全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (4): 413~423　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0570 413
收稿 2014-12-15　　修定 2015-03-09
资助 国家“973”计划前期研究专项(2012CB722204)、国家自然
科学基金(31160186)和自治区高校科研计划项目(XJED-
U2011I02)。
* 通讯作者(E-mail: zeng_ylxju@126.com; Tel: 0991-8582076)。
植物miRNA的研究方法概述
易小娅, 杨瑞瑞, 曾幼玲*
新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室, 乌鲁木齐830046
摘要: microRNA (miRNA)是动植物中广泛存在的内源性非编码小RNA分子, 通过与靶基因mRNA的特定位点结合, 在转录
后水平负调控靶标基因的表达。植物miRNA几乎调控所有的生物学和代谢过程, 包括生长发育、细胞维持和分化、信号
转导以及对逆境胁迫的响应。随着第二代深度测序技术和生物信息学的快速发展, miRNA的相关研究已从模式植物扩展
到非模式植物, 发现了大量新的miRNA, 并确定了小部分miRNA的生物学功能。由于miRNA序列短小, 与靶标基因作用的
不确定以及调控网络的复杂性, 研究难度较大。本文从研究方法的角度对miRNA的鉴定、靶基因的验证和miRNA功能研
究等方面所涉及的方法进行总结, 试图为植物miRNA的研究提供一些思路和启发。
关键词: 植物miRNA; 靶基因; 研究方法
Overview of Research Methods for Plant miRNAs
YI Xiao-Ya, YANG Rui-Rui, ZENG You-Ling*
Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang
University, Urumqi 830046, China
Abstract: MicroRNAs (miRNAs) are an extensive class of small non-protein-coding endogenous RNA in ani-
mals and plants, which negatively regulate gene expression at the post-transcription levels by degrading mRNA
or repressing mRNA translation, depending on the complementarities between a miRNA and its targeted mR-
NAs. Plant miRNAs play an important role in almost all biological and metabolic processes, including growth
and development, cell maintenance and differentiation, signal transduction and response to environmental
stresses. With the rapid development of next generation deep sequencing and advanced bioinformatics, the
miRNA-related study has been expanded to non-model plant species. A number of miRNAs have been identi-
fied and the biological functions of a part miRNAs have also been confirmed in the past years. Nevertheless, we
know it is difficult to study on miRNAs because of their short sequences, the uncertain interaction with target
genes and the complex of the regulatory network. This paper reviews the research methods for plant miRNAs
including miRNA identification, target validation and functional study as well. It is very significant to provide
some ideas and inspiration for scientific researchers engaging in plant small RNAs.
