 ℃, 用于提取总
RNA。以Olig (dT)为引物, 参照M-MLV反转录酶
说明书反转录cDNA。小麦B-Actin内参引物为
TaActin-A: 5′-GAACCTCCACTGAGAACAACAT-
TACC-3′; TaActin-S: 5′-GTTCCAATCTATGAGG-
GATACACGC-3′; TaCHP基因及上游启动子引物
为UTA: 5′-TTTATGATTAGAGTCCCGC-3′; TF8S:
5′-TTAGCCATTTCTCCCATC-3′。反应体系20 µL,
PCR扩增程序: 94 ℃, 5 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s,
72 ℃ 1 min, 35个循环; 72 ℃, 10 min, 10 ℃保存。
电泳、染色并观察同3.2。
3.5 转基因小麦T5代的Southern杂交分析
取PCR和RT-PCR检测为阳性的转基因植株基
因组DNA 120 μg, 经HindIII单酶切, 以亲本小麦作
为阴性对照, 质粒pUN1301-ubi-TaCHP为阳性对
照, 0.8%的琼脂糖凝胶电泳后, 用碱变性真空吸
印 , 转至尼龙膜上。根据GUS基因序列设计探
针。具体操作参见DIG试剂盒说明书。探针长度
为570 bp。
4 T5代转基因小麦耐盐性分析
4.1 转基因小麦实验室水培耐盐性分析
选取T4代转基因株系和亲本小麦种子用2.1的
方法萌发并培养于1/2Hoagland培养液中, 待其生
长至三叶期, 用含200 mmol·L-1 NaCl的1/2Hoagland
培养液处理14 d, 观察植株形态改变。
4.2 转基因植株耐盐生理指标测定
选取经RT-PCR及Southern杂交为阳性的T4代
转基因株系及亲本小麦的种子, 用2.1的方法萌发后,
培养于1/2Hoagland培养液中, 待其生长至三叶期,
进行NaCl处理, 浓度分别为0、100和200 mmol·L-1,
为防止盐激作用, 每2 d以50 mmol·L-1浓度递增, 直
到预定浓度, 然后处理7~10 d, 观察叶片及根的生
长状态并进行耐盐生理指标测定。
4.2.1 脯氨酸(proline, Pro)含量测定 实验操作参
照张殿忠等(1990)方法。取RT-PCR及Southern杂
交为阳性的T5转基因和亲本小麦的新鲜叶片0.5 g,
植物生理学报674
加3%磺基水杨酸5 mL, 充分研磨, 经加热、离心,
取上清液, 即为Pro粗提液。加入酸性茚三酮并加
热后, 溶液即呈红色, 再用甲苯萃取, 色素则全部
转移至甲苯中。色素的深浅与Pro含量呈正相关。
在520 nm波长下比色。从标准曲线上查出(或用回
归方程计算) Pro的含量。
4.2.2 丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量测定
采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛的含量(林植芳等
1984)。分别剪取RT-PCR及Southern杂交为阳性的
T5转基因和亲本小麦叶片0.4 g, 加入5 mL 5%三氯
乙酸(TCA)和少量石英砂充分研磨, 9 168×g离心10
min, 所得上清液即为样品提取液。取2 mL提取液,
加入等体积的0.67%硫代巴比妥酸溶液, 加热处
理。迅速冷却、离心、取上清液。测量450 nm、
532 nm和600 nm处的OD值(A), 以水代替提取液
调零。以C=6.45×(OD532–OD600)–0.56×OD450 (C:
MDA的浓度, μmol·L-1)公式, 根据植物组织的鲜重
