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不同基因型和发育阶段对费约果叶片生物活性物质含量及抗氧化能力的影响



全 文 :植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (2): 259~265  doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0583 259
收稿 2014-12-22  修定 2015-01-26
资助 四川农业大学“双支计划”项目(06370501)、四川农业大学
优硕培育基金(04310754)和四川农业大学大学生创新性实
验计划(04060527)。
* 通讯作者(E-mail: luoya945@163.com; Tel: 0835-2882293)。
不同基因型和发育阶段对费约果叶片生物活性物质含量及抗氧化能力的
影响
罗娅*, 曹会娟, 邱静, 李雁翎, 田钰, 冉谢然夫, 凌亚杰
四川农业大学园艺学院, 四川雅安625014
摘要: 以‘胜利’、‘唯一’、‘毛象’和‘库立激’ 4个费约果品种叶片为试材, 探讨基因型和发育阶段对费约果叶片总酚、总黄
酮、原花青素、鞣花单宁含量和抗氧化能力的影响, 以期深入了解费约果叶片的生物活性物质组成, 为其深度开发提供理
论依据。结果表明: 费约果叶片富含酚类物质[8.27~18.81 g·(100 g)-1 (FW)], 特别是原花青素[0.43~3.32 g·(100 g)-1 (FW)]和
鞣花单宁[0.55~0.79 g·(100 g)-1 (FW)]。基因型显著影响叶片的总酚和原花青素含量, 而发育阶段则显著影响叶片的总酚、
总黄酮、原花青素、鞣花单宁含量和抗氧化能力, 尤以幼叶阶段(20%叶片)各生物活性物质含量和抗氧化能力最高。结果
表明, 费约果果树修剪时产生的叶片可搜集用于天然抗氧化剂或保健品的开发。
关键词: 费约果叶片; 基因型; 成熟阶段; 生物活性物质; 抗氧化能力
Influences of Different Genotypes and Ripening Stages on the Bioactive Com-
pounds and Antioxidant Activity of Feijoa Leaf
LUO Ya*, CAO Hui-Juan, QIU Jing, LI Yan-Ling, TIAN Yu, RANXIE Ran-Fu, LING Ya-Jie
College of Horticulture, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China
Abstract: With the aim of better understanding the composition of bioactive compounds and providing the the-
oretical background for application and utilization of feijoa leaf further, the effect of genotypes (‘Triumph’,
‘Unique’, ‘Mammoth’ and ‘Coolidge’) and ripening stages on total phenolics, total flavonoids, proanthocyani-
dins and ellagitannins contents, and antioxidant activity of fejioa leaf were investigated. The results showed that
feijoa leaf contained abundant phenolic substance [8.27–18.81 g·(100 g)-1 (FW)], especially in proanthocyani-
dins [0.43–3.32 g·(100 g)-1 (FW)] and ellagitannins [0.55–0.79 g·(100 g)-1 (FW)]. Total phenols and proantho-
cyanidins contents were influenced markedly by genotypes, total phenols, total flavonoids, proanthocyanidins,
ellagitannins contents and antioxidant activity were influenced significantly by ripening stages. The leaf which
is 20% size of matured leaf had the highest bioactive compounds and antioxidant activity. These results sug-
gested that feijoa leaf extracts had potential value of development and utilization in natural antioxidant and
health industries.