Key words: plant miRNAs; target genes; research method
microRNA (miRNA)是一类大小约21~24 nt,
在转录后水平调控基因表达的内源性RNA分子,
一般来源于染色体的非编码区域, 成熟的miRNA
由一段具有颈环二级结构的单链RNA经过剪切而
成, 在物种之间相对保守, 在表达上具有明显的组
织和时间特异性(Bartel 2004; Jones-Rhoades和Bar-
tel 2004)。在植物的生长发育及各种生物和非生
物胁迫反应过程中, miRNA发挥着重要作用, 参与
叶形态和花器官的发育(Liu等2011; Kim等2005)及
盐、干旱、水分和病原菌等胁迫(Jia等2009; Kan-
tar等2010; Pradhan等2015; Ren等2012)。Zhou等
(2013)将水稻(Oryza sativa) miR319转入匍匐翦股
颖(Agrostis stolonifera)中, 导致植株叶片蜡质含量
增加、保水性提高、Na+的摄取减少、转基因植
株的耐旱和耐盐性明显增强。Hewezi等(2012)将
拟南芥(Arabidopsis thaliana) miR396过表达后, 发
现转基因植株中miR396大量表达, 根细胞重新编
程, 合胞体的大小减小, 线虫发育畸形, 植物具备
了对线虫的抗性, 这种调控方式为提高植物抗寄
生虫的危害开辟了新途径。
近年来, 随着更多的miRNA被发现以及它们
植物生理学报414
的靶基因和生物学功能的鉴定, miRNA介导的基
因表达调控已经成为新的研究热点。在对miRNA
的研究中, 鉴定组织细胞内miRNA的种类是认识
miRNA的首要问题。随着第二代深度测序技术的
普及, 从最初的直接克隆到生物信息学的介入, 保
守及新的miRNA的寻找与克隆的问题得到了极大
的改善(Zhang和Wang 2015)。鉴定miRNA的靶基
因是目前认识miRNA生物学功能的重点与难点,
计算机辅助预测和试验验证是最常用的研究技术;
随着越来越多的miRNA被鉴定和获得, miRNA生
物学功能的研究迫在眉睫, 许多miRNA的功能是
从过表达miRNA的转基因植株或者同义突变
miRNA靶基因功能突变体中确定的(Zhou等2013;
Song等2013); 此外, 人工miRNA (artificial miRNA,
amiRNA)技术作为一种高特异性、高通量的沉默
技术也得到了较好的应用(de la Luz Gutierrez-Na-
va等2008)。
如何寻找新的miRNA, 验证miRNA与靶基因
的靶向关系以及miRNA生物学功能的研究都是众
多科研工作者关注的热点, 而如何将这些部分联
系起来, 组建一套较为清晰全面的研究思路还有
待探讨。基于此 , 我们将从miRNA的寻找与鉴
定、靶基因的验证及生物学功能研究3个方面介
绍植物miRNA的研究方法。
1 植物miRNA的获取方法
1.1 直接克隆
由于miRNA在细胞中大量存在, 分子克隆可
以直接指向miRNA。一般采用TRIzol等试剂从植
物组织中获取总RNA, 经变性聚丙烯酰胺凝胶电
泳回收15~26 nt的小RNA分子, 或采用植物miRNA
分离纯化试剂盒, 对小RNA进行富集, 通过5和3
加接头反转录产生小RNA的cDNA文库, 经PCR反
应后将扩增产物构建上克隆载体并对其测序。将
测序结果与该物种已知基因组、转录组等数据库
信息BLAST (basic local alignment search tool), 排
除编码基因和核糖体RNA ( r ibosomal RNA,
rRNA), 转移RNA (transfer RNA, tRNA)以及核小
RNA (small nuclear RNA)等非miRNA序列, 通过
Northern blot等方法最终确认miRNA。Sunkar和
Zhu (2004)为了鉴定受非生物胁迫诱导的未知
miRNA, 对拟南芥进行干旱、盐、冷的胁迫或
ABA的施加, 将各个处理下的拟南芥分别构建小
RNA文库, 进行测序及分析, 鉴定了26个新的miR-
NA, 组成15个新的miRNA家族, 并对这些克隆获
得的新miRNA通过Northern blot对野生型和突变
株拟南芥进行了表达分析, 发现miRNA可能与植
物抵抗非生物胁迫密切相关。用同样的方法, He
等(2008)从芸薹(Brassica rapa)中克隆了9个保守的
miRNA家族和3个潜在的未知miRNA, 通过表达分
析, 发现有些保守的芸薹miRNA与拟南芥具有不
同的组织表达特性。
1.2 生物信息学
由于真核生物组织中有些miRNA的丰度较
低, 而且其表达具有组织和时序特异性, 采用直接
克隆方法发现新的miRNA较为困难。根据miRNA
前体和成熟体都具有显著的结构特征, 采用生物
信息学方法寻找未知miRNA是当前发现和鉴定
miRNA的重要策略之一。为了区别miRNA与其他
小RNA, miRNA的预测必须遵循以下原则: (1)
RNA序列可折叠成合适的颈环二级结构; (2)成熟
