全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 1 期，2010 年 1 月9 4
收稿 2009-09-18 修定 　2009-11-15
资助 中国科学院知识创新工程重要方向项目(KSCX2-YW-N-
0 7 0、KS CX2 -Y W-G -0 3 3 )和国家杰出青年科学基金
(3 0 7 25 0 2 5 )。
* 通讯作者(E-mail: lgli@sippe.ac.cn; Tel: 021-54924151)。
桉树基因组和功能基因组
沈君辉, 宋东亮, 赵运军, 李来庚 *
中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 上海 200032
Eucalyptus Genomics and Functional Genomics
SHEN Jun-Hui, SONG Dong-Liang, ZHAO Yun-Jun, LI Lai-Geng*
Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai
200032, China
提要: 本文就桉树基因组和功能基因组的研究进展作介绍。
关键词: 桉树; 基因组; 功能基因组; 林木改良
桉树起源于澳大利亚, 现在在亚洲、南美
洲、欧洲和非洲均有种植, 是世界上种植面积最大
的阔叶树种。目前世界桉树人工林的面积为2 000
万公顷(陈少雄和吴志华 2008)。我国桉树人工林
面积在2006年就已经达到200多万公顷, 是亚洲最
大的桉树种植国(祈树雄 2006)。
桉树具有优良的遗传特性和生物质性状。首
先桉树种质遗传多样性高。迄今发现的桉属植物
超过700种(Brooker 2000), 种内和种间的生物性状
差异明显, 而且种间杂交现象普遍, 人工杂交容易,
杂种优势突出。其次桉树基因组相对较小(~650
Mbp), 这为桉树的基因组研究和分子操作提供了便
利(Grattapaglia 和 Sederoff 1994)。第三, 桉树具
有速生、纤维含量高和纤维质均一性好等特点, 可
为木材生产、纸浆生产和生物能源制备提供大量
和高质量的原材料。
在过去 20 年左右时间里, 速生人工林已成为
生产木材和纤维材料的主要途径。采用 RFLP、
AFLP、RAPD、SSR 等分子标记辅助育种方法培
育出的新树种在生长速度、木材质量、抗逆性等
方面的性状都得到了显著的提高, 极大提高人工林
的生产效率(陈考科和黄少伟 2005; 欧阳乐军和曾
富华 2008; Poke 等 2005; Grattapaglia 和 Kirst
2008)。但是进一步的提高还存在困难。随着现
代基因组学研究的深入和转基因技术的发展, 桉树
性状改良的空间也得到进一步扩大。美国能源部
和日本的有关公司已启动了桉树基因组计划。这
将为人们了解桉树生长发育的遗传基础和改良桉树
性状提供大量信息。本文就桉树基因组和功能基
因组的研究进展作介绍。
1 桉树的基因组
桉树基因组的研究主要包括: 桉树基因组测
序、大规模 EST 数据库的建立、桉树基因组表达
谱的分析等。目前巨桉已被美国能源部联合基因
组研究中心选择为模式树种对其进行基因组测序,
并将于 2010年完成(DOE 2008)。其他方面的工作
也取得了重大的进展。
1.1 大规模EST数据库的建立 桉树基因组序列的
释义依赖于EST数据库和其他基因组信息资源, 如:
拟南芥、水稻和杨树等。巴西政府于 2001 年实
施了 “ForEST”研究计划(Poke等 2005; Vicentini等
2005)。该计划的主要目标是组织多方面的研究人
员, 包括遗传学、生物化学、分子生物学、育种
学、统计学、植物病理学和木材学等, 对桉树的
改良进行多学科联合研究(Grattapaglia 2004)。计
划中的一个重要任务即是建立大规模的桉树 EST
数据库。目前已获得了数量超过15万的EST序列,
约 1.2 万个有效的基因信息, 通过对这些基因序列
的比较结合基因芯片的分析, 已鉴定了一些重要性
植物生理与分子生物学 Plant Physiology and Molecular Biology
植物生理学通讯 第 46 卷 第 1 期，2010 年 1 月 9 5
状的等位基因, 为树种的定向改良提供了重要的分
子基础。鉴于桉树具有重要的经济价值, 一些国家
的公司也投入了巨额资金开发桉树的基因组。目
前国际上至少已经建立了 5 个大规模的 EST 数据
库, 但这些数据大多不公开。在公共的 NCBI 数据
库中, 已有 15 077 个桉树基因信息。
Novaes 等(2008)运用 454 测序技术测序和整
合巨桉148 Mbp的EST, 发现其中大约有一半的基
因与拟南芥基因具有同源性, 并对转录的等位基因
变异进行了全面的分析。通过比对来自多个基因
型的序列读码, 检测到了23 742个单核苷酸多态性
(single nucleotide polymorphisms, SNPs), 其中 83%
在样品中得到了证实。这一工作为美国能源部正
在测定的巨桉基因组的释义提供了参考。Rengel
等(2009)构建了冈尼桉(E. gunnii)发育中的次生木
质部的 cDNA 文库, 同时构建了蓝桉(E. globulus)
幼树(4 年龄)和成材树(10 年龄)次生木质部的差减
文库。通过对 10 000 个 EST 进行测序、拼接, 最
终获得了3 857个与木材形成相关的EUCAWOOD
基因。这是迄今最完整的桉树木材形成相关基因
