全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (9): 1423~1428 doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0214 1423
收稿 2014-05-04 修定 2014-08-01
资助 国家自然科学基金项目(31222053和31172256)、教育部
“新世纪优秀人才支持计划” (NCET-11-0217)和中央高校
基本科研业务费项目(lzujbky-2013-k08)。
* 通讯作者(E-mail: jlzhang@lzu.edu.cn; Tel: 0931-8913447)。
枯草芽孢杆菌GB03对紫花苜蓿耐盐性的影响
韩庆庆, 贾婷婷, 吕昕培, 李惠茹, 李静, 赵祺, 王锁民, 张金林*
兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室, 草地农业科技学院, 兰州730020
摘要: 本文研究了根际有益细菌枯草芽孢杆菌GB03对草类植物紫花苜蓿种子萌发、生长和耐盐性的调控作用。结果表明,
枯草芽孢杆菌GB03菌液浸泡紫花苜蓿种子处理后, 显著提高了不同盐浓度处理下种子的发芽势与发芽率; 对株高、根长
和生物量均有不同程度的提升作用, 显著增加了不同盐浓度处理下叶绿素含量。
关键词: 紫花苜蓿; 枯草芽孢杆菌; 盐胁迫; 种子萌发; 促生作用
Effect of Bacillus subtilis GB03 on Salt Tolerance of Alfalfa (Medicago sativa)
HAN Qing-Qing, JIA Ting-Ting, LÜ Xin-Pei, LI Hui-Ru, LI Jing, ZHAO Qi, WANG Suo-Min, ZHANG Jin-Lin*
State Key Laboratory of Grassland Agro-Ecosystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University,
Lanzhou 730020, China
Abstract: In current study, the regulation of Bacillus subtilis GB03 to seed germination, growth and salt
tolerance of Medicago sativa was investigated. The results indicated that B. subtilis GB03 significantly
increased seed germination potential and germination rates of M. sativa under various salinity conditions. GB03
improved shoot height, root length and plant biomass in different degrees, and significantly enhanced
chlorophyll content under different concertrations of salt.
Key words: alfalfa (Medicago sativa); Bacillus subtilis; salt stress; seed germination; growth promotion
生物改良盐碱地虽已被广泛应用, 主要以盐
土植物或遗传改良的甜土植物为主, 利用微生物
提高植物的耐盐能力已成为目前农业研究中的一
个热点。近年来有关微生物途径改良盐碱地的研
究主要以内生细菌促进植物生长为主, 如内生细
菌可通过促进寄主植物的生长, 增强植物自身的
抗病能力以及抗干旱、盐碱等胁迫的能力(Bano
和Fatima 2009; Hayat等2010; Marques等2010;
Rudrappa等2010; Medeiros等2011; Cappellari等
2013; Diagne等2013; Zelicourta等2013)。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属
细菌中的一种, 嗜温、好氧、产芽孢, 其生理特征
