全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (5): 792~796　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0120792
收稿 2015-03-09　　修定 2015-04-27
资助 国家自然科学基金项目(31400224)和浙江大学实验技术研
究项目(2013-15)。
致谢 浙江大学生命科学学院植物生理学与生物化学国家重点
实验室吴平教授(已故)帮助建立NMR测试平台。
* 通讯作者(E-mail: liuyu_zju@zju.edu.cn; Tel: 0571-
88206177)。
基于核磁共振的水稻根细胞内pH值的测定方法
刘于*
浙江大学生命科学学院, 杭州310058
摘要: 采用31P-核磁共振技术(31P-NMR)建立了无损伤测定水稻根系细胞内pH值的方法。通过测定水稻根系细胞内磷酸盐
化学位移间接确定细胞液泡及细胞质内pH, 计算得到正常水培条件下水稻根系细胞液泡及细胞质内pH分别为5.43±0.05和
7.45±0.04。另外, 用该方法还测定了磷饥饿条件下水稻根细胞内pH的变化。
关键词: 31P-核磁共振; 水稻根; 细胞pH值
NMR-Based Measurement of Intracellular pH in Rice Roots
LIU Yu*
College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
Abstract: A 31P nuclear magnetic resonance (31P-NMR) method to measure noninvasively intracellular pH in rice
roots was described in this paper. The cytoplasmic and vacuolar pH values (pHc and pHv) were estimated indirectly
from the chemical shift of phosphate (Pi) present in the cytoplasm and vacuole of rice roots. Using the 31P-NMR
method, pHc and pHv of the rice roots in hydroponic culture were obtained at 5.43±0.05 and 7.45±0.04, respec-
tively. And, changes of intracellular pH in rice root under phosphorus starvation condition were also determined.
Key words: 31P-NMR; rice roots; intracellular pH
技术与方法 Techniques and Methods
植物细胞内pH值是植物细胞内物理环境最基
本的指标之一, 是控制植物细胞内生物化学反应
的重要调节因素之一(柳参奎等2004)。通常, 大多
数植物细胞胞质内pH相对稳定地维持在中性左
右, 液泡内pH波动在5.0~6.5范围内(Kurkdjian和
Guern 1989; 周文彬和邱保胜2004)。细胞内pH值
的测定可以为研究植物抗逆或转基因功能鉴定等
提供重要参数。胞内pH值的测定方法主要有弱酸
弱碱分布法、核磁共振(nuclear magnetic reso-
nance, NMR)法、微电极法和荧光染料法等(周文
彬和邱保胜2004)。但是, 弱酸弱碱分布法和微电
极法需要破坏组织, 无法避免各种损伤或破坏所
导致的细胞内部生理和代谢变化以及由此产生的
测定结果的偏差; 荧光染料或绿色荧光蛋白(green
fluorescent protein, GFP)法由于观察手段有限, 很
难活体检测pH或只局限于少量细胞层染色, 无法
对活体根组织整体测定, 同时, 染色方法还可能对
活体细胞的功能有影响。因此, 准确无损伤测定
植物细胞内pH对于深入研究植物细胞代谢与细胞
内pH值的关系及其可能机制有重要意义。
NMR技术是一种在生理条件下无损伤性研究
活细胞等生物样品的主要手段(Shanks 2001), 能在
接近生理状态下动态地研究生命现象。活体(in
vivo) NMR研究可非损伤地测定细胞内pH值(Moon
和Richards 1973; Roberts等1980; 乔娟等2005), 非
破坏性地间接测定细胞内K+、Mg2+等游离离子浓
度(黄荣清等2004)。Roberts等(1980)和Roby等
(1987)利用31P NMR方法测定植物细胞内的磷, 并
通过磷的不同位移计算出液泡及细胞质内的pH,
该方法为无损伤测定不同胁迫条件下植物根系细
胞内pH的变化提供了一条重要的途径。此方法的
研究对象主要为悬浮细胞, 而很少应用在植物根
系原位细胞内的分析上。本研究尝试将NMR技术
应用于测定水稻根系细胞内的pH, 在国内尚属首
次。同时, 也第一次报道了磷饥饿胁迫条件下植
刘于: 基于核磁共振的水稻根细胞内pH值的测定方法 793
物细胞内的pH变化，为植物细胞应对磷胁迫响应
机制的研究提供了重要的原位数据。
材料与方法
1 水稻根系灌流装置
该装置由核磁管(5 mm)、毛细管(0.5和0.3
mm)、双通道蠕动泵(Ismatec, 瑞士)、空气泵、聚
