全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (5): 488~494488
收稿 2011-01-26　　修定 2011-04-01
资助 广东省教育厅育苗工程(LYM10040)、北京林业大学林木
育种国家工程实验室开放课题(FOP2010-4)、华南农业大
学校长基金(2007K033和2009K014)。
* 通讯作者(E-mail: yzhlin@scau.edu.cn; Tel: 020-85280259)。
赤桉抗寒转录因子ICE1基因的分子克隆与表达分析
林元震1,2,3,*, 郭海4, 刘纯鑫1, 陈晓阳1
1华南农业大学林学院, 广州510642; 2北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点实验室, 北京100083; 3北京林业大学林木
育种国家工程实验室, 北京100083; 4水利部水土保持植物中心, 北京100038
摘要: ICE1属于一种类似MYC的bHLH转录因子, 可特异地结合到CBF3启动子的MYC作用元件并诱导CBF/DREB1下游基
因的转录表达。本文以拟南芥ICE1蛋白序列为信息探针, 搜索桉树基因组和EST数据库的同源序列并进行拼接、设计引
物, 通过RT-PCR从赤桉克隆了桉树的第一个ICE1基因。其cDNA长1 792 bp, 含有完整的开放阅读框, 可编码523个氨基
酸。BLAST分析表明, cDNA序列及其推导的氨基酸序列均与拟南芥、芥菜、小麦和甜杨ICE1存在着较高的同源性, 预示
所获得的cDNA可能是赤桉ICE1基因(EcaICE1)。EcaICE1基因表达分析结果显示, EcaICE1在赤桉根、茎、叶中均表达,
而且表达水平不受低温胁迫处理时间的影响, 这表明EcaICE1是组成型表达。此外, EcaICE1的超表达可以提高转基因烟
草的耐低温能力。上述结果为进一步研究EcaICE1在赤桉耐低温胁迫过程中基因表达的调控机制打下基础。
关键词: 赤桉; 转录因子; 抗寒性; ICE1
Molecular Cloning and Expression Analysis of Cold-Resistant Transcription
Factor ICE1 from Eucalyptus camaldulensis L.
LIN Yuan-Zhen1,2,3,*, GUO Hai4, LIU Chun-Xin1, CHEN Xiao-Yang1
1College of Forestry, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2Key Laboratory for Genetics and Breed-
ing in Forest Trees and Ornamental Plants, Ministry of Education, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 3National
Engineering Laboratory for Tree Breeding, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 4Plant Materials for Soil and Wa-
ter Conservation, Ministry of Water Resources, Beijing 100038, China
Abstract: ICE1 (inducer of CBF expression 1) is a MYC-like bHLH transcriptional activator, can bind to CBF3
promoter, and induces the expression of CBF3 and its downstream genes during cold acclimation. The first Eu-
calyptus ICE1 gene was cloned from E. camaldulensis by RT-PCR with the gene-specific primers designed ac-
cording to Eucalyptus EST and E. grandis genomic sequences and by using Arabidopsis ICE1 protein sequenc-
es as the starting information. A 1 792-bp cDNA clone was obtained in our study, which contains a putatively
entire open reading frame (ORF) and encodes a MYC-like protein of 523 amino acids. Bioinformatic analysis
revealed that this cDNA was highly homologous to ICE1 from Arabidopsis thaliana, Capsella bursa-pastoris,
Triticum aestivum and Populus suaveolens, indicating that the interest cDNA was EcaICE1 gene. EcaICE1 was
expressed in all tested tissues and the expression levels of EcaICE1 were stable during different low tempera-
ture treatments, suggesting that EcaICE1 was expressed constitutively in E. camaldulensis. Moreover, overex-
pression of EcaICE1 could enhance the cold tolerance in transgenic tobaccos. These results may provide the
basic for further study of regulation function of EcaICE1 in gene expression during low temperature stress.
