全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 4期, 2010年 4月 347
收稿 2010-01-01 修定 　2010-02-22
资助 教育部新教师基金(20 0962 0212 0008 )。
* 通讯作者(E-mail: lish@gsau.edu.cn; Tel: 0931-7631547)。
LED不同光质对萝卜愈伤组织诱导、增殖和萝卜硫素含量的影响
刘浩 1, 李胜 1,2,*, 马绍英 1,2, 罗丽媛 1, 薛冲 1, 方艳 1, 张真 1, 刘媛 1
1甘肃农业大学生命科学技术学院植物细胞工程研究室, 兰州 730070; 2兰州汇通生物科技有限公司, 兰州 730000
提要: 以白水萝卜无菌苗及其愈伤组织为实验材料, 研究其在LED白、红、黄、蓝、绿和蓝红 6种光质下的愈伤诱导和增
殖。结果表明: LED不同光质下胚轴愈伤组织的诱导效应不同, 诱导率顺序依次为黄光>红光>蓝红光>白光>蓝光>绿光; 蓝
光、黄光和红光有利于子叶愈伤组织的诱导; 子叶诱导愈伤组织的效果较下胚轴好; LED红光下愈伤组织的增殖倍数和萝
卜硫素含量均为最高。
关键词: LED; 光质; 萝卜; 愈伤组织; 诱导; 增殖; 萝卜硫素
Effects of Different LED Light Qualities on Callus Induction, Proliferation and
Sulforaphane Content of Raphanus sativus L.
LIU Hao1, LI Sheng1,2,*, MA Shao-Ying1,2, LUO Li-Yuan1, XUE Chong1, FANG Yan1, ZHANG Zhen1, LIU Yuan1
1Laboratory of Plant Cell Engineering, College of Life Sciences and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730000,
China; 2Lanzhou Huitong Biological Science & Technology Ltd., Lanzhou 730000, China
Abstract: The callus induction and proliferation times of white radish (Raphanus sativus) under 6 kinds of LED
light qualities (red, yellow, green, blue, white and blue+red) were investigated in this experiment. Results showed
that different LED light qualities had different effects on callus induction of hypocotyls, with the efficiency in
order of yellow>red>blue+red >white>blue>green, and the blue light, the yellow light and the blue+red light
were all in favor of the callus induction of cotyledons, that more callus was induced from cotyledons than from
hypocotyls, and that LED red light was the most effective light quality for callus proliferation and sulforaphane
accumulation.
Key words: LED; light qualities; Raphanus sativus; callus; induction; proliferation; sulforaphane
萝卜硫素(sulforaphane, SUL)又称莱菔子素, 是
