全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月 987
植物miRNA及其在植物发育进程和环境胁迫响应中的潜在功能
刘运华 1,2,*，刘灶长 1,*，罗利军 1,**
1上海市农业生物基因中心，上海 201106；2华中农业大学植物科学学院作物遗传改良国家重点实验室，武汉 430070
Plant miRNA and Its Potential Role in Plant Developmental Process and Envi-
ronmental Stress Responses
LIU Yun-Hua1,2,*, LIU Zao-Chang1,*, LUO Li-Jun1,**
1Shanghai Agrobiological Gene Center, Shanghai 201106, China; 2National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement,
College of Plant Science, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
提要：文章介绍植物miRNA的产生、作用和miRNA的靶基因发掘以及miRNA在植物发育进程和环境胁迫响应中的潜
在功能研究进展。
关键词：植物miRNA；发育进程；胁迫响应；潜在功能
收稿 2007-06-22 修定　 2007-08-20
资助　 上海市浦江人才计划(05PJ14085)和上海市科委重大基
础研究项目(0 3D J1 40 15 )。
* 第一、第二作者贡献相同。
** 通讯作者(E-ma i l：l i ju n@sa gc.org .cn；T el：0 2 1 -
6 2 2 0 0 4 9 0 )。
microRNA (miRNA)是一类具有22个左右核苷
酸(nt)并具有调控作用的非编码单链 RNA分子，
广泛存在于植物、线虫、人类等真核生物的细胞
中(Bartel 2004)。1993年，Lee等(1993)用经典的
定位克隆方法首先在线虫(Caenorhabditis elegans)
中克隆到 lin-4基因，lin-4可以产生一种小RNA分
子，后者能以不完全互补的方法与其靶mRNA的
3非翻译区(3 untranslated region，3 UTR)相互作
用来抑制 lin-14的表达，并导致 lin-14的蛋白质合
成减少。但当时 lin-4的发现没有引起人们的广泛
重视。直到 2000年在线虫及人类(Homo sapiens)
和果蝇(Drosophila melanogaster)中发现 let-7的同
源物后(Reinhart等 2000)，人们才意识到miRNA
可能是一类在进化过程中保守的，并在生命过程
中起调控作用的分子。嗣后，随着越来越多的
miRNA的发现，它在动物、植物、细菌以及病
毒的细胞生长发育过程中的调控作用开始受到关
注。它们能导致靶基因mRNA的降解(transcriptional
gene silencing，TGS)，从而有效抑制相关蛋白质
的合成，或者抑制靶基因mRNA的表达，但不影
响mRNA本身的丰度，产生转录后基因沉默(post-
transcriptional gene silencing，PTGS)。迄今为止
认为可能超过1/3的人类基因都受miRNA的调控。
miRNA在动植物中的作用方式主要区别在
于：植物的miRNA与靶基因mRNA高度互补，
并与之结合而降解靶基因mRNA；动物的miRNA
多数通过与靶基因mRNA的3 UTR不完全匹配而
抑制靶基因mRNA的表达(Jones-Rhoades和Bartel
2004；Rhoades等 2002)。miRNA的发现补充了
RNA水平上对基因的调控机制，展现了细胞内基
因表达的全方位调控、多成次的网络系统，同时
也是对中心法则的补充。本文介绍了miRNA在植
物发育进程和环境胁迫响应中的研究进展。
1 植物中的miRNA及其作用
迄今为止，在果蝇、线虫、动物、植物和
病毒等各种生物中已经发现了超过4 000个miRNA
基因(数据见 Sanger Browse miRBase Database)。
其中在植物中发现的miRNA有近千个。已经得到
鉴定的miRNA大都是由约70 nt形成发夹结构的单
链 RNA前体经过Dicer酶加工生成，它是具有 5