多样, 极易分离培养(曹春霞等2011), 在自然界广
泛存在、对人畜无毒无害、不污染环境的非致病
菌。它能够产生丰富的抗菌物质, 如脂肽类、肽
类、磷脂类、多烯类、氨基酸类和核酸类等(Stein
等2002), 对真菌、细菌、病毒和菌原体等具有良
好的抑制作用(Tamehiro等2002), 同时又能产生生
长激素如生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸
和乙烯等, 促进植物生长(张霞等2007), 继而改善
植株生长发育(蔡学清等2005)。枯草芽孢杆菌是
土壤和植物微生态的优势微生物种群之一, 具有
很强的抗逆能力和抑菌防病增产作用, 且许多都
能产生对植物生长有益的植酸酶(郭英等2009)。
美国德州理工大学Paul W. Paré教授实验室一系列
最新的研究表明, 枯草芽孢杆菌菌株GB03释放物
可以调控拟南芥26 000多个基因的转录, 其中对参
与细胞壁修复、初生和次生代谢、光合作用、逆
境响应、激素代谢、铁营养代谢等600多个基因
的调控达到了显著水平, 从而促进拟南芥的生长
(Ryu等2005; Zhang等2008a, 2008b, 2009, 2010a;
Xie等2009; Banchio等2009; Paré等2011); 其中
GB03通过调控AtHKT1;1基因的组织特异性表达,
显著地增强了拟南芥的耐盐性, 与对照相比, GB03
减少了根对Na+的吸收, 增强了地上部到根的Na+
再循坏, 降低了整株Na+的积累, 使整株中的K+/Na+
提高2倍多(Zhang等2008a)。
植物生理学报1424
紫花苜蓿是一种重要的优良牧草, 营养价值
丰富、产量高、品质好, 素有“牧草之王”美称, 是
世界上利用最早、栽培最广的一种优良豆科牧草
(Bao等2009; 包爱科等2011)。虽然近年来苜蓿产
业化规模发展较快, 种植面积在不断扩大, 但其抗
逆能力有限, 不耐盐碱和干旱。本文以根际有益
细菌枯草芽孢杆菌菌株GB03和紫花苜蓿为材料,
研究了在不同盐胁迫下枯草芽孢杆菌GB03对紫花
苜蓿种子萌发的影响, 并利用枯草芽孢杆菌GB03
与紫花苜蓿共培养技术分析其在紫花苜蓿生长和
耐盐性调控中的作用。
材料与方法
1 材料
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) GB03菌株由
美国德州理工大学Paul W. Paré教授提供, 紫花苜
蓿(Medicago sativa L.)品种‘甘农1号’种子由兰州
大学包爱科副教授提供。
2 紫花苜蓿种子处理及枯草芽孢杆菌GB03菌液的
制备
精选一批紫花苜蓿种子, 先用70%乙醇处理1
min, 然后使用2% NaClO消毒10 min后, 再用无菌
水漂洗7~8次, 每次3 min, 洗涤过程中不断搅动,
将种子表面的酒精和NaClO冲洗干净。将消毒完
全的紫花苜蓿种子置于黑暗条件中无菌水中浸泡
24 h。
LB液体培养基按照5 g∙L-1 NaCl、10 g∙L-1胰蛋
白胨和5 g∙L-1酵母粉的比例配制, 用标准型pH计
(PB-10, 北京赛多利斯)调pH到7.2, 使用立式压力
蒸汽灭菌锅(LDZX-50KBS, 上海申安)高温灭菌待
冷却后, 每100 mL的LB液体培养基加入100 μL的
GB03菌液, 在转速为180 r∙min-1下, 温度为28 ℃的
恒温培养摇床(THZ-300, 上海一恒科技)上培养过
夜后, 使用核酸检测仪(NanoDrop 1000, 德国)测定
菌液浓度为OD600=0.9时取出备用。
3 紫花苜蓿种子萌发实验
在灭菌的离心管中加入培养好的GB03菌液,
然后将消毒好的紫花苜蓿种子浸泡在菌液中(以
LB培养基作为对照), 计时5 min, 迅速取出种子, 平
铺在已灭菌铺有2层滤纸的培养皿。铺种之前, 在
滤纸上滴入等量不同浓度的NaCl溶液(0、50、100
和150 mmol∙L-1), 至滤纸表面形成水膜为止, 取出
的种子均匀的铺在滤纸上, 每皿50粒, 置于25 ℃黑
暗下培养, 每天统计观察发芽情况, 培养24 h后统
计发芽率, 计算发芽势。每处理设置6个重复, 图
表中的数值为平均值±SE。
实验中以胚根突破种皮、露白视为萌发, 每
天观察紫花苜蓿种子, 并记录当天萌发的种子数
量, 计算发芽率(GP)=(Gt/T)×100%, 式中Gt为发芽
第8天全部发芽的种子数, T为种子的总数; 发芽势