体序列在颈环结构的一条臂上; (3) miRNA与另一
条臂上的互补序列miRNA*少于6个碱基错配; (4)
miRNA*序列不能成环, 与成熟体序列比对时不能
有间断; (5)二级结构有较高负的最小折叠自由能
(negative minimal free energy, MFE)和最小折叠自
由能指数(minimal free energy index, MFEI), A+U
碱基含量为30%~70%; (6)成熟体序列与已报道的
miRNA少于4个碱基替换(Zhang等2006; Ambros等
2003)。miRNA的预测流程如图1所示(Zhang等
2008)。
Zhang等(2008)从已知miRNA数据库中下载
了863条miRNA序列作为同源搜索的参考信息, 包
括前体和成熟体序列, 与番茄(Solanum lycopersi-
cum)表达序列标签(expressed sequence tag, EST)、
基因组序列(genome survey sequence, GSS)、普通
核酸(CoreNucleotide)和细菌人工染色体(bacterial
artificial chromosome, BAC)等数据库中共578 503
条核苷酸序列进行同源比对, 预测了13个miRNA
的前体序列, 并克隆了其中6个, 为了验证预测结
果的准确性, 根据已报道的另外9个物种中的294
条成熟体miRNA序列设计特异性探针引物, 通过
微流体芯片技术(microfluidic microarray)在番茄叶
易小娅等: 植物miRNA的研究方法概述 415
片组织中鉴定了258条成熟体miRNA序列, 这些
miRNA分布在92个miRNA家族中, 完全包揽了之
前通过同源搜索鉴定的miRNA前体序列。Niu等
(2013)用同样的方法对具有基因组背景的‘Suli’梨
(Pyrus pyrifolia)进行了miRNA的鉴定, 获得了属于
37个家族的186 个保守miRNA; 并用软件TAPIR
(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/tapir/)
预测了靶基因; 通过基因本体论数据库(Gene On-
tology, GO)和京都基因与基因组数据库(Kyoto en-
cyclopedia of genes and genomes, KEGG)对靶基因
进行了分类和功能分析。
1.3 深度测序
DNA测序作为一种重要的实验技术, 在生物
学研究中有着广泛的应用。然而随着科学研究和
技术平台的发展, 一种费用更低、通量更高、速
度更快的第二代测序技术(next generation sequencing)
应运而生。现有的技术平台主要包括Roche/454
FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied
Biosystems Solid System。虽然直接克隆和同源
搜索都可以获得miRNA, 但是第二代深度测序
的出现迅速取代了上述两种技术。相较于传统
克隆的方法 , 深度测序具有覆盖面广、信息量
大和可直接检测miRNA表达水平等无可比拟的
优势。
miRNA的表达水平会随环境变化而改变 ,
Baev等(2014)为了检测拟南芥在高、低温下小
RNA的丰度及表达水平, 分别建立了两个小RNA
文库, 深度测序的结果表明低温胁迫的处理主要
富集21 nt的miRNA, 高温下主要为21~24 nt的miR-
NA。
盐芥(Thellungiella salsuginea)作为一种有望
成为研究耐盐性的盐生模式植物, 鉴定盐胁迫下
的miRNA具有重要意义。Zhang等(2013)以200
mmol·L-1 NaCl胁迫处理24 h及未经胁迫处理的盐
芥为材料, 分别构建了两个小RNA文库, 通过Sol-
exa测序, 鉴定了109个保守miRNA, 137个新的
miRNA及26个miRNA*; 依托盐芥的基因组信息,
预测了143个先前报道过的靶基因及425个盐芥特
有miRNA的靶基因。通过RNA连接酶介导的5
cDNA末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid
amplification of 5 cDNA end, 5 RLM-RACE)验证
了7个靶基因的靶位点。
miRNA作为一类转录后调控因子, 与植物的
生长发育和响应环境胁迫密切相关。为了探究
miRNA在杨树(Populus alba×P. glandulosa)冬眠激
活生长下的表达水平, Ding等(2014)构建了3个小
RNA文库, 分别是短日照诱导休眠、低温诱导的
外生性休眠以及长日照诱导的生长激活, 通过Illu-
mina高通量测序, 获得了具有显著差异表达的123
个已知miRNA, 275个新的miRNA, 其中34个
图1 同源搜索鉴定植物miRNAs的流程
Fig.1 Procedure of plant miRNAs identification with homology search