(FW·g-1)计算测定样品中MDA的含量: MDA浓度
[μmol·g-1 (FW)]=C×提取液体积(mL)×0.001。
4.2.3 过氧化氢酶(catalase, CAT)活性 采用碧云
天公司生产的过氧化氢酶检测试剂盒测定, 编号
S0051。
4.2.4 过氧化物酶(peroxidase, POD)测定 实验操
作参照高俊凤(2006)方法。分别剪取RT-PCR及
Southern杂交为阳性的T5转基因和亲本小麦叶片
0.5 g (W), 加入2 mL的0.05 mol·L-1的磷酸缓冲液
(pH=7.8), 冰浴研磨, 4 ℃离心取0.02 mol·L-1上清
液(a), 比色(pH=7.8的磷酸缓冲液为对照)。加入3
mL (V)的反应液后, 每隔1 min (t)读取一次470 nm
下的OD值。按此公式计算POD活性: POD总活性
[nm·min-1·g-1 (FW)]=ΔOD470×V×(a×W×t)
-1。
5 数据分析
用SPSS 17.0 Statistics (Statistical Product and
Service Solutions)对所得到的各项生理指标进行数
据的统计学分析。
实验结果
1 转TaCHP基因T0~T5代阳性植株的获得及分析
经Hyg涂抹及PCR检测获得T0代阳性转基因
植株29 (JN17)和32 (JM22)株。阳性率分别为6.7%
和5.8%。将获得的T0代阳性种子种下, T1代转基因
PCR测定阳性率分别为11.1%和19.0%。T2代转基
因PCR阳性检测率分别4.3% (JN17的1个株系, No.
25)和9.4% (JM22的5个株系, No. 86、148、167、
255和420)。从T3代起选取6个纯合转基因株系的
部分植株种植在山东省林科院东营实验站盐碱试
验田中, 所选植株均经PCR测定为阳性。将阳性植
株单穗收获。现已得到稳定遗传至T5代的6个转基
因株系。T0~T2代转基因植株PCR检测阳性率统计
结果如表1。图1表示进行茎尖生长点转化的操作
流程。图2为部分T0代阳性植株的Hyg涂抹筛选、
PCR检测结果及东营盐碱地种植的T5代转基因植
株(JN17的No.25)。东营盐碱地的转基因株系表现
为株高比亲本小麦高, 分蘖数增加(统计数据未显
示)。实验及统计结果还显示, 种植于盐碱地的转
基因株系的生理指标、农艺性状及产量等优于亲
表1 生长点法T0~T2代PCR检测为阳性转基因小麦的统计结果
Table 1 The PCR results of T0–T2 of transgenic plants
亲本品种
T0代转基因植株 T1代转基因植株 T2代转基因植株
Hyg阳性率/% PCR阳性植株数 PCR阳性率/% 结穗率/% PCR阳性率/% 结穗率/% PCR阳性率/% 结穗率/%
JN17 62.8 29 6.7 34.5 11.1 100.0 4.3 100
JM22 52.2 32 5.8 65.6 19.0 87.5 9.4 100
本对照(统计数据未显示)。
2 部分T5代转基因小麦RT-PCR分析
选取T5代5个阳性株系来源的部分植株进行
RT-PCR, 转基因株系中均有TaCHP基因mRNA表
达, 并高于亲本小麦对照(图3), 表明外源基因能够
在转基因株系中稳定表达。
3 部分T5代转基因小麦的Southern杂交结果
选取部分T5代阳性转基因小麦植株(JN17的
No. 25-2-5、JM22的 No. 86-3-2、148-2-1、167-
3-6和255-2-4)进行Southern杂交(图4), 结果显示
刘晓华等: TaCHP耐盐转基因小麦新种质创制 675
图1 小麦生长点转化法的操作流程