端磷酸基和 3羟基，大小 21~25 nt的小分子RNA
片段，并定位于 R N A 前体的 3 端或者 5 端。
miRNA基因先在细胞核内转录成原始miRNA (pri-
miRNA)，再加工成前体miRNA (pre-miRNA)，然
植物生理与分子生物学 Plant Physiology and Molecular Biology
植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月988
后转运到细胞质中加工成成熟的miRNA。动物的
miRNA常常来自于编码蛋白质的基因前体中的内
含子区域(Baskerville和 Bartel 2005)，与之不同的
是，植物的miRNA存在于与编码蛋白无关的基因
间区域(Baulcombe 2004)。Northern、表达序列标
签(expressed sequence tag，EST)和基因定位表
明，植物的原始miRNA (pri-miRNA)和动物的一
样都包括有miRNA茎环结构(stem-loop) (Aukerman
和 Sakai 2003)，并有部分接合、多聚和加帽。和
动物miRNA一样，RNA聚合酶 II在大部分植物
miRNA的转录中起作用(Xie等 2005)，但有关更
多的植物miRNA的具体转录机制还不太清楚。
一些RNaseIII核酸内切酶在植物中pri-miRNA
生成成熟的miRNA步骤中起关键作用。和动物中
的Drosha一样，植物中的DCL1在第一步剪切中
起作用(Kurihara和Watanabe 2004)。DCL1在植物
中同时具有 D i c e r 和 D r os ha 的功能，在核内
miRNA/miRNA*双链释放的两步中起切割作用
(Park等 2005)。虽然植物miRNA常常在 5或 3末
端长短不一，但DCL1总是在miRNA的茎环结构
前体中特异位置进行切割产生累积的成熟miRNA
(Reinhart等 2002)。但DCL1究竟如何识别切割位
点至今仍是个谜。和 miRNA 的一级结构相比，
miRNA前体的二级结构对其功能来说似乎更加重
要，在miRNA前体的茎环结构中，在保持配对
类型和配对残余不变的情况下对与成熟miRNA区
域配对的部分进行替代，并不影响miRNA行使功
能(Vaucheret等 2004)，但产生的miRNA长度会
发生改变，miRNA的基本序列和不配对残余的空
间结构在决定切割位点上有一定的作用。遗传
学、分子生物学和生物化学的证据表明，
HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1)在miRNA的生物
合成中是DCL1的重要辅助物(Hiraguri等 2005)。
HYL1基因产物参与DCL1在位点识别和其他功能
的行使。另一个HUA ENHANCER1 (HEN1)包含
有甲基转移酶功能域，可甲基化miRNA/miRNA*
复合物(Yu等 2005)。miRNA/miRNA*复合物受
DCL1介导的切割和HEN1介导的甲基化后，被装
载进 AGO1，一部分miRNA分子转移出核并经
HASTY (HST)转运进入细胞质。Northern分析验
证单链miRNA存在于核内(Park等 2005)，但目前
还不能肯定的是，HST转运的是 miRNA/miRNA*
复合物还是已经被DCL1切割好的单链miRNA。
miRNA介导的沉默复合物一般称之为 RISC
(RNA induced silencing complex)。目前尚不清楚
细胞质中的 RISC是在转运前还是转运后形成的。
在形成RISC之前miRNA还和miRNA*形成配对复
合物，但克隆和表达分析的结果表明，此时的
miRNA含量大大高于miRNA*，这种不对称的累
积表明miRNA优先选择进入沉默复合物且不被降
解，而miRNA*则受到排除并降解(Reinhart等
2 0 0 2 )。和动物的 mi R N A 一样，大部分植物
miRNA的 5末端都比miRNA*的 5末端稳定性差
(Schwarz等 2003)。在 AGO基因家族的 AGO1参
与下，沉默复合物将成熟的miRNA与靶基因配对
并对靶基因进行切割或抑制翻译。一般认为
AGO1介导的切割发生在细胞质中，但也有证据
发现它在核内起作用(Xie等2003)。拟南芥的AGO
基因家族有 10 个成员，它们的部分功能已经清