Key words: feijoa leaf; genotype; ripening stage; bioactive compound; antioxidant activity
费约果(Feijoa sellowiana)是桃金娘科多年生
亚热带常绿灌木果树, 原产南美东北部和东部地
区, 目前在整个地中海地区均有种植(Ruberto和
Tringali 2004)。费约果果实富含维生素C、矿物
质、膳食纤维、芳香类以及多酚类物质, 同时也
含有一般植物少有的水溶性碘化合物和原花青素
(Binder和Flath 1989; Lintas和Cappelloni 1992; Ru-
berto和Tringali 2004), 其果实提取物在抗菌和抗氧
化上具有潜在应用价值(Basile等1997; Vuotto等
2000)。近期, Beyhan等(2010)研究表明, 费约果叶
片提取物抗氧化能力高于果实, 其原因可能是多
酚类物质含量的差异所致。
20世纪以来, 我国一些科研单位相继从国外
引进大量优质的费约果资源, 并对其进行引种、
繁育和生物学特性观察等方面的研究 (王丹等
2007; 向盛萍等2009; 张猛等2009a, b, c), 然而关于
费约果生物活性物质的研究却极其有限(El-Shen-
awy等2008; Beyhan等2010; 陈明等2012)。本课题
组前期研究结果表明费约果果实富含生物活性物
植物生理学报260
质, 而叶片提取物生物活性物质含量和抗氧化能
力均高于果实(数据未发表)。基因型和发育阶段
是影响植物生物活性物质含量和抗氧化能力的两
个重要因素, 因此本研究拟在前期研究基础上, 进
一步深入探讨基因型和发育阶段对费约果叶片主
要生物活性物质(总酚、总黄酮、原花青素和鞣花
单宁)含量和抗氧化能力的影响, 以期为费约果叶
片的开发利用奠定理论基础。
材料与方法
1 实验材料
费约果(Feijoa sellowiana Berg)叶片采自四川
农业大学雅安校区实验基地。品种为‘胜利’ (‘Tri-
umph’)、‘唯一’ (‘Unique’)、‘毛象’ (‘Mammoth’)和
‘库立激’ (‘Coolidge’)。首次采摘时间为2013年4月
5日, 在树体东南西北各方向选取3~5个生长健壮
的一年生枝条分别进行挂牌和取样, 嫩叶取自枝
条顶部, 叶片大小为成熟叶叶面积的20%, 之后每
隔一定时间从枝条中下部采摘成熟叶叶面积
40%、90%和100%大小的各阶段叶片作为试验材
料。每个阶段采摘叶片量约250 g, 重复3份。采后
立即运回实验室, 用液氮处理后放于–20 ℃冰箱中
备用。
2 试验方法
2.1 费约果叶片生物活性物质的提取
取5.0 g样品置于室温75 mL 80%丙酮(V/V)溶
液中抽提1 h后, 4 500×g冷冻离心10 min, 收集上清
液用于总酚、总黄酮、铁离子还原能力(ferric
reducing antioxidant power, FRAP)和ABTS•+自由基
[2,2’-azinobis-(3-ethylbenzonthiazoline-6-sulfonic
acid), 2,2’-连氮-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]清除
能力的测定。
2.2 总酚的测定
参照Molan等(2009)的方法进行测定。在96孔酶
标板中分别加入12.5 μL上清液, 250 μL 2% Na2CO3,
室温反应5 min后, 加入12.5 μL 50%福林酚, 室温反
应30 min。用ELX 808酶标仪测定650 nm处吸光
度, 计算总酚含量, 以g·(100 g)-1 (FW)的没食子酸
为单位。
2.3 总黄酮的测定
参照Chang等(2001)的方法进行测定。在96孔
酶标板中分别加入30 μL上清液, 90 μL 95%乙醇, 6
μL 10% AlCl3, 6 μL 1 mol·L
-1醋酸钾和68 μL去离子
水后, 室温反应40 min。用ELX 808酶标仪测定415
nm处的吸光度, 计算总黄酮含量, 以g·(100 g)-1
(FW)的槲皮素为单位。
2.4 原花青素的测定