Fig.1 Wheat transformation by Agrobacterium inoculum to shoot apical meristem
A: 摆放在培养皿中萌发的种子; B: 种苗纵切暴露出生长点(箭头示生长点); C: 生长点转化后移栽入土的幼苗(箭头示新长出的幼叶);
D: 抽穗的T0代阳性植株。
图2 转基因植株的筛选及T5代盐碱地中间试验
Fig.2 The selection of transgenic plant and intermediate test of T5 generations in salinity-alkalinity soil of Dongying
A: Hyg涂抹的转基因及亲本小麦的叶片(+: 潮霉素抗性植株, -: 潮霉素敏感亲本小麦); B: 部分T0代阳性植株PCR结果(M: λDNA/
EcoRI+HindIII marker; +: 阳性质粒; -: 水; 1~2: 亲本小麦JN17、JM22; 3~4: JN17转基因阳性株系No. 21、33; 5~8: JM22转基因阳性株系
No. 51、148、179和189); C: 种植在东营盐碱土中的T5代转基因株系及亲本小麦, 箭头“　”所指为转基因株系(JN17的No. 25), 箭头“←”所
指为亲本(JN17)对照。
▼
植物生理学报676
RT-PCR检测呈阳性的株系, Southern杂交后均表现
阳性, 而亲本对照无杂交信号。其中, 来源于JN17
的No. 25-2-5、JM22的No. 86-3-2和167-3-6中
TaCHP基因是以单拷贝形式整合到受体基因组中;
来源于JM22的148-2-1和255-2-4以双拷贝形式整
合入受体基因组中。
4 T5代转基因小麦耐盐性分析
4.1 转基因水培植株耐盐性分析
取部分转基因植株(JN17的No. 25-2-5)和亲本
对照植株, 用200 mmol·L-1 NaCl溶液处理14 d后,
观察植株形态变化。与转基因植株相比, 亲本小
麦植株发育明显受到抑制, 植株萎蔫瘦小, 叶尖变
黄(图5-A, 1), 根较短(图5-B, 1), 呈盐胁迫的表型;
而转基因植株生长基本正常, 植株挺拔强壮, 叶片
色绿(图5-A, 2), 根系明显长于亲本小麦植株(图
5-B, 2), 表明在实验室水培及NaCl处理下, 转基因
株系对盐胁迫有更强的耐受性。
4.2 T5代转基因植株生理指标测定
4.2.1 转基因植株叶片中Pro含量分析 未施加
NaCl处理时, 转基因株系及亲本小麦的Pro含量没
有明显差异, 含量介于(130~170)×10-6 μg·g-1 (FW)
之间; 随着NaCl浓度的升高, 转基因及亲本小麦植
株中脯氨酸含量均有增加(图6-A), 当NaCl处理浓
度达200 mmol·L-1时转基因小麦中Pro平均含量为
1 026×10-6 μg·g-1 (FW), 此时亲本对照中Pro含量约
为720×10-6 μg·g-1 (FW), 差异极其显著(P<0.01), 200
mmol·L-1 NaCl处理下6个转基因株系JN17的No.
25-2-5, JM22的No. 86-3-2、148-2-1、167-3-6、255-
2-4和420-3-1比亲本对照Pro含量分别增加了47%、
53%、33%、29%、65%和29%。说明转基因小麦
积累脯氨酸能力更强, 其适应渗透调节能力更强。
图3 T5代部分转基因株系RT-PCR结果
Fig.3 The RT-PCR result of TaCHP gene in T5 transgenic
wheats
1: 亲本对照; 2~6: 转基因株系JN17的No. 25-2-5、JM22的No.