植物生理学报416
miRNA丰度较高且具有独特的表达模式。
有报道称暗形态建成发育是幼苗抵御黑暗胁
迫的重要机制, 受miRNA调控。为了在基因组水
平鉴定芸薹幼苗的miRNA, 通过Solexa对黑暗胁迫
4 d的芸薹幼苗进行了测序, 获得了属于36个家族
的96个保守miRNA和576个新的miRNA; 此外,
qRT-PCR检测黑暗处理下miRNA的表达趋势与测
序结果一致。预测了2 013个潜在的靶基因, 并通
过5 RLM-RACE验证了miR157、miR159和
miR160对靶基因的切割(Zhou等2014)。
植物的生长与所处环境中的微生物关系密切,
Thiebaut等(2014)为了了解玉米(Zea mays)小RNA
与内生固氮菌的关系, 对玉米进行了固氮菌的接
种, 并进行了深度测序, 获得了25个保守的miRNA
和15个新的miRNA, 发现玉米与有益内生固氮菌
相互作用时, RNA介导的沉默机制会触发特殊的
胁迫响应。
为了探究miRNA在甜橙(Citrus sinensis)生长
发育中扮演的角色, Liu等(2014)通过高通量测序
从叶、花和果实不同组织中进行了基因组水平的
比较, 鉴定了183个已知miRNA和38个新的miR-
NA, 并通过qRT-PCR和Northern blot分析比较了不
同组织和发育阶段miRNA的表达模式。
作为重要粮食作物的鹰嘴豆(Cicer arietinum),
虽然已有了全基因组测序背景, 但对其miRNA的
研究却知之甚少。Jain等(2014)对鹰嘴豆的7个主
要组织和器官进行了小RNA的Illumina深度测序,
通过与其他植物中获得的已知miRNA同源比对,
鉴定了440个保守的miRNA和178个新的miRNA,
发现部分鹰嘴豆miRNA具有明显的时空和组织特
异表达, 同一家族中不同成员具有保守和特异表
达的模式。
以上3种植物miRNA鉴定方法各有利弊, 相较
于其他几种方法, 深度测序以鉴定数量最多、高
效、不需基因组信息、无需试验验证、发现新的
miRNA及在各个物种中应用广泛等特征明显优于
其他选择。但是由于一次深度测序可以产生大量
数据, 需要生物信息学的后续分析, 否则很难从冗
杂的数据资源中获得重要信息, 因此, 将生物信息
学分析和实验方法紧密结合将极大地促进miRNA
的鉴定(Zhang和Wang 2015)。表1中列出了利用二
代测序技术鉴定部分植物的miRNA。
表1 利用二代测序技术鉴定植物miRNAs
Table1 Identification of plant miRNAs by next generation deep sequencing
物种 处理条件或不同组织 miRNA的种类和数量 参考文献
拟南芥 高温和低温胁迫 118个保守miRNA Baev等2014
盐芥 盐胁迫 109个保守miRNA, 137个新的miRNA及26个miRNA* Zhang等2013
杨树 冷诱导的冬眠解除 123个已知miRNA, 275个新miRNA Ding等2014
芸薹 黑暗胁迫 96个保守miRNA, 576个新的miRNA Zhou等2014
玉米 内生固氮菌胁迫 25个保守的miRNA, 15个新的miRNA Thiebaut等2014
甜橙 组织特异性 183个保守miRNA, 38个新的miRNA Liu等2014
鹰嘴豆 组织特异性 440个保守的miRNA, 178个新的miRNA Jain等2014

2 靶基因的预测与验证
miRNA不能直接调控植物的生长和发育, 所
有的miRNA几乎都是通过靶向编码蛋白的基因实
现调控功能, 所以评估miRNA功能的第一步也是
最重要的一步就是靶基因的验证, 以下将从生物
信息学预测和生物学实验验证两方面进行综述。
2.1 生物信息学预测
成熟miRNA通过碱基配对与其靶基因结合从
而造成靶基因切割、阻遏翻译以及甲基化等负调
控效应, 这些原则可以总结如下: (1) miRNA与靶
基因序列互补配对, 少于4个碱基错配, 其中10和11
位不能有错配, 2~12位少于1个碱基错配, 13位下
游少于2个碱基错配; (2) miRNA结合靶基因自由
能至少为与靶基因完全互补配对的72% (Schwab
等2005)。根据这些原则, 研究者设计了多种算法
对靶基因进行辅助预测。虽然有大量miRNA-tar-
g e t预测规则和程序 , 但大多数都是根据动物
miRNA设计的, 相较于植物miRNA靶基因的预测,
动物miRNA对于碱基互补的完全性较宽松, 并且
动物miRNA倾向于对靶基因的翻译抑制, 而植物
易小娅等: 植物miRNA的研究方法概述 417
m i R N A选择对靶基因进行切割。此外 , 动物
miRNA通常结合在靶基因的3非翻译区, 而植物
miRNA通常没有特定位置的喜好(Ekimler和Sahin
2014)。这些差异导致了植物miRNA需要特有的
预测工具, 以下将对目前最常用的几个预测软件
及工具进行介绍(表2)。
表2 植物miRNA作用的靶基因预测的常用生物信息学资源