楚。AGO1是拟南芥中唯一的一个知道miRNA功
能必需的 AGO家族的基因(Qi等 2005)。AGO4的
靶基因为转座子和反向重复序列，并能引起基因
的甲基化(Zilberman等 2004)，AGO7和AGO10与
特定的发育有关(Hunter等 2003)。另外，AGO7
还与一些 ta-siRNA的功能有关(Vazquez等 2004)。
关于miRNA和siRNA的关系长期以来一直存
在着疑惑。Bartel (2004)认为两者的主要区别在于
它们的生物起源，而在作用功能上并无实质性的
区别。由于miRNA和自身的前体 RNA序列是相
同而不是互补的，miRNA总是通过和mRNA的互
补，而不是调控产生自身的基因来行使功能；但
是 siRNA既可以像miRNA一样作用于互补序列，
也可以对自身起源的RNA进行作用。siRNA同时
在转录水平(TGS)和转录后水平(PTGS)上行使功能
(Baulcombe 2004)，而miRNA则多数是在 PTGS
上起作用，但也有人曾经观察到植物miRNA有甲
基化作用(Bao等 2004)，这说明植物中的miRNA
也有在转录水平上的调控功能。
2 植物miRNA基因的寻找
Lagos-Quintana等(2001)设计出一种专门定向
克隆小片段RNA的方法来筛选具有相同特征的小
分子：筛选一定大小的 RNA分子，连接到 3和
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5的适配子(adapter)上，逆转录后通过 PCR扩增、
亚克隆并测序。miRNA前体在基因组上的定位和
聚类是通过查询基因组数据库进行的。这个方法
有助于判断miRNA是否是mRNA、tRNA、rRNA
等分子的降解产物。在果蝇中已克隆了 37个新的
miRNA基因。由于克隆中的已知miRNA的重复
出现和 r R N A 的干扰，所以用同样的方法寻找
miRNA基因变得越来越困难，于是人们将目光转
向植物的特异性组织和发育阶段。Wang等(2004)
在籼稻中找到了 20个miRNA，Sunkar等(2005)分
别在拟南芥和水稻中克隆了 2 6 个和 1 4 个新
miRNA，迄今采用以上方法已经在不同种属植物
中克隆了大量的新的miRNA基因。
miRNA是由约 70 nt的茎环结构构成的，在
进化上相对保守，因此可用计算机软件来识别。
有一种计算程序(MiRscan)可以特异识别 2个物种
间的同源序列，Lim等(2003)用此技术在秀丽隐杆
线虫(Caenorhabdi t is e legans )和新杆状线虫
(Caenorhabditis briggsae)中寻找同源的发卡结构，
用已知的miRNA预测线虫中的miRNA。Legendre
等(2005)用“ERPIN”代替“比对”从基因组
中搜索与已知的miRNA相似但尚不清楚的miRNA。
除了专门用于寻找 miRNA 的程序和软件以外，
mfold和 Srnaloop等也是RNA折叠中常用的软件。
Cummins等(2006)建立了一种称为基因表达的
miRNA连续分析技术(miRNA serial analysis of gene
expression，miRAGE)，这种技术可从细胞中分
离出很多小RNA分子，然后将其逆转录成DNA，
并串联成长链后进行测序。之后用计算机分析
DNA序列，以识别那些带有基因特征的miRNAs
(如能形成识别Dicer酶的发夹结构)。采用这种技
术人们已在人类细胞中确认了 2 0 0 个已知的
miRNA，并发现 133个候选miRNA和 112个以前
尚未发现的miRNA*结构。相信此项技术将很快
普遍用于植物中新miRNA的发掘。
植物中miRNAs的研究主要集中在已经测序
的单子叶植物水稻和双子叶植物拟南芥，还有毛
果杨。某些miRNA在植物物种间相当保守，可
在某几种植物中同时发现，有的却只能在单子叶
或双子叶植物甚至只在某个物种中发现，这说明
此种miRNA可在进化过程中生成但并不保守。因
此，如何对各种保守和非保守的miRNA进行分
类，也是miRNA研究中的一个方向。
尽管越来越多的miRNA采用生化或者是生物
信息学方法得到鉴别，但由于很多miRNA是从单
个克隆中鉴别出来的，其中有很多miRNA具有组
织特异性和时序性，以及非保守性和低丰度性，
或者是受特定条件诱导表达，所以，有很多
miRNA可能在分离和鉴定过程中被漏掉，而已经