参照Buendia等(2010)的方法进行费约果叶片
原花青素的HPLC测定。称取0.6 g费约果叶片置
于9 mL 80%丙酮(V/V)中于室温下提取1 h后 ,
4 500×g冷冻离心10 min, 收集上清液, 于40 ℃旋转
蒸发去除丙酮后, 加入6 mL水和10 mL氯仿, 震荡
后, 弃去下层氯仿, 重复3次, 再加入10 mL正己烷,
收集下层液体于试管中, 量取4 mL收集液, 在45 ℃
减压蒸干, 加入4 mL甲醇, 经0.20 μm的微孔滤膜过
滤后, 作为测试样品溶液。
色谱条件: 色谱柱为Phenomenex Luna C18柱,
150 mm×4.6 mm, 5 μm。DAD检测器, 检测波长
280 nm, 流速1.0 mL·min-1, 柱温37 ℃。流动相, A,
乙腈:乙酸(98:2, V/V); B, 甲醇:水:乙酸(95:3:2, V/V/
V)。进样量20 μL, 35 min后梯度洗脱程序变为0%
B到40% B, 等梯度洗脱在35~45 min之间。原花青
素的测定以原花青素B2为标品, 其色谱图见图1。
2.5 鞣花单宁的测定
参照Koponen等(2007)的方法进行费约果叶
片鞣花单宁的HPLC测定。称取费约果叶片0.1 g
置于3 mL 80%丙酮(V/V)中于室温下提取1 h后, 4
500×g冷冻离心10 min, 收集上清液, 于40 ℃旋转
蒸发去除丙酮后, 加入5 mL甲醇和5 mL 8 mol·L-1
的盐酸, 于95 ℃回流5 h, 将溶液定容至10 mL, 经
0.20 μm的微孔滤膜过滤后, 作为测试样品溶液。
图1 原花青素B2标准品的HPLC色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of proanthocyanidins B2
罗娅等: 不同基因型和发育阶段对费约果叶片生物活性物质含量及抗氧化能力的影响 261
色谱条件: 色谱柱为Phenomenex Luna C18柱,
150 mm×4.6 mm, 5 μm。DAD检测器, 检测波长
360 nm, 流速1.0 mL·min-1, 柱温30 ℃。流动相, A,
1%甲酸; B相, 乙腈:甲醇(85:15, V/V)。进样量10
μL, 梯度洗脱程序: 0~20 min (5% B~30% B); 20~30
min (30% B~90% B), 之后等梯度洗脱5 min。以鞣
花酸为标品, 其色谱图见图2。
实验结果
1 4个费约果品种叶片不同发育阶段总酚含量变化
基因型和发育阶段均显著影响费约果叶片总
酚含量(图3)。在4个费约果品种的幼叶阶段(20%),
‘胜利’的总酚含量最高[18.81 g·(100 g)-1 (FW)], 其
次是‘‘毛象’ [17.72 g·(100 g)-1 (FW)]、‘库立激’
[16.76 g·(100 g)-1 (FW)]和‘唯一’ [16.58 g·(100 g)-1
(FW)]; 在40%发育阶段, ‘毛象’总酚含量最少; 在
90%发育阶段, ‘唯一’总酚含量最少; 在叶片成熟
阶段(100%), ‘胜利’、‘毛象’和‘库立激’叶片总酚含
量高于‘唯一’。在叶片发育过程中, 各品种均表现
出在幼叶阶段(20%)总酚含量最高的特点, 而在后
续的3个发育阶段中, 总酚含量显著低于幼叶阶段,
其值在8.55~10.14 g·(100 g)-1 (FW)之间。
2.6 FRAP的测定
参照Benzie和Strain (1996)的方法, 略作修
改。在96孔酶标板中分别加入8.5 μL上清液, 275
μL 2,4,6-三吡啶基三嗪[2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-tri-
azine, TPTZ]工作液(由0.3 mol·L-1醋酸盐缓冲液25
mL, 10 mmol·L-1 TPTZ溶液2.5 mL, 20 mmol·L-1
FeCl3溶液2.5 mL组成), 然后放于37 ℃的温箱中黑
暗反应30 min。用ELX 808酶标仪测定595 nm处
的吸光度, 计算FRAP值, 以g·(100 g)-1 (FW)的
FeSO4·7H2O为单位。