确定为发芽第1天的发芽率。
4 枯草芽孢杆菌GB03与紫花苜蓿共培养实验
待种子长出子叶后, 挑取长势一致的紫花苜
蓿幼苗接种至含有不同NaCl浓度(0、100和150
mmol∙L-1)的1/2MS培养基中。与此同时, 接种枯草
芽孢杆菌GB03于青霉素小瓶中的培养基上, 并设
置接种LB液体培养基作为对照。然后将紫花苜
蓿和枯草芽孢杆菌GB03菌液共培养, 利用GB03
释放的气态化学物质影响紫花苜蓿的生长和抗盐
性。实验处理如表1所示, 设置6个处理, 分别重复
10次。
表1 实验设计方案
Table 1 Experimental design
编号 处理
1 液体LB
2 GB03培养液
3 100 mmol∙L-1 NaCl+液体LB
4 100 mmol∙L-1 NaCl+GB03培养液
5 150 mmol∙L-1 NaCl+液体LB
6 150 mmol∙L-1 NaCl+GB03培养液
接种后培养条件如下: 温度为(25±0.6) ℃、光
照周期为11 h (光照)/13 h (黑暗), 光照强度为72
μmol·m-2·s-1。共培养4周后用刻度尺测定株高和根
长; 用称重法测定植株鲜重; 用乙醇丙酮混合液浸
提法测定总叶绿素含量(Ma等2012)。
5 数据统计分析
每处理设6个重复(n=6), Excel处理数据、作
图。采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析(P<
0.05), 比较不同处理间各项指标的差异。
韩庆庆等: 枯草芽孢杆菌GB03对紫花苜蓿耐盐性的影响 1425
实验结果
1 枯草芽孢杆菌GB03对不同盐浓度处理下紫花苜
蓿种子萌发的影响
从图1和图2可以看出随着盐浓度的增加 ,
GB03处理和对照种子的发芽势逐渐降低, 而发芽
率无明显变化。与对照相比, GB03菌液浸泡显著
提高了紫花苜蓿种子的发芽势与发芽率(P<0.05)。
在0、50、100和150 mmol∙L-1 NaCl处理下, GB03
菌液浸泡使发芽势分别提高4.1%、121.8%、129.0%
和165.9% (图1), 使发芽率分别提高34.8%、15.5%、
17.5%和27.7% (图2)。
2 枯草芽孢杆菌GB03对不同盐浓度处理下紫花苜
蓿形态特征的影响
图3表明, 枯草芽孢杆菌GB03对0、100和150
mmol∙L-1 NaCl处理下的紫花苜蓿株高具有一定程
度的促进作用, 分别增加0.4%、12.9%和3.3%, 但
与对照均没有显著性差异。图4表明, 无盐处理下,
根系的伸长效应存在显著差异, 比对照增加20.0%
(P<0.05); 而在100与150 mmol∙L-1 NaCl浓度处理下,
GB03对紫花苜蓿根系生长无显著的促进作用。
3 枯草芽孢杆菌GB03对不同盐浓度处理下紫花苜
蓿生长的影响
紫花苜蓿的生长过程中不断进行着物质交换,
其实质就是物质的积累过程, 鲜干重则是其物质
图1 GB03菌液对不同盐浓度处理下紫花苜蓿
种子发芽势的影响
Fig.1 Effects of GB03 bacterization on germination potential
of alfalfa under various concentrations of NaCl
不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同此。
图2 GB03菌液对不同盐浓度处理下紫花苜蓿
种子发芽率的影响
Fig.2 Effects of GB03 bacterization on germination rate of
alfalfa under various concentrations of NaCl
图3 GB03菌液对不同盐浓度处理下
紫花苜蓿株高的影响
Fig.3 Effects of GB03 bacterization on the shoot height of
alfalfa under various concentrations of NaCl
图4 GB03菌液对不同盐浓度处理下
紫花苜蓿根长的影响
Fig.4 Effects of GB03 bacterization on the root length of
alfalfa under various concentrations of NaCl
植物生理学报1426
积累的主要指标。与相同盐浓度对照相比, 枯草