鉴别出来的miRNA只不过是众多miRNA中的沧海
一粟，因此寻找miRNA的工作还须继续进行。
3 植物miRNA的靶基因
虽然已经找到了数千个miRNA，并知道他们
在细胞发育、分化、癌变、代谢和死亡中起作
用，但迄今为止，真正确认功能的miRNA并不
多(Bartel 2004；He和 Hannon 2004)。现在已知
的靶基因的 miRNA 多数是通过基因筛选(gene
screen)和定向克隆方法发现的(Johnston和Hobert
2003)。由于目标不明确，效率低，用传统的方
法寻找miRNA的靶基因比较困难，所以用生物信
息学方法预测和寻找，目的性就更加明确。
Lewis等(2003)的“TargetScan”法和Kiriakidou
等(2004)的“DIANA-microT”法，另外还有
“RNA hybrid”(Rehmsmeier等 2004)、“PicTar”
(Krek等 2005)、“miRanda”(John等 2004)方法
都是针对预测哺乳动物 miRNA 靶基因的方法。
Sunkar等(2005)用“PATSCAN”发现了 4个水稻
的miRNA靶基因，并利用RNA酶介导的5 RACE
(5末端快速扩增)法将miRNA作用的位点标记在
靶基因上，实验验证了 4个miRNA对其靶基因的
负调控关系。
上述各种计算和预测miRNA靶基因的工作都
有以下特点：(1) miRNA和靶序列的保守性；(2)
miRNA:mRNA配对中 5端非常重要，其他位置允
许G:U配对；(3) miRNA和靶基因可能是一对多或
者多对一的关系。
由于植物中miRNA和靶序列的匹配关系比动
物miRNA更完全，所以通过植物miRNA预测其
靶基因更有效。植物miRNA靶序列识别的第一个
例证是在miR171中发现的，此外miRNA在拟南
芥基因组中有 4个靶序列，1个位于蛋白编码基因
之间且具有预测的茎环结构，另 3 个位于
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SCARECROW-LIKE (SCL)的反义链上，不具有茎
环结构。椐此可以推测，基因间位点产生的
miRNA可能会介导 SCL mRNA的降解(Reinhart等
2002)。
mRNA表达芯片可用于寻找基因组范围内的
miRNA靶基因，尤其是易为生物信息学方法预测
所遗漏的靶基因(Lim等 2003)。Palatnik等(2003)
在植物中超表达miR319，mRNA表达芯片的结果
表明，5个编码TCP转录因子的mRNA水平下降。
植物miR319通过引导TCP基因mRNA的降解，调
控叶片发育。Schwab等(2005)通过超表达多个植
物miRNA，并利用基因组范围的表达谱，推导建
立了一套实验参数识别靶基因，并印证了植物
miRNA引导的靶基因mRNA的降解。他们的实验
还证实，以前认为主要是通过抑制翻译而起作用
的miR172也能有效地导致mRNA的降解。
4 植物miRNA的功能
目前已知的植物miRNA的功能主要表现在调
控植物发育的各个方面，其靶基因多数是植物发
育模式和细胞分化中相关的转录因子。而这些靶
基因调控的植物生长发育过程主要包括激素的信号
传导、细胞代谢、器官分化、叶的发育、侧根
形成、育性转换、花器官的形成和生殖。而且
大部分的miRNA功能都重叠于整个调控网络中
(Mallory和Vaucheret 2006) (图 1)。
越来越多的研究结果表明，miRNA在植物的
各种生理过程中有潜在功能。特别是植物miRNA
与非生物胁迫之间可能存在的密切关系，已开始
不断受到人们的关注。Jones-Rhoades和 Bartel
(2004)分别通过预测和实验证实拟南芥中只有在胁
迫条件下才表达的部分新miRNA。从胁迫下的植
物中克隆miRNA导致一类新的内源性siRNA和nat-
siRNAs的发现(Sunkar等 2005)，并发现它们在胁
迫响应中起作用。植物miR395和miR399分别是
在缺硫和缺磷条件下诱导发现的，而这种诱导对
于营养缺失胁迫的一些基因下游调控很重要(Jones-
Rhoades和 Bartel 2004；Fujii等 2005；Chiou等
2006)。环境胁迫可以诱导很多基因表达，而这
些对逆境胁迫产生的耐性或响应起作用的基因诱导
很可能受miRNA负调控。Sunkar等(2006)在拟南
芥中的研究结果证实，miR398的 2个靶基因，Cu/