四氟乙烯管(内径0.8 mm)及一些连接小管组成(图
1)。重水(D2O)溶液装入2根0.5 mm毛细管, 10
mmol·L-1亚甲基二磷酸(methylenediphosphoic acid,
MDP)溶液装入0.3 mm毛细管, 毛细管两端烧封后
放入5 mm的核磁管内; 称量0.05~0.07 g水稻根系
放入核磁管, 连接在蠕动泵上的两根聚四氟乙烯管
上, 排空气泡后, 一根插入到核磁管底部, 另一根
在根系上层, 使灌流液液面维持不动, 然后用胶带
将聚四氟乙烯管固定在核磁管口上; 灌流液流速为
3 mL·min-1。此外, 将空气泵管插入灌流液烧杯中以
增加灌流液中的溶解氧。灌流液组成成分为: 5
mmol·L-1葡萄糖、10 mmol·L-1硝酸钾、0.5 mmol·L-1
硝酸钙、1 mmol·L-1氯化钾、0.5 mmol·L-1硫酸镁、
0.2 mmol·L-1磷酸二氢钾、2 mmol·L-1 2-(N-吗啉)乙
磺酸一水合物(MES), pH 5.5 (Stefanovic等2011)。
图1 水稻根系灌流装置图
Fig.1 Perfusion system of rice roots
2 31P-NMR波谱测定
采用600 MHz超导核磁共振波谱仪(AVANCE
III, Bruker, 瑞士), 配备5 mm BBFO探头采集波
谱。参数设置如下: 31P共振频率242.9 MHz, 单脉
冲门控去偶方式测定, 脉冲倾斜角为30º, 脉冲宽度
3.96 µs, 采样时间0.33 s, 数据点16 k, 谱宽24 kHz,
扫描4 500次, 线增宽因子20 Hz, 采样温度298 K。
将85% H3PO4的化学位移(δ)规定为0 ppm, 并以此
作为相对标准。D2O锁场, 不匀场, 以10 mmol·L
-1
MDP外标作为确定δ的参考标准(Quiquampoix等
1993)。采用Bruker TopSpin 3.2和MestReNova 8.1
软件处理图谱及数据。
3 标准曲线绘制
配制一系列不同pH (4.5~8.5)的KH2PO4溶液,
依次移入到核磁管内, 加入分别含有D2O和MDP溶
液的毛细管后, 盖上核磁管盖, 放入核磁波谱仪中
进行测定, 以获得不同pH时的31P-NMR图谱, 得到
δ。然后, 以pH为横坐标, 不同pH值时Pi的δ为纵坐
标, 绘制标准曲线。
4 水稻培养及磷饥饿处理
粳稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica var.
Nipponbare)种子用0.66%稀HNO3处理16 h后破休
眠, 37 ℃催芽至露白, 浮在水稻营养液的尼龙网上
培养5 d后 , 转移到10 L正常水稻营养液(Ma等
植物生理学报794
2001)中培养10 d, 每3 d调一次pH值至5.5。磷饥饿
处理时, 将10 d苗龄的水稻幼苗转移到完全缺磷的
营养液中培养1、3、7 d, 再恢复为正常磷处理2 d,
其他营养元素不变。
实验结果
1 水稻根系31P-NMR谱图指认
参考相关文献(Aubert等1998; Espen等2004;
Gout等2011), 对水稻根系的31P-NMR谱的谱峰进
行了指认(图2)。水稻根系的31P-NMR谱主要由无
机磷(液泡和细胞质)、磷酸葡萄糖、磷酸果糖和
三磷酸核苷等共振峰组成。磷酸盐主要储存在液
泡中, 因此液泡磷酸盐(vac-Pi)峰最高。
2 pH值的计算
在近中性条件下, 无机磷(H2PO4
-和HPO4
2-)的
pKa约为7.2, 在
31P谱中只能看到一个共振峰, δ为这
两种无机磷离子相对浓度的平均权重(黄荣清等
1998)。pH的改变会影响这两种离子的相对浓度,
从而改变Pi的δ。分析
31P-NMR图谱中Pi的δ, 得出
数值后, 利用亨德森-哈塞尔巴尔赫(Henderson-
Hasselbach)方程式计算pH值。Henderson-Hassel-
bach方程式如下:
(1)
其中, pK1为Pi的表观解离常数, 和
分别为磷酸根在碱性和酸性环境中δ的极值, δPi为
实验测定的Pi峰的δ。以pH为横坐标, 不同pH值时
Pi的δ为纵坐标, 绘制标准曲线(图3), 将标准曲线的
不同pH值及Pi的δ代入公式(1)。然后, 用Matlab 6.5
软件计算得到公式:
(2)
图2显示, 正常条件下水稻根系细胞液泡Pi的δ
为0.64±0.01, 细胞质Pi的δ为2.60±0.03。由公式(2)
计算得到液泡内pH值为5.43±0.05, 细胞质内pH值
为7.45±0.04。本方法测定的细胞内pH值与已报道
的有关文献数据一致(Kurkdjian和Guern 1989; 周
文彬和邱保胜2004), 说明该方法结果可靠。
图2 水稻根系31P-NMR图谱
Fig.2 31P-NMR spectra of rice roots
MDP: 参考物, 亚甲基二磷酸(methylenediphosphoic acid); glc-Pi: 6-磷酸葡萄糖(glucose 6-phosphate); fru-Pi: 6-磷酸果糖(fructose 6-phos-
phate); cyt-Pi: 细胞质磷酸盐(cytoplasmic phosphate); vac-Pi: 液泡磷酸盐(vacuolar phosphate); NTP: 三磷酸核苷(nucleoside triphosphate);