芽孢杆菌GB03能够提高紫花苜蓿的鲜重和干重
(图5)。无盐处理下, GB03处理的显著提高地上部
鲜重33.9%、干物质积累量64.2%, 地下部鲜重
92.6%、干重57.5% (P<0.05)。在100 mmol∙L-1盐浓
度处理下, GB03使紫花苜蓿的地上部鲜重增加
14.1%, 干物质的积累量显著增加33.9%; 地下部鲜
重提高16.7%, 干重增加11.0%。150 mmol∙L-1盐浓
度处理下, GB03对地上部鲜干重无显著影响, 地下
部鲜重提高27.27%, 干重增加55.56%。由此可以
推测, 在一定盐浓度范围内, 枯草芽孢杆菌GB03在
紫花苜蓿的生长和耐盐性调控中发挥重要作用。
图5 GB03菌液对不同盐浓度处理下紫花苜蓿生长的影响
Fig.5 Effects of GB03 bacterization on plant growth of alfalfa under various concentrations of NaCl
4 枯草芽孢杆菌GB03对不同盐浓度下紫花苜蓿叶
绿素含量的影响
盐胁迫下植株叶绿素含量是衡量植物耐盐性
的重要生理指标之一(Ma等2012)。图6显示, 与对
照相比 , 枯草芽孢杆菌GB03使0、100和150
mmol∙L-1 NaCl处理的紫花苜蓿叶绿素含量分别显
著增高了21.35%、42.72%和20.70% (P<0.05)。这
表明枯草芽孢杆菌GB03能够促进紫花苜蓿叶绿素
的合成, 从而促进其生长。
讨 论
土壤盐渍化是影响农业生产与生态环境的主
要因素之一. 如何降低盐对植物的毒害或提高植
图6 GB03菌液对不同盐浓度处理下
紫花苜蓿叶片叶绿素含量的影响
Fig.6 Effects of GB03 bacterization on leaf chlorophyll
content of alfalfa under various concentrations of NaCl
韩庆庆等: 枯草芽孢杆菌GB03对紫花苜蓿耐盐性的影响 1427
物的耐盐能力是盐渍土生物改良中的核心问题
(Shi等2002; 刘桂玲等2011; Zhang和Shi 2013)。在
轻度和重度盐胁迫下, 植物体可分别通过对Na+的
装载和卸载来调节细胞渗透势和降低毒性Na+在
细胞中的积累, 进而抵御不利环境(Zhang等2010b;
丁同楼等2013)。应用微生物治理盐碱地、防止土
地盐碱化和提高植物耐盐性自然也成为一种有效
的策略(郭英等2009)。辛中尧等(2008)研究表明,
枯草芽孢杆菌B1和B2菌株对黄芪和当归根等生物
学性状有较高的促生作用。尹汉文等(2005)研究
表明, 在一定盐胁迫条件下, 枯草芽孢杆菌可在一
定程度提高黄瓜的耐盐性。蔡学清等(2005)的研
究发现枯草芽孢杆菌可提高水稻体内叶绿素含量,
增强其保护酶活性从而促进水稻生长。易有金等
(2007)研究认为, 内生枯草芽孢杆菌B-001对烟草
幼苗有一定的促生作用。本研究结果发现, GB03
菌液浸泡紫花苜蓿种子后, 显著提高了不同盐浓
度处理下种子的发芽势与发芽率, 从而提高了种
子活力, 促进了紫花苜蓿的萌发。GB03菌液对植
株的株高、根长和生物量均有不同程度的提升作
用, 这说明GB03菌液在不同盐浓度的处理下促进
了紫花苜蓿的生长。
盐胁迫往往造成植物生物量的下降, 而生物量
的改变主要取决于光合作用的变化, 因此非生物胁
迫下植物能否保持较高的光合效率往往与其抗逆
性密切相关(Greenway和Munns 1980)。叶片叶绿素
含量是直接联系植物光合速率的一项重要生理指
标(Ma等2012)。研究发现, 盐胁迫下可导致植株叶
片的叶绿素含量降低, 这主要是由于受盐胁迫, 植
物体内的叶绿素酶活性增强, 从而促进了叶绿素的
氧化降解所致(Lunde等2007; Tuna等2008; Barry
2009)。本研究发现, 枯草芽孢杆菌菌株GB03显著
增加了不同盐浓度处理下叶绿素含量。因此, 枯草
芽孢杆菌GB03对提高紫花苜蓿耐盐性具有明显作
用。Zhang等(2008b)研究表明, 枯草芽孢杆菌GB03
提高拟南芥光合速率的机制是降低了光合器官对
葡萄糖的敏感性和脱落酸水平; 进一步发现, GB03
可以增强拟南芥对铁的吸收, 从而提高了叶绿素含
量、光合速率和植株生长(Zhang等2009)。
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