Zn过氧化物歧化酶基因(CSD1和 CSD2)，可氧化
体内的过氧化物自由基，从而缓解逆境对植物生
长的危害。同时，Sunkar等(2006)的结果显示，
CSD1和CSD2基因的表达受miR398诱导的mRNA
降解而导致的精细调控，因此他们认为在转基因
植物中通过抑止miR398导致的对CSD2基因的负
调控可能是改善植物在氧化逆境中生长的一条有效
途径，这也为通过小分子RNA的遗传操作改良作
物的抗逆性提供了一条新思路。但至今已知与植物
逆境胁迫有关的miRNA还不多，有待进一步查明。
迄今在植物中尚未发现 mi R N A 和内源性
siRNA对生物胁迫的直接响应，但抑制miRNA或
siRNA会对植物病毒起一定作用。Takeda等(2005)
在植物抗菌研究中观察到，miRNA通过调控生长
素的信号传递增加植物的抗病性。另外，植物中
有的miRNA对自身miRNA的生成具有调控作用。
miR162的靶基因为 DCL1，miR168的靶基因为
AGO1，而DCL1和 AGO1在miRNA的生成中是
2个关键的调控因子(Vazquez 等 2004；Xie等
2003)。AGO2也可受miR403调节，但两者之间
的关系尚不清楚(Allen等 2005)。
在植物miRNA的功能验证中，常用 35S强启
动子超表达或microRNA基因缺失的方法。miRNA
的超表达常导致多种发育缺失，因为大部分的
miRNA调控多个靶基因，这些基因常常都是与发
育有关的转录因子(Mallory和Vaucheret 2006)。有
时超表达 m i R N A 也会造成致死突变( K i m 等
图 1 植物miRNA调控的重叠网络
根据Mallory和 Vaucheret (2006)改绘。
植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月 991
2005)。而miRNA基因或者miRNA靶基因的突变
又常常造成特异的发育缺失。抗miRNA的靶基因
转化研究也是揭示植物miRNA调控网络的强有力
工具。
miRNA芯片是新近开发的快速、有效、高
通量研究miRNA表达的方法。Liu等(2004)首次
用于检测miRNA在肿瘤细胞中的表达，而Nelson
等(2004)提出的一种 RAKE (RNA-primed，array-
based Klenow enzyme assay)方法能够在特定的细胞
和肿瘤中同时检测出所有miRNA的表达。Axtell
和 Bartel (2005)首先将miRNA芯片运用于植物
miRNA的表达研究。原位杂交技术检测miRNA的
表达更直观，是了解miRNA原位时空表达的好方
法(Chen 2004)。
5 结语
miRNA是一类广泛存在的具有多种调控作用
的非编码单链 RNA分子，在动物、植物和微生
物各种生物体基因组中的miRNA基因在数量上约
占 1%。miRNA主要通过 2种机制，即翻译抑制
和转录切割来降低其靶基因编码的蛋白水平，进
而在生长、发育、增殖、分化和死亡各个过程
中起调控作用。翻译抑制主要存在于动物之中，
miRNA与靶基因的 3非编码区结构域结合；而在
植物中，miRNA常常与靶基因的编码序列结合，
而且一般都是完全互补或者很少不配对，因而导
致mRNA的切割降解，从而进一步调控植物的生
长发育或其他生理过程。
虽然在各个物种中发现的miRNA数量不少，
但是能给出直接证据证明miRNA的靶基因及其功
能的miRNA仍然较少。迄今已经克隆或预测到的
植物miRNA数量在不断增加，但用实验证据获得
这些miRNA的靶基因，并揭示它们的功能，相
对于动物miRNA而言其研究进展相对滞后，可以
说是后基因组时代需要解决的问题之一。在环境
胁迫下，植物miRNA可能参与的逆境响应与抗逆
调控的研究则更是刚刚开始。miRNA具有时序表
达特异和组织特异的特点，如何研究清楚miRNA
和它们的靶基因，并揭示他们的功能，更精确地
掌握miRNA在植物生长发育，特别是抗逆等生理
过程中的调控机制，是目前miRNA研究领域的重
要内容。在转录分析、miRNA超表达、抗miRNA
靶基因遗传转化的基础上，结合高通量的芯片分
析手段和生物信息学的方法，将会对植物miRNA
的表达特征及其靶基因与功能的研究起促进作用。
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