Table 2 A brief summary of bioinformatics tools for plant miRNA target identification
运算法则 网址 预测指标 输入数据 参考文献

　
BLAST
psRNATarget
miRdeepFinder
C-mii
CleaveLand
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/
http://www.leonxie.com/DeepFinder.php
http://www.biotec.or.th/isl/c-mii
http://axtell-lab-psu.weebly.com/cleaveland.html
种子区域匹配度、靶位点
保守性
种子区域匹配度、靶位点
保守性、自由能、靶点依
赖性
种子区域匹配度、靶位点
保守性
种子区域匹配度、靶位点
保守性、自由能
种子区域匹配度、靶位点
保守性、自由能、靶点依
赖性、切割位点频率
m i R N A序列、
基因序列
m i R N A序列、
基因序列
m i R N A序列、
基因序列
m i R N A序列、
基因序列
降解组数据库、
小RNA和mRNA
数据库序列
Barozai等2012
Dai和Zhao 2011
Xie等2012
Numnark等2012
Addo-Quaye等2009
BLAST是一种序列快速比对的工具, 根据以
上原则 , 可对靶基因进行快速而直接的预测。
Barozai等(2012)为了预测向日葵(Helianthus annu-
us) miRNA的靶基因, 将获得的miRNA序列与向日
葵基因组数据库进行高度相似比对, 选择得分在
75%以上的序列, 再结合生物信息学软件RNA-hy-
brid (Krüger和Rehmsmeier 2006)进行预测, 获得了
61个新miRNA的84个靶基因。Tian等(2014)将盐
胁迫下获得的花椰菜(Brassica oleracea var. italic)
保守和新的miRNA与ESTs进行比对, 分别预测了
836和527个靶基因。
psRNATarget是用于鉴定植物小RNA靶基因
的程序软件, 能够高效地分析二代深度测序获得
的数据, 整合了以下2个重要的功能: (1)根据得分
模式评价miRNA与靶基因转录本反向互补程度;
(2)通过计算小RNA与靶基因mRNA形成的二级结
构的自由能评价靶位点的近似性 (Da i和Zhao
2011)。psRNATarget已经广泛用于多种物种的
miRNA研究 , Kohl i等 (2014)为了探索鹰嘴豆
miRNA在应对真菌感染和盐胁迫中发挥的作用,
通过二代测序技术获得了来自25个不同家族的
122个保守miRNA, 59个新的miRNA, 利用psRNA-
Target预测了约358个不同的靶基因。同样的方法
在油菜(Brassica napus) (Shen等2014)、大豆(Gly-
cine max) (Guo等2014)、小米(Setaria italic) (Han等
2014)、凤梨(Vriesea carinata) (Guzman等2013)中
也进行了应用。
miRdeepFinder是植物小RNA深度测序的另
一个分析软件, 包含了前体加工的原始数据, 具有
鉴定保守miRNA、挖掘新的miRNA并进行分类、
miRNA表达水平分析、靶基因预测和miRNA与靶
基因作用网络分析等综合内容。miRdeepFinder的
分析不受物种的限制, 也不受基因组信息的限制
(Xie等2012)。
C-mii是第一款具有图示详解操作流程的靶
基因预测软件 , 具有安装方便、有图像指示操
作、预测结果可做成图表和分组信息的鸟瞰图、
可校正和自动化恢复以及多项目多线程管理等优
点, 尤其适合没有生物信息学平台的中小型植物
分子实验室(Numnark等2012)。
CleaveLand可用于分析降解组数据 , 检测
miRNA的靶基因切割位点。输入降解组数据、小
RNA和mRNA数据库 , 即可获得小RNA的靶基
因 , 可用于任何物种的降解组数据, 且同样适合
miRNA以外的其他小RNA的分析(Addo-Quaye等
2009)。
虽然生物信息学预测方法多种多样, 但是依
据不同原则预测的不同方法得到的结果往往不能
植物生理学报418
完全一致, 所以调整生物信息学工具, 获得更为精
确的预测结果与实验验证一样重要(Ekimler和Sa-
hin 2014)。
2.2 生物学实验方法验证
通过生物信息学预测的靶基因存在一定的假
阳性, miRNA是否可以靶向切割或抑制靶基因的
表3 miRNA可能作用的靶基因检测实验技术
Table 3 Experimental validation of miRNA targets
　　　　　实验技术 　　　　　　原理 物种 处理条件或不同组织 参考文献
5 RLM-RACE 直接检测miRNA切割位点 豇豆 　　盐胁迫 Paul等2011
降解组测序 直接检测miRNA切割位点 黄瓜 　　组织特异性 Mao等2012