86-3-2、148-2-1、167-3-6和255-2-4。
图4 T5代阳性植株Southern杂交结果
Fig.4 The Southern blotting profile of T5 positive transgenic
plants
M: λDNA/EcoRI+HindIII marker; +: 阳性质粒pUN1301-ubi-
TaCHP对照; -: 亲本小麦对照; 1: JN17的 No. 25-2-5; 2~5: JM22的
No. 86-3-2、148-2-1、167-3-6和255-2-4转基因株系。
图5 200 mmol·L-1 NaCl处理14 d后转基因小麦与亲本对照生长状态的比较
Fig.5 Comparing the growth status of transgenic plants (JN17, No. 25-2-5) and their control under 200 mmol ·L-1 NaCl treatment
for 14 days
A: 叶片的生长状态; B: 根的生长状态; 1: 亲本对照; 2: 转基因株系JN17的No. 25-2-5。
刘晓华等: TaCHP耐盐转基因小麦新种质创制 677
4.2.2 转基因植株叶片中MDA含量分析 图6-B示
转基因与亲本小麦植株叶片中MDA含量的测定结
果。NaCl处理前(0 mmol·L-1 NaCl), 转基因与亲本
小麦植株MDA含量差异不大, 约为5.4~7 μmol·g-1。
经100 mmol·L-1 NaCl处理, 转基因植株叶片中MDA
含量介于8~9.2 μmol·g-1, 亲本对照叶片中MDA含
量升高至9.6 μmol·g-1, 差异不显著(P>0.05); 200
mmol·L-1 NaCl处理后, 转基因植株叶片中MDA含
量增至9~11 μmol·g-1, 6个转基因株系(JN17的No.
25-2-5、JM22的No. 86-3-2、148-2-1、167-3-6、
255-2-4和420-3-1)分别比0 mmol·L-1 NaCl处理时增
加70%、77%、77%、89%、33%和70%; 此时亲
本小麦植株叶片中MDA含量升高至14.3 μmol·g-1,
比0 mmol·L-1 NaCl处理组增加约104%, 差异显著
(P<0.01)。转基因小麦MDA含量增加比亲本小麦
缓和。表明转基因小麦在200 mmol·L-1 NaCl处理
下, 其抗氧化能力高于亲本小麦, 对NaCl胁迫耐受
性更强。
4.2.3 转基因植株中CAT和POD酶活性分析 CAT
酶活性测定结果如图6-C。0 mmol·L-1 NaCl处理下,
转基因植株叶片中CAT平均酶活性为624 U·mL-1, 亲
本植株叶片中为497 U·mL-1。以100 mmol·L-1 NaCl
处理后, 转基因植株叶片中CAT的平均酶活性为1
831 U·mL-1, 比0 mmol·L-1NaCl处理组提高107%两
者差异显著(P<0.01)。 6个转基因株系(JN17的No.
25-2-5、JM22的No. 86-3-2、148-2-1、167-3-6、
255-2-4和420-3-1)分别比0 mmol·L-1 NaCl处理时
增加202%、265%、190%、168%、228%和218%;
而亲本对照植株叶片中CAT酶活性为813 U·mL-1,
比0 mmol·L-1 NaCl处理组增加63.5% 两者差异显
著(P<0.01)。经200 mmol·L-1NaCl处理, 转基因与
亲本对照植株叶片中CAT平均酶活性分别为1 947
U·mL-1和1 032 U·mL-1, 比100 mmol·L-1 NaCl处理组
CAT酶活性均略有上升, 增长趋势相似。
图6-D为POD酶活性测定结果, 随着NaCl处理
浓度的逐渐增高, 转基因小麦叶片的平均愈创木