Key words: Eucalyptus camaldulensis; transcription factor; cold resistance; ICE1
低温是限制植物生长发育和地理分布的重要
环境因子, 低温会造成植物不同程度的伤害, 甚至
死亡。低温伤害是世界上普遍存在的问题, 也是
造成农林业生产巨大损失的一种严重自然灾害
(Pearce 1999)。因此, 学者们已把植物低温适应性
与耐低温植物品种培育问题作为一个重要的研究
课题。
现有研究表明, 冷诱导基因CORs往往都含有
DRE/CRT顺式作用元件, 常可被转录因子CBFs或
DREB1s家族识别、结合进而启动下游低温应答
基因的表达(Stockinger等1997)。在植物体内的低
林元震等: 赤桉抗寒转录因子ICE1基因的分子克隆与表达分析 489
温逆境信号转导通路中, CBFs或DREB1s类转录因
子是感受上游传递的低温信号并将信号向下游传
递的重要调控因子, 在增强植物适应和抵御低温
过程中起着重要作用(Chinnusamy等2007), 但
CBFs或DREB1s本身也受低温诱导。Chinnusamy
等(2003)首次发现拟南芥突变体ice1中CBF3的表
达量下降, 并降低了一些受CBFs调控的下游基因
的表达, 突变体的耐寒力明显下降。他们分离了
ICE1基因, 发现它编码类似MYC的bHLH型转录因
子, 可特异地结合到CBF3启动子的MYC作用元件
上, 并诱导CBF3调控的下游基因的表达。Lee等
(2005)采用基因芯片的方法, 发现ice1突变体影响
了一些低温胁迫早期应答基因以及受ABA或生长
素调控基因的表达, 进一步验证了ICE1在植物低
温胁迫应答中起着关键性的作用。Dong等(2006)
研究发现HOS1 (high expression of osmotically re-
sponsive gene)是一个Ub E3连接酶, 可介导ICE1的
泛素化(ubiquitination), 并引起ICE1蛋白的降解, 进
而增加转化植株的冷敏感。Miura等(2007)研究发
现, 拟南芥SUMO (small ubiquitin-like modifier) E3
连接酶SIZ1可以对ICE1进行苏素化(sumoylation)
修饰进而增加ICE1蛋白的稳定性, 促进CBF3的表
达并抑制MYB15的表达, 增强了植株的耐低温能
力。上述研究表明, ICE1比CBFs更早感受低温信
号, 在增强植物适应和抵御低温过程中起着重要
作用(Chinnusamy等2007)。迄今, ICE1基因仅从拟
南芥(Chinnusamy等2003)、芥菜(Wang等2005)、
甜杨(林元震等2007a)和小麦(Badawi等2008)中分
离到, 此外, 在水稻、大豆、棉花、油菜、玉米、
马铃薯等植物中也发现了ICE1同源序列(Badawi
等2008), 但尚未见有其他植物的报道。
赤桉属桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus)
树种, 是我国广泛栽培的桉树品种之一, 耐寒性强,
产量高, 是造纸工业的优良用材之一(关亚丽等
2005)。同时, 赤桉的农杆菌转化已经作为一种转
基因模式用于木本植物的转基因研究, 因此赤桉
是研究华南木本植物抗寒机制以及开展抗寒性转
录因子基因克隆的理想材料。本文以拟南芥ICE1
蛋白序列为信息探针, 从巨桉基因组中找到同源
序列, 通过FGENESH预测、拼接以及结合桉树的
EST数据库, 利用RT-PCR从赤桉中克隆了第一个
桉树ICE1基因, 并进行了相关序列和表达分析, 为
研究其在赤桉低温胁迫中基因表达的调控作用机
制打下基础。
材料与方法
赤桉(Eucalyptus camaldulensis L.)基因型103
无菌组培苗外植体采自广东省雷州林业局北坡林
场赤桉试验林。
总RNA制备采用CTAB法(Lin等2004)。基因
克隆参照林元震等(2007b)的方法, 以拟南芥ICE1
氨基酸序列(AAP14668)为信息探针。以赤桉组培
苗4 ℃处理24 h的总RNA为模板, 进行RT-PCR, 正
义引物为ICE02F (5 ATGGTTCTGGGTGGCGAG-
GAAGACG 3), 反义引物为ICE02R (5 AGGAA-
CATCGTCTTGCTCTCTAG 3)。扩增程序: 94 ℃