2.7 ABTS•+自由基清除能力的测定
参考Re等(1999)的方法, 略作修改。在96孔酶
标板中分别加入6 μL上清液, 320 μL ABTS•+工作
液, 震荡30 s, 静置12 min, 用ELX 808酶标仪测定
734 nm处的吸光度A样品, 并依据下列公式计算
ABTS•+清除率。
ABTS•+清除率(%)=[1–(A样品–A0)/A1]×100
式中, A0为样品本身的吸光度, 以蒸馏水代替
显色剂; A1为ABTS溶液的吸光度值。
3 数据处理与分析
试验数据使用Minitab 15.0软件进行ANOVA
统计分析。数据结果以平均数±标准差表示, 并进
行邓肯氏新复极差多重比较分析(P≤0.05), 试验
重复3次。
2 4个费约果品种叶片不同发育阶段总黄酮含量变化
发育阶段显著影响4个费约果品种叶片总黄酮
的含量, 而基因型的影响却表现不明显(图4)。随着
叶片的发育, 4个品种叶片总黄酮含量呈逐渐下降
的趋势, 以幼叶阶段(20%)总黄酮含量最高, 其值在
0.92~0.96 g·(100 g)-1 (FW)之间; 在40%叶片发育阶
段, 其含量在0.72~0.78 g·(100 g)-1 (FW)之间; 在
90%~100%叶片发育阶段, 各品种间叶片总黄酮含
量无明显差异, 其含量在0.52~0.54 g·(100 g)-1 (FW)
之间。
3 4个费约果品种叶片不同发育阶段原花青素含量
变化
基因型和发育阶段显著影响4个费约果品种
图2 鞣花酸标准品的HPLC图谱
Fig.2 HPLC chromatogram of ellagic acid
图3 不同基因型和发育阶段对费约果叶片总酚含量的影响
Fig.3 Influences of different genotypes and ripening stages on
the total phenolics content of feijoa leaf
各柱形上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同此。
植物生理学报262
叶片原花青素含量(图5)。随着叶片的发育, 其原
花青素含量逐渐降低, 成熟阶段(100%)叶片原花
青素含量最低, 该阶段叶片原花青素含量约是幼
叶阶段(20%)的13%~24%。在4个品种中, 以‘胜利’
含有较高含量的原花青素, 特别是在20%、40%和
90%叶片发育阶段, 其含量明显高于其他3个费约
果品种, 而在成熟阶段(100%), ‘胜利’原花青素含
量[0.68 g·(100 g)-1 (FW)]与‘唯一’ [0.78 g·(100 g)-1
(FW)]和‘毛象’ [0.80 g·(100 g)-1 (FW)]无显著性差
异, 但高于‘库立激’ [0.43 g·(100 g)-1 (FW)]。
叶片发育阶段[0.59~0.64 g·(100 g)-1 (FW)], 而100%
叶片发育阶段 , 鞣花单宁含量最低 [0 .55~0.56
g·(100 g)-1 (FW)]。
5 4个费约果品种叶片不同发育阶段FRAP值的变化
叶片发育阶段显著影响4个费约果品种叶片
的FRAP值; 除90%发育阶段, 其余3个阶段基因型
对FRAP值的影响不明显(图7)。随着叶片的发育,
FRAP值呈现先下降后上升的变化趋势, 在幼叶阶
段(20%), 费约果叶片的FRAP值最高[41.26~44.8
g·(100 g)-1 (FW)], 其次是40%叶片发育阶段[30.98~
33.82 g·(100 g)-1 (FW)], 90%~100%发育阶段的FRAP
值在22.06~27.15 g·(100 g)-1 (FW)之间, 是20%叶片
发育阶段FRAP值的53%~61%。
4 4个费约果品种叶片不同发育阶段鞣花单宁含量
变化
发育阶段显著影响费约果叶片鞣花单宁的含
量, 基因型的影响表现不明显(图6)。随着叶片的
发育, 鞣花单宁的含量呈现先降后升再降的波动
式变化, 鞣花单宁分别在20%和90%叶片发育阶段
含量较高[0.75~0.79 g·(100 g)-1 (FW)], 其次是40%
6 4个费约果品种叶片不同发育阶段ABTS•+抑制
率的变化