存在于很多种十字花科蔬菜里的一种生物活性化合
物, 能使细胞形成对抗外来致癌物侵蚀的膜, 启动
人体内的防御功能, 具有防癌、抗癌作用(Zhang等
1992)。近年来, 利用细胞和组织培养方法生产植
物次生物质已成为生物制药的主流, 萝卜为常见的
蔬菜, 从中提取萝卜硫素具有成本低、来源广等优
点。关于萝卜的组织培养国内外均有报道, 影响萝
卜离体培养的因素不仅有外植体的类型、培养
基、生长调节物质、温度、湿度等因子, 光对萝
卜的愈伤组织诱导也起重要的调节作用(王绍辉等
2008), 武建等(2003)、龙雯虹等(2006a, b)从培养
基组分和外植体的来源等方面对萝卜组织培养技术
进行了研究。LED作为一种高效节能的新型光源
在菊花(Kurilcik等 2008)和朵丽蝶兰(Shin等 2008)
等植物的组织培养研究中已有报道, 但在萝卜组织
培养研究中鲜见报道。本文利用LED不同光质对
白水萝卜无菌苗不同部位(子叶和下胚轴)及其诱导
的愈伤组织进行处理, 研究其对愈伤组织诱导、增
殖以及萝卜硫素的作用, 为从萝卜中提取萝卜硫素
及 LED光在组织培养中的应用提供参考。
材料与方法
实验材料为白水萝卜(Raphanus sativus L.)种
子(甘肃绿星农业科技有限责任公司提供)萌发所得
无菌苗的子叶、下胚轴及其诱导的愈伤组织。
白水萝卜种子用流水冲洗 1 h, 于超净工作台
用1% 84消毒液消毒1 min, 0.1% HgCl2消毒10 min,
最后用无菌水洗涤6~7次, 接种于不含生长调节剂
的MS培养基上, 每瓶 8粒种子, 置于(25±1) ℃和
12 h·d-1光周期下培养, 发芽后获得无菌苗。
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取 7天苗龄的无菌苗, 切取下胚轴(约 5 mm)
和子叶(约 5 mm×5 mm)接种到诱导培养基(MS+0.1
mg·L-1 2,4-D +2 mg·L-1 6-BA)上。分别置于 LED
白光(424~724 nm, 459 nm)、LED红光(606~657
nm, 635 nm)、LED黄光(567~606 nm, 588 nm)、
LED 蓝光(440~500 nm, 465 nm)、LED 绿光
(488~562 nm, 517 nm)和 LED蓝红光(440~500 nm,
606~657 nm, 465 nm, 635 nm) 6种光质、培养温
度(25±1) ℃下培养 30 d, 每个部位、每种光质下
10瓶, 每瓶 4块外植体。外植体接种 2 d后开始
观察其形态变化, 记录愈伤组织出愈时间和出愈数,
30 d后计算愈伤组织诱导率。
筛选质地疏松、生长旺盛的愈伤组织接种到
增殖培养基(MS+0.5 mg·L-1 NAA+3 mg·L-1 6-BA)
上。置于上述LED不同光质条件下, 培养温度(25±
1) ℃。每个处理 10瓶, 30 d后收获。观察愈伤
组织的生长状况, 统计愈伤组织数量。以上培养基
均附加 3%蔗糖和 0.5%琼脂, pH 5.8, 高压 0.105~
0.15 MPa、温度 121 ℃灭菌 20 min。
取室温下风干至恒重的愈伤组织研磨至粉末
状, 精确称取 1.0 g至 150 mL三角瓶中, 按 1:2比例
加水酶解过夜(12 h), 再用二氯甲烷浸提 2次, 料液
比 1:20, 每次 4 h, 过滤合并滤液倒入圆底烧瓶, 置
于45 ℃恒温水浴锅, 旋转蒸发仪旋转浓缩, 浓缩液
最终用甲醇定容至 4 mL。取待测样品 1 mL, 通
过 0.22 μm水系滤膜于离心管中待用。
色谱柱: C18 (150 mm×4.6 mm, 10 μm); 流动相:
乙腈:水 =70:30; 流速: 0.8 mL·min-1; 柱温: 30 ℃; 检
测波长: 245 nm; 进样量: 20 μL; 检测灵敏度: 0.02
AUFS。
用移液枪准确移取5 mL甲醇(色谱纯)于5 mg
的萝卜硫素标准品中, 配制成浓度为1.0 mg·mL-1的
标准溶液, 逐级稀释成浓度分别为 5 00、2 50、
125、62.5 μg·mL-1的标准溶液。浓度由低至高依