UDP-glc: 尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose)。
刘于: 基于核磁共振的水稻根细胞内pH值的测定方法 795
(Glycine max cv. A2012)根系细胞中pHc和pHv分别
为7.55和5.76。此外, Gout等(2011)在使用31P-NMR
谱图分析植物细胞对缺碳的早期响应中发现, 悬
铃木(Acer pseudoplatanus)和拟南芥(Arabidopsis
thaliana)悬浮培养细胞在碳源存在的条件下, 胞质
和液泡中的pH值分别为7.40和5.20。为了更加准
确地获得培养的细胞或者某个组织中胞质和呈酸
性环境的细胞器内的pH值, Culcasi等(2015)研发出
了一系列α-氨基磷酸酯(α-aminophosphonates)化合
物, 并选用其中的DEPMPH和mito-DEP-C4检测了
D66绿藻(Chlamydomonas reinhardtii)细胞胞质中
的pH值。实验结果显示, 黑暗厌氧条件下培养的
细胞pHc为6.97和6.98, 对照内源Pi探针得到的pHc
为7.02; 当细胞在光照条件下培养时, Pi、DEP-
MPH和mito-DEP-C4作为检测探针得到的pH值分
别为7.20、7.14和7.13。本研究中, 以正常水培条
件下生长15 d的水稻根系为材料, 采用31P-NMR方
法, 计算得到了水稻根系细胞内pHc和pHv分别为
7.45±0.04和5.43±0.05, 说明水稻根部组织胞质内
pH值接近中性, 液泡内pH在5.0~6.5范围之内, 这
与有关文献(Kurkdjian和Guern 1989; 周文彬和邱
保胜2004)所报道的大多数植物细胞胞质和液泡内
的pH数值相吻合。
磷饥饿条件下水稻根系细胞内pH的变化(图
4)表明, 植物长时间缺磷后, 植物pH调控系统可能
下调, 导致pH值的降低, 是植物对于低磷胁迫的一
种应答响应, 是植物为提高磷的吸收利用等的一
系列生理、分子过程的细胞内反应或生理应急反
应; 这与柳参奎等(2004)认为细胞内pH调控系统是
植物在长期的进化过程中获得的抗逆机制的理论
一致。在逆境下, 提高细胞内pH调控系统的调控
图3 不同pH值时Pi的δ标准曲线
Fig.3 Standard curve of Pi chemical shift (δ)
under different solution pH
图4 磷饥饿条件下水稻根系细胞内pH值的变化
Fig.4 Changes of intracellular pH values in rice roots under phosphorus starvation
n=3。
3 磷饥饿条件下水稻根系细胞内pH的变化
采用该方法测定了经不同时间磷饥饿处理后
细胞内pH的变化, 结果显示, 液泡和细胞质内的pH
在缺磷处理1 d后变化不大, 但是在缺磷3和7 d后均
显著降低。细胞质内pH在缺磷7 d后比正常生长时
的pH降低了0.25左右(图4-A), 而液泡内的pH则降
低更多, 降低了约0.5左右(图4-B)。恢复供磷2 d后,
根组织细胞质内pH基本恢复到原来水平(图4-A),
但是液泡内pH依然表现为降低状态(图4-B)。
讨　　论
迄今为止, 对于利用31P-NMR技术分析植物细
胞液泡和胞质内pH值的研究仅有少量报道。其中,
Espen等(2000)在研究缺铁条件下黄瓜(Cucumis sa-
tivus)代谢方面的变化时发现, 在含0.1 mmol·L-1
Fe-EDTA的水培液中生长5、10、15 d的黄瓜根细
胞质内pH (pHc)分别为7.66、7.69和7.69, 液泡内
pH (pHv)分别为5.62、5.62和5.75。而在同样培养
情况下, Zocchi等(2007)报道具有14 d苗龄的大豆
植物生理学报796
能力能够提高植物的抗性。
总之, 直接利用31P-NMR技术测定植物根系细
胞内pH, 优点在于无损伤、技术简单及不需要培
养大量愈伤组织来获得植物细胞。此方法为研究
野生型与突变体的根系细胞内pH值的差异及在不
同胁迫条件下的细胞内pH变化提供了一条方便而
有效的途径。此外, 借助该方法, 在国内首次研究
了低磷胁迫对水稻根系组织细胞内pH的影响, 发
现长时间缺磷后水稻根系组织细胞液泡及细胞质
内pH均明显下降; 在恢复供磷后, 细胞质内pH值
会恢复到原来的水平。这将为进一步研究低磷胁
迫与细胞内pH的变化间的关系提供很好的参考。
参考文献
黄荣清, 杜泽涵, 杨志刚, 冯锐, 李光玉, 颜贤忠(1998). 31P核磁共振
观察γ-干扰素对Molt-4细胞作用后含磷代谢物及pH变化. 分
析测试学报, 17 (2): 57~59
黄荣清, 骆传环, 杜泽涵, 肖炳坤(2004). 白血病细胞的31P核磁共
振分析及用于无损伤游离镁离子测定. 分析化学, 32 (2):
129~133
柳参奎, 张欣欣, 程玉祥(2004). “植物细胞内pH调控系统”是适应
环境逆境的一个耐性机制? 分子植物育种, 2 (2): 179~186
乔娟, 黄荣清, 肖炳坤, 骆传环, 吴德雨, 赵焱, 杨建云(2005). Cos-7
细胞胞内pH的31P核磁共振测定. 分析化学, 33 (9): 1298~1300
周文彬, 邱保胜(2004). 植物细胞内pH值的测定. 植物生理学通讯,
40 (6): 724~728
Aubert S, Curien G, Bligny R, Gout E, Douce R (1998). Transport,