预变性4 min; 94 ℃变性30 s, 56 ℃退火1 min, 72 ℃
延伸2 min, 30个循环; 最后72 ℃延伸10 min。回收
PCR产物, 克隆至pGEM-T Easy载体。挑取阳性克
隆交由上海基康生物技术有限公司测序。
利用DNAMAN软件进行赤桉ICE1序列分
析。其次, 通过NCBI网站BLAST后, 选择与赤桉
ICE1同源性较高的其他植物 ICE1转录因子用
Clustal W 1.83进行多重比对, 并用MEGA4.0 (Ta-
mura等2007)构建系统发育树, 采用Neighbor-join-
ing (NJ)算法的Complete deletion模式建树, Boot-
strap值取1 000。
赤桉ICE1基因在低温胁迫条件下与不同器官
中的表达模式采用半定量RT-PCR技术分析。从赤
桉无菌组培苗切下生长健壮的芽, 接入生根培养
基(MS+0.05 mg∙L-1 NAA)培养1个月后, 选取长势
良好且一致的生根苗进行胁迫处理后续实验。低
温胁迫处理方法: 将组培生根苗转移至4 ℃, 分别
处理0、0.5、l、2、4、8、24 h, 提取叶片RNA, 每
个处理每个时间点的材料为5株。室温下提取组
培生根苗的整株、根、茎和叶RNA, 用于组织特
异性表达分析。
以pBI121为载体, 通过重组技术构建了赤桉
ICE1基因的植物表达载体pBEcaICE1, 用液氮冻融
法转化农杆菌LBA4404。采用叶盘法进行烟草转
化, 卡那霉素(Km)筛选浓度为100 mg∙L-1。转基因
烟草生根组培苗经PCR验证后, 移入营养杯(土:蛭
植物生理学报490
石=1:1)中培养, 温度26~28 ℃, 光照16 h∙d-1, 光照强
度约44 μmol·m-2∙s-1。2个月后, 以生长性状一致的
野生型和转基因烟草进行低温实验, 直接0 ℃处理
24 h, 进行表型观察及基因表达分析。
实验结果
1 赤桉ICE1基因全长cDNA的序列分析
根据设计的引物ICE02F和ICE02R, 以合成的
第一链cDNA为模板进行PCR扩增, 获得一条1.8 kb
左右特异的预期cDNA片段。测序结果表明目的
基因cDNA长1 792 bp, 具有一个最大完整编码框,
可编码523个氨基酸, 分子量为56.6 kDa, 等电点pI
为6.26。编码的氨基酸序列中, Leu含量最高, 达
10.71%, Gly含量其次(9.94%), Ser含量居第三
(9 .18%) , 含量最低的是Trp (0 .57%)。另外 ,
EcaICE1序列中含有10个Cys, 分别位于第106、
129、150、313、382、419、426、456、484和
508位氨基酸, 预示EcaICE1可能含有二硫键, 这对
维持其结构稳定及功能行使具有重要意义。
BLAST结果表明, 赤桉与拟南芥、芥菜、毛
果杨、小麦、甜杨ICE1蛋白序列及大豆、水稻同
源序列的同源性分别为58%、58%、57%、55%、
46%和56%、55%。对上述ICE1蛋白序列作进一
步多重比对, 结果显示, 赤桉ICE1蛋白与其他植物
ICE1蛋白在N端差异较大, 但它们在bHLH功能域
(图1, 框II)和C端高度保守。此外, 一个由11个氨基
酸组成的区域(图1, 框I)在除甜杨ICE1外, 其他蛋
白均完全一致 , 但在属于ICE2基因家族的小麦
TaICE47、水稻Os01g0928000 (Badawi等2008)中
无此保守区; 而且拟南芥ICE1突变体正是在该区
域中的R236突变为H236而丧失了ICE1蛋白功能,
可见, 该保守区可能是不同ICE行使不同功能的标
记之一。另外, 赤桉ICE1中也存在SUMO结合位
点(图1, 框III), 且与拟南芥、芥菜和小麦的ICE1完
全一致, 与大豆、水稻的ICE1同源序列稍有差别,
但与毛果杨和甜杨的ICE1差异很大, 这可能说明
赤桉ICE1的苏素化作用途径与拟南芥类似, 而有
别于毛果杨和甜杨。
将EcaICE1与NCBI检索的ICE1同源基因(共
15个植物物种)进行蛋白比对并构建系统发育树,
结果显示, ICE1基因家族按照其保守结构的不同
可以分成2个亚家族: 双子叶ICE1和单子叶ICE1,
本文中的EcaICE1隶属于双子叶ICE1, 且与苹果
MdABS50251亲缘关系最近(图2), 说明EcaICE1是
植物ICE1家族的一个新成员, 该基因已提交Gen-