次进样, 分别进样 3次, 每次 20 μL, 在上述色谱条
件下分析, 以萝卜硫素测定的峰面积(Y)为纵坐标,
萝卜硫素浓度(μg·mL-1)为横坐标(X)进行线性回归,
得到回归方程 Y=7.0507X+210.15, R2=0.9948。
所有数据均采用 SPSS 13.0 for Windows软件
进行分析。
实验结果
1 LED不同光质对萝卜下胚轴愈伤组织诱导的影响
由表1可见, LED不同光质对萝卜下胚轴愈伤
组织诱导影响显著(P<0.05)。下胚轴在接种后第 4
天开始两端膨大, 1周后整体膨大, 10 d后黄光和
白光下的下胚轴出现少量的颗粒状愈伤组织, 12 d
后红光、蓝光、绿光和蓝红光下的下胚轴也有少
量的愈伤组织产生, 15 d后愈伤组织开始大量出
现。诱导效果从高到低依次为黄光>红光>蓝红
光>白光>蓝光>绿光。
2 LED不同光质对萝卜子叶愈伤组织诱导的影响
LED不同光质对萝卜子叶愈伤组织的诱导影
响如表 2。子叶在接种后第 2天就有少部分启动,
3~5 d时子叶边缘开始卷翘膨大, 第 10天时白光和
黄光下的子叶边缘伤口处出现愈伤组织, 红光、蓝
光、绿光和蓝红光下的子叶在 2 d后也有少量的
愈伤组织出现, 15 d后 60%的子叶产生愈伤。
表 1 LED不同光质对萝卜下胚轴愈伤组织诱导的影响
Table 1 The effect of different LED light qualities on callus induction of radish hypocotyls
LED光质 出愈时间 /d 出愈率 /% 长势 愈伤组织形态 标准差
白光 1 0 35.00 +++ 深绿, 瘤状 c
红光 1 2 50.00 +++++ 浅绿, 颗粒状 a, b
黄光 1 0 80.00 ++++ 黄绿, 颗粒状 a
蓝光 1 2 31.25 ++ 淡绿, 细小颗粒状 c, d
绿光 1 2 6.25 + 淡绿, 细小颗粒状 d
蓝红光 1 2 45.00 +++ 浅绿, 细小颗粒状 b
　　表中 “+”表示在萝卜愈伤组织诱导过程中的长势情况。+++++表示 5级, 长势最好; ++++表示 4级; +++表示 3级; ++表示 2级; +
表示 1 级, 长势最差。表 2 同此。小写字母均表示差异显著性(P< 0.05 ) , 表 2、图 1 ~4 同此。
植物生理学通讯 第 46卷 第 4期, 2010年 4月 349
3 LED不同光质对萝卜愈伤组织增殖的影响
LED不同光质处理愈伤组织的生长积累差异
显著(P<0.05)。接种后的 1~10 d愈伤组织的外表
无明显变化, 增重较平稳, 细胞处于适应阶段。接
种 10 d后, 愈伤组织急剧分裂, 鲜重剧增, 体积明显
增大。15 d后愈伤组织分裂速度逐渐下降, 增重
又趋于平稳。20~30 d, 蓝红光下部分愈伤组织出
现褐化, 白光、红光和蓝光下愈伤组织也先后开始
褐化, 生长趋于停滞状态。绿光和黄光照射下愈伤
组织呈乳白色水浸状且结构紧密, 30 d内未出现褐
化现象。红光下愈伤组织生长量(鲜重)最高, 增殖
倍数达15.7, 愈伤组织呈淡绿色瘤状, 表面湿润, 是实
验中效应最强的光质, 而黄光对愈伤组织生长效应则
最低, 说明红光能促进萝卜愈伤组织的增殖(图 1)。
和绿光下(91%)的含水量更低, 而黄光下萝卜愈伤
组织的含水量最低仅为 90%。
表 2 LED不同光质对萝卜子叶愈伤组织诱导的影响
Table 2 The effect of different LED light qualities on callus induction of radish cotyledons
LED光质 出愈时间 /d 出愈率 /% 长势 愈伤组织形态 标准差
白光 1 0 50.00 +++ 深绿, 瘤状 e
红光 1 1 78.60 ++++ 浅绿, 颗粒状, 水分较少 b
黄光 1 0 75.00 ++++ 黄绿, 颗粒状, 表面湿润 c
蓝光 1 1 85.00 ++++ 淡绿, 细小颗粒状 a
绿光 1 1 53.60 ++ 淡绿, 细小颗粒状 d
蓝红光 1 1 41.70 +++ 浅绿, 细小颗粒状 f