compartmentation, and metabolism of homoserine in higher
plant cells. Plant Physiol, 116 (2): 547~557
Culcasi M, Thétiot-Laurent S, Atteia A, Pietri S (2015). Mitochondri-
al, acidic, and cytosolic pHs determination by ³¹P NMR spectros-
copy: design of new sensitive targeted pH probes. Methods Mol
Biol, 1265: 135~147
Espen L, DellOrto M, De Nisi P, Zocchi G (2000). Metabolic respons-
es in cucumber (Cucumis sativus L.) roots under Fe-deficiency:
a 31P-nuclear magnetic resonance in-vivo study. Planta, 210 (6):
985~992
Espen L, Nocito FF, Cocucci M (2004). Effect of NO3
- transport and
reduction on intracellular pH: an in vivo NMR study in maize
roots. J Exp Bot, 55 (405): 2053~2061
Gout E, Bligny R, Douce R, Boisson AM, Rivasseau C (2011). Early
response of plant cell to carbon deprivation: in vivo 31P-NMR
spectroscopy shows a quasi-instantaneous disruption on cytoso-
lic sugars, phosphorylated intermediates of energy metabolism,
phosphate partitioning, and intracellular pHs. New Phytol, 189
(1): 135~147
Kurkdjian A, Guern J (1989). Intracellular pH: measurement and im-
portance in cell activity. Annu Rev Plant Physiol, 40: 271~303
Ma JF, Goto S, Tamai K, Ichii M (2001). Role of root hairs and lateral
roots in silicon uptake by rice. Plant Physiol, 127 (4): 1773~1780
Moon RB, Richards JH (1973). Determination of intracellular pH by
31P magnetic resonance. J Biol Chem, 248: 7276~7278
Quiquampoix H, Loughman BC, Ratcliffe RG (1993). A 31P-NMR
study of the uptake and compartmentation of manganese by
maize roots. J Exp Bot, 44 (12): 1819~1827
Roberts JKM, Ray PM, Wade-Jardetzky N, Jardetzky O (1980). Esti-
mation of cytoplasmic and vacuolar pH in higher plant cells by
31P NMR. Nature, 283: 870~872
Roby C, Martin JB, Bligny R, Douce R (1987). Biochemical changes
during sucrose deprivation in higher plant cells. Phosphorus-31
nuclear magnetic resonance studies. J Biol Chem, 262 (11):
5000~5007
Shanks JV (2001). In situ NMR systems. Curr Issues Mol Biol, 3 (1):
15~26
Stefanovic A, Arpat AB, Bligny R, Gout E, Vidoudez C, Bensimon
M, Poirier Y (2011). Over-expression of PHO1 in Arabidopsis
leaves reveals its role in mediating phosphate efflux. Plant J, 66
(4): 689~699
Zocchi G, De Nisi P, DellOrto M, Espen L, Gallina PM (2007). Iron
deficiency differently affects metabolic responses in soybean
roots. J Exp Bot, 58 (5): 993~1000