Bank, 登记号为HQ891008。
2 赤桉ICE1基因的表达模式分析
利用半定量PCR技术分析赤桉ICE1基因在低
温胁迫条件下及不同器官中的表达模式, 结果显
示, EcaICE1基因在赤桉的根、茎、叶中均有表达,
叶的表达量最高, 茎其次, 根最弱(图3-A)。低温胁
迫处理结果表明 , 从室温到4 ℃处理0.5~24 h,
EcaICE1的表达量均没有什么差异, 说明EcaICE1
基因是组成型表达(图3-B)。上述结果与拟南芥
(Chinnusamy等2003)、甜杨(林元震等2007a)和小
麦(Badawi等2008)等植物的研究一致。
3 转赤桉ICE1烟草分析
为了进一步验证赤桉ICE1在低温胁迫中的作
用, 我们构建了超表达载体(图4-A)并转入烟草。
EcaICE1在CaMV 35S强启动子的驱动下, 并未对
转基因烟草的表型造成不利影响, 这有别于CBF类
转录因子(Kasuga等1999)。经过PCR检测, 初步断
定赤桉ICE1已整合到烟草的基因组中(图4-B)。对
转基因烟草进行0 ℃低温胁迫24 h, 结果发现, 对
照烟草已完全冻蔫并死亡, 而转基因烟草中TG16
和TG13仍然表现正常, 仅TG20表现与对照一样
(图4-D)。采用半定量RT-PCR检测烟草中EcaICE1
的表达情况, 发现EcaICE1在TG16和TG13中均可
检测到, 而在对照和TG20均未检测到(图4-C), 这
也与低温表型实验的结果相一致, 说明EcaICE1在
CaMV 35S启动子的驱动下, 其超表达可以提高转
基因烟草的耐低温能力。
讨　　论
本文以拟南芥ICE1为信息探针, 采用同源克
隆的方法, 从低温胁迫的赤桉中分离出第一个桉
树ICE1 (EcaICE1), 序列比对结果显示, 与拟南
芥、芥菜、小麦和甜杨等植物的ICE1具有较高的
同源性, 尤其在bHLH区和C端序列, 同源性更高。
Badawi等(2008)在研究小麦ICE1时, 认为TaICE87
属于ICE1, 而TaICE41属于ICE2, 其理由是现有报
道的植物ICE1蛋白均含有GAQPTLFQKRA这11个
林元震等: 赤桉抗寒转录因子ICE1基因的分子克隆与表达分析 491
图1 植物ICE1及同源序列的多重比较
Fig.1 Alignment of the ICE1 proteins and homolog sequences from plants
框I: ICE1蛋白高度保守区; 框II: bHLH和ZIP结构域; 框III: SUMO结合位点。拟南芥(Arabidopsis thaliana): AtICE1 (AAP14668);
芥菜(Capsella bursa-pastoris): CbICE1 (AAS7935); 赤桉(Eucalyptus camaldulensis): EcaICE1 (HQ891008); 大豆(Glycine max): GmICE1
(ACJ39211); 水稻(Oryza sativa): Os11g0523700 (297611917); 甜杨(Populus suaveolens): PsuICE1 (ABF48720); 毛果杨(Populus trichocarpa):
PtrICE1 (ABN58427); 小麦(Triticum aestivum): TaICE87 (EU562184)。
氨基酸组成的保守区(图1, 框I), 以及在bHLH区(图
1, 框II)的尾部具有LPPT保守区, 这两个保守区在
ICE2中不存在。EcaICE1均存在上述两个保守区,
而且系统发育树显示EcaICE1隶属于双子叶ICE1,
因此, EcaICE1是植物ICE1家族的一个新成员。此
外 , 在SUMO结合位点(图1, 框III) , 发现赤桉
植物生理学报492
图2 植物ICE1蛋白及同源序列的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of ICE1 proteins and homolog sequences from plants
拟南芥(Arabidopsis thaliana): AtICE1 (AAP14668)、AtbHLH033 (NM_101157); 油菜(Brassica napus): BnDY000939 (DY000939); 芥