图6 T5代转基因小麦生理指标测定
Fig.6 Determination of physiological indexes on effects of salt stress of transgenic wheat
NaCl处理后转基因与对照株系叶片中A: Pro含量测定; B: MDA含量测定; C: CAT酶活性变化; D: POD酶活性变化。图中WT: 亲本株
系; 1~6: JN17的No. 25-2-5、JM22 的No. 86-3-2、148-2-1、167-3-6、255-2-4和420-3-1。
植物生理学报678
酚-POD活力分别为59、93和159 nm·min-1·g-1 (FW),
亲本对照株系分别为56、88和120 nm·min-1·g-1
(FW)。转基因植株经100及200 mmol·L-1NaCl处理
后, 叶片中POD酶活性比亲本对照平均提高6.6%
和32.8%, 其中200 mmol·L-1 NaCl处理后6个转基因
株系(JN17 No. 25-2-5、JM22 No. 86-3-2、148-2-1、
167-3-6、255-2-4和420-3-1)分别比对照亲本株系
增加40%、36%、22%、48%、21%和30%。
转基因株系在NaCl胁迫下POD、CAT两种抗
氧化酶类增加量均比亲本株系大, 说明转基因植
株具有较强的氧自由基清除能力。
讨　　论
1 影响转化效率的因素
农杆菌介导的小麦茎尖转化是近几年发展起
来的实验技术, 具有易于取材、操作简便、转化
率高等优点。避免了组织培养周期长、对受体基
因型依赖性强、植株再生困难等限制(Zhao等
2006)。要提高小麦农杆菌茎尖转化的效率应注重
以下几方面操作: (1)单子叶植物不是农杆菌的天
然宿主, 要提高农杆菌对单子叶植物的感染性, 对
受体人为造成机械损伤是农杆菌侵入细胞的重要
条件。生长点位于芽轴的顶端 , 其细胞不断分
裂、分化产生新的芽结构, 使芽轴伸长。本实验
用刀片对小麦幼芽进行纵切, 暴露生长点并适度
在生长点上造成创面, 操作中既要防止切面过深
而切掉生长点, 又要将生长点充分暴露并产生伤
口达到受体与农杆菌的充分互作, 实现外源基因
遗传转化的目的。(2)张明洲等(2006)认为, 菌液浓
度对高粱茎尖分生组织细胞中的GUS基因瞬时表
达频率影响显著。本研究发现菌液浓度对小麦茎
尖分生组织的转化效率影响显著, 最佳侵染菌液
浓度应维持在OD600=0.1~0.2。由于切割后的小麦
茎尖分生组织与农杆菌的共培养时间长达7~10 d,
直至新的幼叶长出后才能移栽入土(图1-C), 在此
过程中农杆菌大量增殖。如果侵染初期使用的农
杆菌侵染液浓度过高, 茎尖细胞受到农杆菌的伤
害过度, 新叶不易长出, 而且根部常被过度增殖的
农杆菌菌液包裹导致植株烂根死亡。(3)因幼芽切
割和其后的共培养过程不能保证环境为严格的无
菌状态, 幼芽培养液易被杂菌污染, 使转基因植株
的成活率降低, 故在共培养过程应经常查看幼芽,
如发现农杆菌增殖过快或受到杂菌污染, 可用无
菌水冲洗幼芽 , 以提高转基因幼苗移栽的成活
率。(4)切割出茎尖分生组织的过程使大部分已生
成的幼叶被破坏, 共培养实质上是幼苗恢复和新
叶形成的过程, 当叶原基分化出的新叶展开, 可充
分进行光合作用保证植株生长所需时, 才可将幼
苗移栽入土, 移栽中应注意不使土壤覆盖住新生
的叶片。通过这些实际操作可显著提高转基因幼
苗的成活率并保证转化效率。
2 影响目的基因稳定性的原因
获得的转基因植物能否保持外源基因的稳定
性, 即能否稳定地遗传给后代, 直接关系到基因工
程新品种的培育。本实验观察统计了T0代阳性植
株的结穗数及穗粒数, 其中阳性植株的结穗率只
有46.8%, 均没有分蘖, 平均穗粒数为3.3粒, 转基因
植株生长缓慢, 矮小。而对照植株平均穗粒数36