叶片发育阶段显著影响4个费约果品种叶片
的ABTS•+抑制率, 然而基因型的影响较小(图8)。
图4 不同基因型和发育阶段对费约果叶片总黄酮含量的影响
Fig.4 Influences of different genotypes and ripening stages on
the total flavonoids content of feijoa leaf
图5 不同基因型和发育阶段对费约果叶片原花青素含量的
影响
Fig.5 Influences of different genotypes and ripening stages on
the proanthocyanidins content of feijoa leaf
图6 不同基因型和发育阶段对费约果叶片鞣花单宁含量的
影响
Fig.6 Influences of different genotypes and ripening stages on
the ellagitannins content of feijoa leaf
图7 不同基因型和发育阶段对费约果叶片FRAP值的影响
Fig.7 Influences of different genotypes and ripening stages on
the FRAP value of feijoa leaf
罗娅等: 不同基因型和发育阶段对费约果叶片生物活性物质含量及抗氧化能力的影响 263
讨  论
天然抗氧化物质的利用可作为合成抗氧化剂
的替代品(Gharibi等2013; Suppakul等2006)。由于
天然抗氧化物质能抑制细胞内氧化反应的发生,
减轻自由基对脂、脂蛋白和DNA的氧化损伤, 也
可用于保健品的开发以减轻机体的氧化损伤, 从
而预防癌症、心脏病以及中风等慢性疾病的发生
(Bazylko等2013; Wong等2006)。然而上述产品开
发的前提均需要寻找具有高生物活性物质含量和
强抗氧化能力的材料。
本研究是在前期研究基础上, 进一步探讨基
因型和成熟阶段对费约果叶片生物活性物质含量
和抗氧化能力的影响。研究表明, 基因型显著影
响费约果叶片总酚和原花青素的含量, 而成熟阶
段则显著影响总酚、总黄酮、原花青素、鞣花单
宁含量和抗氧化能力。在4个费约果品种中, 均以
幼叶阶段(20%)含有较高含量的总酚、总黄酮、
原花青素和鞣花单宁, 同时具有较强的抗氧化能
力。这种在植物幼嫩阶段具有更高含量的总酚和
抗氧化能力的特征在红薯叶片(Padda和Picha
2007)、石榴叶片(Zhang等2010)、柑橘种子(Mou-
lehi等2012)以及草莓(罗娅和汤浩茹2011)和大枣果
实(Zozio等2014)中均有体现。然而值得一提的是,
陈明等(2012)研究认为, 费约果嫩叶的总酚含量和
抗氧化能力高于成熟叶片, 而类黄酮含量却低于
成熟叶片, 这与本研究的结果略有不同。
费约果叶片是一种富含总酚[8.27~18.81 g·(100 g)-1
(FW)]、原花青素[0.43~3.32 g·(100 g)-1 (FW)]和鞣
花单宁[0.55~0.79 g·(100 g)-1 (FW)]的植物材料。从现
有文献分析, 石榴叶片[9.45~13.19 g·(100 g)-1 (DW)]
酚类物质含量较高(Mekni等2013), 若以鲜重为单位
随着费约果叶片的成熟, 叶片提取液ABTS•+的清
除率呈现下降趋势。在4个发育阶段中, 20%发育
阶段叶片提取液清除ABTS•+的能力最强(90.57%~
91.79%), 是40%叶片发育阶段的1.18~1.21倍, 是
90%和100%叶片发育阶段的1.43~1.44倍。
7 费约果叶片生物活性物质与抗氧化能力的相关
性分析
如表1所示, 总酚分别与总黄酮(r=0.892)和原
花青素(r=0.907)呈极显著正相关 , 与鞣花单宁
(r=0.598)呈显著正相关(表1), 由此说明黄酮类化
合物与原花青素是费约果叶片酚类物质的主要组
成物质, 其次是鞣花单宁。此外, 总酚、总黄酮和
原花青素均与FRAP和ABTS•+呈极显著正相关, 而
鞣花单宁与其不相关, 说明总酚、总黄酮和原花
青素在费约果叶片抗氧化能力方面发挥着重要作
用, 而鞣花单宁与之相比则作用较小。从表1还可