qRT-PCR RNA水平检测miRNA与靶基因的 棉花 　　铅胁迫 He等2014
表达量
烟草瞬时表达体系 蛋白质水平检测靶基因的表达量 小麦 　　病原菌胁迫 Feng等2014a
CLIP、HITS-CLIP、PAR-CLIP miRNA-AGO-mRNA复合体 人类 Wen等2011; Licatalosi等
2008; Hafner等2010

表达最终仍需要采用生物学实验进行验证(表3)。
2.2.1 5 RLM-RACE
虽然有研究报道 , miRNA可以通过靶向切
割、翻译抑制、甲基化与去甲基化等途径调节功
能基因的表达, 但植物miRNA仍以切割为最主要
的作用方式(Jung等2009)。依据此特点可采用5
RLM-RACE方法, 检测miRNA的切割位点。先用
RNA连接酶在mRNA的5端加上一个RNA接头进
行反转录, 再用接头特异引物与基因特异引物进
行PCR扩增, 克隆测序鉴定切割位点, 在切割位点
处会呈现异常高的克隆频次, 以此来确定miRNA
的切割位点。Paul等(2011)在鉴定盐胁迫下豇豆
(Vigna unguiculata) miRNA的研究中, 使用5 RLM-
RACE技术成功证明了miR160对ARF的切割作用。
2.2.2 降解组测序
与5 RLM-RACE原理相似并且同样常用的另
一种技术是平行末端分析(parallel analysis of RNA
end, PARE), 也被称为降解组测序(degradome se-
quencing)。PARE技术与5 RLM-RACE不同的是,
PARE技术富集所有含poly(A)的mRNA, 并且在
RNA接头上有一个内切酶Mme识别位点, 该内切
酶切割位点位于其识别位点下游20 bp处, 加接头
的mRNA反转录成cDNA, 用Mme酶切后加上一个
DNA接头, 根据两侧接头的序列设计引物, 经PCR
扩增后克隆建库进行深度测序, 测序后得到20 bp
的序列, 然后通过生物信息学与原mRNA转录本进
行序列比对。与5 RLM-RACE相同的是, PARE无
法检测通过翻译抑制靶基因表达的miRNA (Feng
等2014b; Pantaleo等2010)。
Mao等(2012)结合高通量测序和降解组测序
揭示了黄瓜(Cucumis sativus) miRNA与靶基因的
组织特异性表达, 经CleaveLand 2.0分析后, 鉴定出
11个已知miRNA的21个靶基因, 这些miRNA包括
miR156/157、miR159、miR164、miR167和
miR169等。Zhang等(2012)通过降解组测序, 鉴定
了枸枳(Poncirus trifoliate)新的miRNA与保守
miRNA的149和172个靶基因, GO和KEGG注释表
明这些靶基因与植物的生长代谢紧密相关。
2.2.3 qRT-PCR
miRNA调控的最终结果是靶基因表达量降
低, 因此通过qRT-PCR检测靶基因在转录水平的表
达量来寻找靶基因是最常用的鉴定方法。
He等(2014)为了检测miRNA介导的重金属胁
迫响应, 对棉花(Gossypium hirsutum)进行了不同浓
度的铅胁迫 , 通过q RT- P C R对1 6个胁迫响应
miRNA和10个靶基因进行了表达模式的检测, 结
果显示大部分miRNA与靶基因的表达呈现负相关,
还有部分miRNA与靶基因表现为正相关。而与之
相似的, Wang等(2013)对棉花进行了盐和干旱胁
迫, 并用qRT-PCR检测了miRNA与靶基因在胁迫
下的表达模式, 结果发现miRNA与靶基因的表达
具有浓度和组织依赖性, 在7个miRNA-target组合
中有5组存在显著相关性。
2.2.4 构建烟草(Nicotiana tabacum)瞬时表达体系
构建烟草瞬时表达体系观察报告基因蛋白的
表达强弱可以得到更可靠、形象的实验证据。最
易小娅等: 植物miRNA的研究方法概述 419
常用的方法是利用绿色荧光蛋白(green fluorescent
protein)基因GFP、葡糖苷酸酶(β-glucuronidase)基
因GUS等作为指示标记来检测miRNA对靶基因的
降解作用。其做法是将miRNA的靶基因序列片段
融合报告基因构建至植物表达载体, 将构建好的
克隆载体和miRNA同时导入烟草, 报告基因在启
动子驱动下转录表达。如果miRNA能作用于靶基
因序列, 转录本被切割降解, 将检测不到报告基因
的表达或表达减弱; 反之, 如果miRNA不能作用于
靶基因序列, 则会检测到报告基因的表达(Gao等
2011)。
Feng等(2014a)在研究成年小麦(Triticum aes-
tivum)抵抗条锈病的研究中, 通过降解组测序得到
2个新的miRNA, 命名为1136-P3和PN-2013, 并预
测了其靶基因——单脱氢抗坏血酸还原酶(mono-
dehydroascorbate reductase)基因TaMDHAR, 构建烟
草瞬时表达体系共转miRNA与靶基因, 发现相较
于只转入融合有GUS的靶基因, 报告基因GUS的蛋
白表达显著降低, 且酶活下降, 证明了这2个miRNA