以上, 分蘖能力强。可能原因是对茎尖切割转基
因处理使生长点因机械损伤及农杆菌侵染而受到
严重伤害, 打断了幼苗的正常生长进程, 必须重新
分化幼叶, 以重建植株形态。因新生幼叶在分生
组织生长和发育阶段就受到外界环境的影响, 从
而造成了植株矮小、生长缓慢, 进而导致结实率
低下。由表1知, T2代转基因植株PCR检测阳性率
明显低于T1代, T1代转基因阳性率明显低于T0代,
意味着大量T0代阳性植株中目的基因并没有经T1
代稳定遗传至T2代。茎尖转化法得到纯合的不发
生分离的转基因后代需要经过几代连续的阳性筛
选, 原因如下: 茎尖转化获得的当代转基因植株由
多细胞嵌合体组成。从细胞水平看小麦生殖发育
形成的小穗原基、小花原基、苞叶原基和种子等
由转基因细胞和非转基因细胞形成的嵌合体组
成。小麦为自花授粉植物, T1代转基因嵌合体植株
在营养生长和生殖生长过程中, 会形成纯合的转
基因后代(T1代种子)。但外源基因在植物核基因
组中整合时远比常规育种复杂, 常规育种是染色
体水平上的重组及同源染色体单体在减数分裂过
程中的交换, 其遗传规律明确(王关林和方宏筠
1998)。而外源基因的转移, 对于受体基因组而言
应该是一种 “干扰”, 生物体必定要作出反应(张福
泉等2000)。整合位点的复杂性导致有性繁殖过程
刘晓华等: TaCHP耐盐转基因小麦新种质创制 679
的遗传规律比较复杂。阎新甫等(1994)指出保持
整合外源基因的完整性是实现基因转化的基本条
件。但外源基因的整合涉及到基因的缺失、易
位、倒位及重复等一系列的结构变化, 这种外源
基因的重排既对基因的表达调控有重要影响, 也
可导致整合位点多、拷贝数多、整合的遗传效应
复杂等(Das和Bhowmik 1997)。本实验Southern杂
交显示(图4), T5代中不同株系仍有单拷贝和双拷
贝外源基因的插入事件, 推测在转基因初期(T0)可
能存在着外源的多拷贝插入。T0~T2代连续出现转
基因阳性植株检出率降低也说明外源基因在受体
细胞中经历着一个复杂的过程, 它与转化细胞的
有丝分裂及减数分裂异常相关, 使外源基因在受
体中呈现逐渐稳定的过程。正如张福全等(2000)
认为的转基因植物性状的逐渐稳定实质上是植物
体的一种“排异本能”的反应。此外, 在T0代共培养
过程中, 转基因植株上常有农杆菌残留, 导致检测
时T0代阳性率较高。植株的顶端分生组织由叶原
基和芽原基包裹, 而生殖器官的分化较晚, 所以只
有外源基因成功导入茎顶端分生组织细胞, 才能
得到稳定遗传的转基因后代。如果只有叶原基或
芽原基被转化, 则形成T0代的假阳性植株, 其后代
无法检测到外源基因。解决方法是使用机械手段
适度损伤生长点, 使农杆菌与茎尖分生组织细胞
充分互作。同时应注意对每代阳性转基因植株进
行PCR测定并对所得高代转基因植株进行RT-PCR
(或real-time PCR)测定及Southern杂交验证, 才能
确保转基因成功。
3 转基因植株的耐盐性分析
盐胁迫对植物的伤害包括离子胁迫、渗透胁
迫及这两种胁迫导致的二级胁迫如活性氧胁迫
等。廖宝文等(2010)指出, 植物体内的抗逆生理指
标随逆境胁迫的大小而变化, 是细胞结构和功能
遭受伤害的反映, 也反映了植物对逆境的适应能
力。盐渍条件下, 植物通过渗透调节来减轻或避
免伤害(李敏等2012)。多个研究显示, 植物受到盐
胁迫时会积累高水平的渗透调节物质如脯氨酸等
以降低细胞的渗透势, 保持细胞内水分的平衡而
不至于外流, 从而维持细胞内渗透压的平衡和稳
定(Singh等1972)。Vendruseolo等(2007)证明干
旱、高渗等逆境会导致小麦体内脯氨酸浓度的迅
速积累, 从而增强小麦的抗逆性。本实验中转基
因小麦经200 mmol·L-1 NaCl处理后, Pro含量约为0
mmol·L-1 NaCl处理组的7倍左右, 是亲本小麦的