看出, FRAP与ABTS•+呈极显著正相关(r=0.983),
说明两种方法用于分析费约果叶片的抗氧化能力
是可行的。
表1 生物活性物质与抗氧化能力的相关性分析
Table 1 Correlation analysis between bioactive compounds and antioxidant activity
项目 总酚 总黄酮 原花青素 鞣花单宁 FRAP ABTS•+
总酚 1
总黄酮 0.892** 1
原花青素 0.907** 0.987** 1
鞣花单宁 0.598* 0.522* 0.548* 1
FRAP 0.919** 0.971** 0.973** 0.405 1
ABTS•+ 0.894** 0.988** 0.983** 0.441 0.983** 1
  *: P<0.05; **: P<0.01。
图8 不同基因型和发育阶段对费约果叶片ABTS•+抑制率
的影响
Fig.8 Influences of different genotypes and ripening stages on
the ABTS•+ inhibition rate of feijoa leaf
植物生理学报264
将其换算, 费约果叶片总酚含量应高于或与之相
当。此外, 总酚含量较高的水果有草莓[0.18~0.32
g·(100 g)-1 (FW)]、蓝莓[0.077~0.82 g·(100 g)-1 (FW)]
和黑莓[0.17~0.31 g·(100 g)-1 (FW)] (Wang等1996;
Heinonen等1998; Chun等2005; Scalzo等2005;
Capocasa等2008; Vasco等2008), 由此说明费约果叶
片的总酚含量远高于上述水果。费约果各品种叶
片原花青素含量在0.43~3.3 g·(100 g)-1 (FW)之间,
远高于葡萄[0.16 g·(100 g)-1 (FW)], 而与扁豆[0.32~
1.04 g·(100 g)-1 (FW)]和可可豆[0.26~1.2 g·(100 g)-1
(FW)]相当, 部分品种大大高于扁豆和可可豆(唐传
核2005)。
鞣花单宁是一种多酚类物质, 主要存在于橡
木、核桃、杏、石榴种子、黑莓、云莓、树莓和
草莓中(Landete 2011), 因其具有预防癌症的作用
近年来受到研究者的关注。鞣花单宁的定量分析
是根据鞣花单宁遇酸或碱会水解形成不溶于水的
鞣花酸, 进而以鞣花酸作为标准品来计算鞣花单
宁的含量(da Silva Pinto等2008)。本研究首次对费
约果叶片的鞣花单宁进行了定量分析, 研究表明,
4个费约果品种不同发育阶段叶片的鞣花单宁含
量在0.55~0.79 g·(100 g)-1 (FW)之间, 而富含鞣花单
宁的云莓、树莓和草莓的鞣花单宁含量分别为
0.32~1.42、0.15~1.8和0.17~0.52 g·(100 g)-1 (FW)
(Häkkinen等2000; Landete 2011; da Silva Pinto等
2008), 说明费约果叶片也是一种获取鞣花单宁的
良好材料。
植物材料抗氧化能力的强弱由植物抗氧化物
质的组成及其含量所决定。在进行4个费约果品
种不同发育阶段叶片的抗氧化能力测定时, 本研
究采用了FRAP法和ABTS•+自由基清除能力两种
方法。研究表明, 两种方法抗氧化能力的测定结
果具有一致性, 且两种方法之间以及与总酚、总
黄酮和原花青素呈极显著相关, 说明两种方法均
可用于费约果叶片抗氧化能力的测定。总酚、总
黄酮和原花青素是费约果叶片抗氧化能力的主要
组成物质。
综上所述, 费约果叶片是一种富含总酚、原花
青素和鞣花单宁的植物材料。基因型和成熟阶段
均显著影响费约果多酚类物质含量和抗氧化能力,
尤以叶片发育阶段的影响最为明显。在4个费约果
品种中, 均以幼叶(20%)含有最高的总酚、总黄
酮、原花青素、鞣花单宁和抗氧化能力, 且此阶段
的‘胜利’品种含有最高含量的总酚和原花青素。因
此, 可考虑在果树修剪时搜集费约果的叶片用于食
品和保健行业进行天然抗氧化物质的开发。
参考文献
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