菜(Capsella bursa-pastoris): CbICE1 (AAS7935); 甜橙(Citrus sinensis): CsCN191080 (CN191080); 赤桉(Eucalyptus camaldulensis): EcaICE1
(HQ891008); 大豆(Glycine max): GmICE1 (ACJ39211); 雷蒙德式棉(Gossypium raimondii): GrCO111971 (CO111971); 大麦(Hordeum vulgare):
HvBU983081 (BU983081); 苹果(Malus domestica): MdICE1 (ABS50251); 水稻(Oryza sativa): Os11g0523700 (AK109915); 甜杨(Populus suaveo-
lens): PsICE1 (ABF48720); 毛果杨(Populus trichocarpa): PtrICE1 (ABN58427); 马铃薯(Solanum tuberosum): StDV627678 (DV627678); 小麦
(Triticum aestivum): TaCA501920 (CA501920)、TaICE87 (EU562184)、TaCK208335 (CK208335); 玉米(Zea mays): ZmDV024434 (DV024434)。
图3 赤桉ICE1基因的表达模式分析
Fig.3 Expression pattern analysis of EcaICE1 gene
A: 器官特异性分析; B: 低温胁迫表达分析。
EcaICE1与拟南芥等大多数植物的一样(VKEE), 而
杨树ICE1 (IMDK)差异较大, 这可能说明杨树ICE1
的SUMO作用有别于其他植物。
植物ICE1的研究显示, 在拟南芥、小麦、杨
树和水稻中, 至少含有2个ICE1同源蛋白, 而且分
布于不同的染色体, 其中, 拟南芥、毛果杨的ICE1
及其同源蛋白序列在C端同源性可分别高达89%
和97% (Badawi等2008)。我们以EcaICE1搜索巨桉
基因组, 没有得到类似结果, 这说明桉树ICE1可能
不同于拟南芥、小麦、杨树和水稻的ICE1。
林元震等: 赤桉抗寒转录因子ICE1基因的分子克隆与表达分析 493
ICE1基因在拟南芥(Chinnusamy等2003)、小
麦(Badawi等2008)和甜杨(林元震等2007a)中是组
成型表达, 但芥菜ICE1 (Cbice53)的表达水平可受
低温胁迫和盐胁迫而提高(Wang等2005)。本文中
的EcaICE1在赤桉的根、茎、叶中均表达, 而且其
表达水平不受低温胁迫时间长短的影响 , 说明
EcaICE1与拟南芥等植物ICE1一样, 都是组成型表
达。
虽然拟南芥ICE1基因是组成型表达, 但它的
超表达可在低温下增强CBF3、CBF2和CORs基因
的转录表达并提高转基因拟南芥植株的耐寒能力
(Chinnusamy等2003)。拟南芥ICE1已相继被导入
水稻(向殿军等2007)、烟草(黄文功等2008)和黄瓜
(Liu等2010)等植物中, 并均可提高转基因植株的
耐寒性。Badawi等(2008)将小麦两个ICE1类似蛋
白基因TaICE41和TaICE87导入拟南芥, 发现小麦
ICE1超表达可提高转基因植株的抗冻性, 但该作
用需先经过4 ℃冷驯化; 同时, 小麦ICE1还可增强
AtCBF2和AtCBF3的表达。我们将赤桉EcaICE1导
入烟草, 直接在0 ℃下处理24 h, 发现EcaICE1的超
表达可以增强转基因植株的耐低温能力。但
EcaICE1在转基因烟草中是否增强了CBFs和CORs
基因的表达, 以及其在烟草低温胁迫中基因表达
的调控机制, 仍有待于进一步的研究。
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图4 赤桉ICE1转化烟草的低温实验
Fig.4 Low temperature experiments of transgenic tobaccos by EcaICE1 gene
A: EcaICE1的超表达载体; B: 转基因烟草的PCR检测; C: 转基因烟草的RT-PCR检测; D: 转基因烟草的低温实验。
植物生理学报494
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