1.43倍(图6-A)。转基因株系中Pro积累水平明显高
于亲本对照, 这对转基因植株维持较高的细胞膨
压和细胞吸水能力非常重要。He等(2010)将耐盐
基因betA导入小麦, 使盐胁迫下转基因株系Pro含
量较亲本株系升高76%, 与本研究结果类似。
植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代
谢起着重要作用。MDA是膜脂过氧化的产物可与
蛋白质氨基酸残基反应生成烯胺并造成蛋白质交
联。MDA含量的高低反应细胞质膜的完整性, 是
衡量膜脂过氧化的指标(文镜等2003)。Takahashi
和Asada (1983)认为植物遭受干旱、低温等逆境胁
迫时, 活性氧(ROS)会剧烈增加, 若不及时清除将
对细胞产生毒害作用, 比如攻击膜脂中的不饱和
键引发膜脂过氧化, 而膜脂过氧化程度可用MDA
的含量变化加以显示。本试验中, 200 mmol·L-1
NaCl处理后亲本小麦株系中MDA平均含量为转基
因株系的1.4倍, 转基因株系及亲本小麦对照经200
mmol·L-1 NaCl处理后MDA平均含量分别比相应0
mmol·L-1 NaCl处理组增加了69%和104% (图6-B),
转基因株系的MDA平均含量增长较亲本缓和, 抵
抗逆境胁迫带来的膜脂过氧化能力更强, 这与我
们在该基因过表达拟南芥中的结果一致(Zhao等
2012)。与此类似, Du等(2013)对 TaSIP转基因水稻
在盐胁迫下MDA含量测定, 也发现转基因株系
MDA比亲本株系增加量低。
盐胁迫会打乱植物体正常的代谢活动, 导致
植物体内过氧化氢(H2O2)、单线态氧(
1O2)等生物
活性物质(reactive oxygen species, ROS)大量迸发,
若不及时清除将对细胞产生毒害作用, 如攻击膜
脂中的不饱和键引起膜脂过氧化等, 使植株活性
氧代谢失调(Hasegawa等2000)。 植物内源保护酶
类, 如过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)能够
抑制细胞过氧化, 提高植物的耐盐性, 减轻活性氧
的伤害(Gao等2008; Cadet等2010)。 不同细胞会含
有一种或几种抗氧化剂来清除ROS对细胞产生的
毒害作用(Suzuki和Mittler 2006)。本研究中, 200
mmol·L-1 NaCl处理后, 转基因株系中CAT和POD平
均酶活性分别比0 mmol·L-1 NaCl处理组增加了
植物生理学报680
211%和169%, 而200 mmol·L-1 NaCl处理的亲本小
麦比0 mmol·L-1 NaCl亲本小麦植株中CAT和POD
活性增加63.5%和114%。100 mmol·L-1 NaCl和200
mmol·L-1 NaCl处理组中转基因株系的CAT和POD
平均酶活性均比相应亲本小麦中高, 且差异显著
(图6-C、D)。Suzuki和Mittler (2006)认为, 植物以
最经济的方式利用淬灭ROS的酶类来应对环境变
化, 在整个代谢网络中, 由ROS通过直接激活相关
的转录因子, 或通过激活其他代谢途径重要酶类
而调节非生物胁迫条件下胁迫信号的传导。本实
验结果预示NaCl胁迫会引发转基因植株中ROS大
量产生, 作为转录因子的TaCHP基因受到ROS调
控, 产生大量的基因产物, 间接促使细胞中与氧化
代谢相关的POD、CAT等酶类活性提高。而非转
基因株系中, 虽然细胞受氧化胁迫但其应激产生
的POD、CAT等酶类活性提高程度不如转基因株
系。综上, 所获转TaCHP基因的小麦株系可能通过
渗透调节、活性氧的去除两个方面来提高受体植
株的耐盐性。
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