对靶基因的靶向作用。
2.2.5 miRNA-AGO-mRNA复合体
miRNA与AGO (argonaute)蛋白结合并招募其
他蛋白形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced si-
lencing complex, RISC), 通过序列互补对靶基因进
行序列切割或阻遏(Bartel 2004), 因此是否形成
miRNA-AGO-mRNA复合体是miRNA与靶基因相
互作用的重要依据。据此将AGO蛋白与抗原相连,
用免疫共沉淀(crosslinking immunoprecipitation,
CLIP)分离得到miRNA-AGO-mRNA的复合体, 以
此来富集与miRNA相互作用的mRNA序列, 然后
通过微阵列深度测序等方法获取miRNA靶基因信
息或作用位点序列(Wen等2011)。与此类方法类似
的有高通量紫外交联免疫沉淀法(high-throughput
sequencing of RNAs isolated by crosslinking immu-
noprecipitation, HITS-CLIP) (Licatalosi等2008)和光
激活核酸加强交联免疫共沉淀法(photoactivat-
able-ribonucleoside-enhanced crosslinking and im-
munoprecipitation, PAR-CLIP) (Hafner等2010)。但
是目前这些方法主要用于动物miRNA的靶基因鉴
定, 植物中暂时未见报道。
上述实验验证方法各有优缺点, 大多数研究
者都会选择联合使用其中2~3种技术对miRNA可
能作用的靶基因进行验证。
3 植物miRNA功能研究与应用
大量研究表明, miRNA参与植物的生长发育
以及逆境响应的多种生物学过程, 虽然已从众多
植物中克隆鉴定了miRNA, 并验证了部分miRNA
作用的靶基因, 但仍有许多miRNA的生物学功能
有待破译。
3.1 miRNA过表达
有研究报道, 通过遗传学的方法过表达单个
miRNA, 获得的转基因植株能够增强或减弱对生
物或非生物胁迫的耐性。植物miRNA的生物合成
经历了初级转录产物(primary miRNA, pri-miR-
NA)、前体miRNA (precursor miRNA, pre-miRNA)
和miRNA成熟体几个阶段。由于pre-miRNA独特
的颈环结构包含了形成miRNA成熟体的完整序列,
可确保其在细胞内被加工为正确无误的miRNA成
熟体序列, 因此, 用强启动子驱动pre-miRNA的转
录是目前miRNA过表达体系中最为广泛的方法,
对于未知前体序列的miRNA则不能直接用此方法
进行转基因功能研究。Xia等(2012)过表达水稻
OsmiR393, 降低了靶基因OsTIR1和OsAFB2的表
达, 转基因水稻出现更多分蘖并提早开花, 降低了
水稻的盐和旱耐性, 这可能是因为miR393通过降
低2个生长素受体基因TIR1和AFB2的表达导致对
生长素信号通路的高敏感。
3.2 同义突变或功能缺失靶基因
由于miRNA序列短小, miRNA家族由多个成
员组成, 有部分功能重叠, 所以传统的遗传突变并
不适合m i R N A的研究 , 通过靶基因同义突变
miRNA切割位点碱基或功能缺失, 利用转基因技
术, 可以间接研究miRNA的功能(Mallory等2004)。
拟南芥miR394的表达受到ABA诱导, 靶基因
LCR (leaf curling responsiveness)在ABA的处理下
表达量减少。过表达miR394和lcr突变体均表现出
盐敏感性和抗寒性增强, 过表达同义突变靶基因
m5LCR则出现耐盐性增强和抗寒性降低, 过表达
miR394使拟南芥对ABA敏感, 而靶基因的同义突
变体则表现相反。结果证明了miR394通过抑制靶
基因LCR是维持植物响应非生物胁迫的重要途
径。这种应对盐和寒冷胁迫截然相反的表现可能
是miR394和LCR之间的平衡失调导致的。当这种
平衡失调, 植株就会表现为ABA超敏感或者ABA
植物生理学报420
抗性, miR394通过靶向切割LCR的途径使植物更
好地应对ABA和非生物胁迫(Song等2013)。
3.3 miRNA target mimicry (TM)
miRNA功能研究最理想的方法是缺失或抑制
miRNA的表达, miRNA TM通过特异性地结合指
定miRNA, 在序列中间成环而阻断miRNA对靶基
因的调控作用(Franco-Zorrilla等2007)。Bazin等
(2013)通过构建豆科植物蒺藜苜蓿(Medicago trun-
catula) miR396 TM, 阻断miRNA对靶基因的切割
作用, 导致靶基因的表达明显升高, 进而促进了植
物菌根的生长; 而过表达miR396则导致靶基因的
表达量减少, 抑制植物菌根的生长, 从而证明了
miR396对蒺藜苜蓿菌根分裂组织的影响。
Sorin等(2014)为了鉴定miR169对拟南芥根结