图 1 LED不同光质对萝卜愈伤组织增殖的影响
Fig.1 The effect of different LED light qualities
on callus proliferation of radish
4 LED不同光质对萝卜愈伤组织含水量的影响
LED不同光质对愈伤组织含水量的影响如图2
所示。红光下萝卜愈伤组织的含水量最高达 95%,
蓝红光(94.3%)次之, 白光下(93%)、蓝光下(93%)
图 2 LED不同光质对萝卜愈伤组织含水量的影响
Fig.2 The effect of different LED light qualities
on callus water content of radish
5 LED不同光质对萝卜愈伤组织中萝卜硫素含量
和产量的影响
由图3可见, 不同光质下生长的萝卜愈伤组织
中萝卜硫素含量不同。红光条件下的愈伤组织中
萝卜硫素的含量最高, 达 3.17 mg·g-1 (DW), 蓝红光
图 3 LED不同光质对萝卜愈伤组织萝卜硫素含量的影响
Fig.3 The effect of different LED light qualities on
sulforaphane content of radish
植物生理学通讯 第 46卷 第 4期, 2010年 4月350
下[1.24 mg·g-1 (DW)]次之, 蓝光下[1.02 mg·g-1 (DW)]
和白光下[0.71 mg·g-1 (DW)]的含量更低, 而绿光下
和黄光下的含量仅为红光的0.8%和0.65%, 表明绿
光和黄光不利于萝卜硫素的合成。
在几种不同光质中, 红光下萝卜硫素的产量明
显高于其他光质, 为 1.94 mg·瓶 -1, 说明红光能显
著促进萝卜硫素的积累; 其次是蓝红光(0.54 mg·瓶-1)
和蓝光(0.50 mg·瓶-1); 而绿光和黄光下的产量仅为
红光下的 0.65%和 0.52% (图 4)。
阎秀峰等(2003)在研究光质对高山红景天生物
量和红景天甙含量的影响中发现, 红光有利于红景
天甙的合成。张真等(2008)在葡萄愈伤组织的培
养中发现绿光下白藜芦醇产量最低。本实验中
LED不同光质处理下, LED红光能明显提高萝卜细
胞中萝卜硫素含量和产量, LED黄光和绿光最不利
于萝卜硫素的合成。这一结果与上述研究结论一
致, 但与赵德修等(1999)报道蓝光对水母雪莲愈伤
组织中黄酮合成的促进作用最强, 而红光条件下黄
酮含量最低的结果不同。
不同光质对愈伤组织生长及次生代谢产物合
成的影响, 由于研究者使用的光源和外植体材料不
同、培养基的组分各异, 研究的结果也不尽相同,
说明离体条件下, 光质调控植物光形态建成的复杂
性, 有待于我们进一步的研究。
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图 4 LED不同光质对萝卜愈伤组织萝卜硫素产量的影响
Fig.4 The effect of different LED light qualities on
sulforaphane production of radish
讨　　论
不同波长光作为一种物理因子已广泛应用于
植物组织培养过程中的形态发生、生长控制、光
形态建成及其各种反应机制的研究。不同光质对
植物愈伤组织、器官及原生质体培养过程中的生
长、分化、代谢与基因表达等也有一定程度的影
响(崔堂兵等 2001)。本实验中, 2种萝卜外植体(子
叶和下胚轴)在 LED不同的光质下被诱导, 子叶的
脱分化率均高于下胚轴, 这与龙雯虹等(2006a)的研
究一致。LED不同光质处理中, LED黄光有利于
下胚轴和子叶的脱分化, 而LED绿光对愈伤组织的
诱导有一定的抑制作用, LED蓝红光对愈伤组织的
诱导效应不及单色光。周吉源等(1992)发现采用
一定强度的单色光处理, 可以缩短外植体的启动时
间, 促进愈伤组织增殖。石岭等(1999)以河套蜜瓜
幼苗的叶片、子叶、茎段、茎尖为培养材料, 在
红光、蓝光、红蓝混合光和普通白光的光照条件
下进行培养, 红蓝混合光对于子叶和叶片愈伤组织
的形成明显不如单色光, 其形成率只有 13.33%, 而
且发育不良, 这与本文的研究结果一致。