构生成的影响, 构建了不同的miR169 TM, 改变了
根分生组织特异细胞形态的数量和大小, 通过阻
断miR169对靶基因核转录因子Y中A亚基(nuclear
factor Y-A, NF-YA)的调控, 间接影响了侧根的发育。
3.4 amiRNA
amiRNA是将天然miRNA的成熟序列替换成
人工设计的靶向其他感兴趣基因的反义序列, 通
过天然miRNA的生成和作用途径达到RNA干扰
(RNA interference, RNAi)的效果(Alvarez 2006)。
Niu等(2006)以拟南芥miR159前体为骨架, 构
建了靶向两个可以编码沉默病毒mRNA的序列, 这
两个靶基因为P69和HC-Pro, 将amiR-P69159和amiR-
HC-Pro159转入拟南芥中成功获得了特异性抵抗芜菁
黄花叶病毒(turnip yellow mosaic virus, TYMV)和芜
菁花叶病毒(turnip mosaic virus, TuMV)的转基因
植株。
Park等(2009)在构建amiRNA时发现, 与amiR-
NA*在5端有碱基错配, 与靶基因完全互补配对的
amiRNA具有极高的基因沉默效率, 获得了AP1
(APETALLA1)无义突变的转基因拟南芥; 此外, 通
过应用amiRNA多聚体形式可以同时沉默2个独立
的基因AP1和CAL1 (CAULIFLOWER)。
3.5 人工反式作用干扰小RNA (artificial trans-act-
ing small interfering RNA, ata-siRNA)
在植物体内有一种反式作用干扰小RNA (trans-
acting small interfering RNA, ta-siRNA), 其成熟过
程由miRNA介导, 随后产生21 nt的双链RNA (dou-
ble-stranded RNA, dsRNA)对靶基因进行切割, 是
细胞主动利用RNAi机制进行的防御, 由Peragine等
(2004)在研究rdr6 (RNA-DEPENDENT POLY-
MERASE6)和sgs3 (SUPPRESSOR OF GENE SI-
LENCING3)突变体对拟南芥生长的影响时首先发
现。ata-siRNA就是根据这种机制设计的新的
miRNA功能研究方法。以miR173为例, 其触发基
因为TAS1a (trans-acting siRNA1a), 构建的ata-siR-
NA包含2个转录本, 分别是miR173和TAS1a, 都具
有独立的启动子和终止子, 在转录过程中, 靠近5
端的miR173转录加工形成miR173成熟体, 结合
TAS1a转录本5端的miR173触发序列上, 这种结合
将会导致TAS1a被剪切成许多21 nt的ata-siRNA, 它
们均可人为设计成miRNA或siRNA, 每个ata-siR-
NA再结合到内源性的靶基因转录本上, 导致靶基
因的切割或翻译抑制(Zhang 2014)。
以上miRNA的功能研究方法各有利弊, 所以
在对某一种miRNA进行功能研究时, 往往结合多
种研究方法在体内和体外同时进行才能更好地鉴
定miRNA的功能。
4 展望
作为一类新发现的基因表达调控因子, 植物
miRNA参与众多的生物学过程, 包括生长发育、
代谢及响应环境中的生物和非生物胁迫, 对其研
究成为生命科学的热点。近年来, 植物miRNA的
研究发展迅速, 从小规模的提取分离小RNA进行
直接克隆, 到现在大规模的二代深度测序鉴定新
的植物miRNA, miRNA的鉴定已经相对容易。深
度测序的发展必将带来大量的数据信息, 这促使
了生物信息学的发展; 然而, 不同的软件对植物
miRNA靶向关系预测计算规则各有不同, 往往导
致预测结果不一致, 所以采用统一标准进行靶基
因的预测很有必要, 如何服务众多中小型植物分
子实验室, 建立生物信息学分析平台也具有重大
意义。此外, 由于大量植物没有基因组信息, miRNA
前体的研究进展较慢, 来自不同的miRNA前体却
可以产生相同成熟体的机制有待揭秘 , 前体在
miRNA行使功能中存在何种生物学意义还不明
确。Feng等(2014a)在研究小麦TaMDHAR与新发
现的miRNA PN-2013、1136-P3的关系时, 利用
GUS作为报告基因证明了这2个miRNA均可减弱
易小娅等: 植物miRNA的研究方法概述 421
靶基因的表达, 然而在后续的qRT-PCR分析表达规
律时发现, TaMDHAR与PN-2013呈现出负相关, 却
并不受1136-P3的调控, 这让人思索, 植物miRNA通
过切割靶基因进行调控是主要的机制还是因为这
种方式比抑制蛋白翻译更容易被检测到, 体外实验
的证明结果能否表示植物体内miRNA真实的调控
方式(Zhang和Wang 2015)。虽然面临很多待研究
的问题, 但随着基因组、转录组、蛋白组和降解组
等组学技术的发展, 结合生物信息学和多种实验方
法, miRNA的研究将更具针对性且更深入。
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