的数据库, 为桉树功能基因组研究和分子育种提供
了有价值的资源。EST 数据库的建立将为功能基
因组和蛋白组学的研究, 以及对调控桉树重要性状
的功能基因的鉴定提供了线索。
1.2 桉树木质部表达谱中关键基因的鉴定 基因组
学研究初始普遍采用抑制差减杂交法( S S H )和
cDNA-AFLP技术。近年来应用这 2种方法分离到
了一系列在桉树木质部表达的基因。
SSH 通过消减两组文库中相同的基因从而有
效地分离出 2 组不同材料中特异表达的基因。
Paux 等(2004)构建了冈尼桉次生木质部和叶片的
cDNA文库, 运用抑制差减杂交法结合芯片方法对
基因表达进行验证分析, 检测了次生木质部中的基
因表达情况, 获得了 224 个独立的 EST 序列, 其中
81% 的基因在木质部中表达。这些基因大致可以
分为两类: 与生长素信号相关和与细胞壁合成相
关。Foucart 等(2006)构建了冈尼桉木质部与韧皮
部的 cDNA 文库, 采用上述类似的方法鉴定到了
263个特异的EST序列, 其中87个基因在木质部中
特异表达, 它们参与激素信号传导、代谢、次生
壁的加厚以及蛋白质降解等过程。这些特异表达
基因的发现对深入了解木材形成的调控机制有一定
的价值。
cDNA-AFLP技术是基于RT-PCR结合图像分
析的技术对表达相对丰度的基因片段进行定量比较
分析。基因芯片法是基因组学研究后期采用的另
一种方法。通过比较不同材料中基因表达的差异
来确定与生物性状相关的特异基因。Bar ros 等
(2009)用cDNA-AFLP结合芯片技术开发了一种新
的基因型分析及表达谱分析技术, 采用该技术对 7
株木质素含量不同的巨桉的木质部组织进行了表达
谱分析, 发现了一系列表达差异明显的基因。这些
基因可能对桉树的生长具有调控作用。
1.3 桉树应力木表达谱中关键基因的鉴定 应力木
包括应拉木(tension wood)和应压木(compression
wood)。两者是直立的树干在受到风等外力的作
用下, 发生弯曲倾斜时形成的。树干上侧受到牵拉
力, 形成应拉木; 下侧受到压缩力, 形成应压木。
与正常木材相比, 应拉木纤维素含量升高, 木质素
含量降低, 而应压木则正好相反(Plomion 等 2001;
Pilate 等 2004)。应拉木和应压木具有如此特殊的
性状, 因而是一种理想的研究植物细胞壁合成调控
机制的模式系统。
Toyota 等(1997)用差减杂交的方法从赤桉(E.
camaldulensis)中分离鉴定了31个在应拉木木质部
中特异表达的 cDNA片段。Paux等(2005)用 cDNA
芯片的方法研究了蓝桉木质部中特异表达的231个
基因的变化情况。在应拉木形成的 6 小时至 1 周
的时间内, 有196个基因的表达受到不同程度的影
响。分析还发现一些基因表达的变化与木质部结
构改变相关。比如, 纤维素合酶基因的表达与应拉
木细胞胶质层(G 层)的形成有很好的相关性。Qiu
等(2008)用cDNA芯片对亮果桉(E. nitens)应拉木的
基因表达谱进行了研究, 鉴定出一批与应拉木形成
相关的基因, 这些基因与细胞壁的合成及信号转导
等过程相关。分析桉树应拉木形成过程中的转录
谱可了解到一些未知的有意义的分子, 它们参与调
节应拉木形成过程的基因网络。这可为寻找控制
木材质量的关键基因指明方向。
2 桉树的功能基因组
解析控制木材质量的关键基因是桉树功能基
因组学的目标之一。木材的质量由木材的组成、
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结构等因素决定。而这些因素又与细胞壁中的纤
维素、半纤维素和木质素三大化学组份的含量以
及排布等密切相关。解析调控三大组分合成途径
中的关键酶基因和转录因子基因的功能可以为快
速、定向地改良桉树提供分子基础, 例如为造纸工
业培育纤维素含量高、木质素含量低的树种等。
目前此项研究主要集中于对纤维素和木质素的合成
调控这两方面。另外控制桉树抗逆品质相关基因
的研究也取得了进展, 这些研究为提高桉树的抗虫
和抗病能力, 拓展桉树的种植面积和范围提供了一
定的理论基础。
2.1 纤维素合成相关基因
2.1.1 纤维素合酶 目前桉树纤维素合酶基因的研
究主要集中在分离鉴定与木材形成相关特异基因的
克隆以及表达分析方面。高等植物的纤维素合酶
(cellulose synthase A, CesA)组成纤维素合酶复合体
(cellulose synthase complex, CSC), 负责细胞壁中纤
维素的合成。不同类型的复合体合成的微纤丝在
长度、结晶度和角度上也不相同。分离和鉴定桉
树木质部中特异表达的纤维素合酶基因是解析桉树
纤维素合酶组成的前提。
Ranik 和 Myburg (2006)从巨桉中克隆了 6 个
CesA 的全长 cDNA。这 6 个基因编码的蛋白具有
CesA 蛋白所有的功能性区域, 氨基酸残基数目在
978~1 097 之间, 相似性为 61%~70%。采用定量
PCR技术分析它们表达模式的结果显示: EgCesA1~3
在次生生长组织(如木质部)中的转录丰度较高, 而
在初生生长的组织(如刚刚展开的叶片)中较低;
EgCesA4 和 EgCesA5 在初生壁的快速分化的组织
中表达上调; EgCesA6在所有的组织中的表达均较
弱。这些结果表明 EgCesA1~3 基因参与了桉树木
质部的发育。
Lu 等(2008)从巨桉中克隆了 3 个 CesA 基因
(EgraCesA1、EgraCesA2和EgraCesA3)。Northern
检测表明这3个基因在分化的木质部细胞中特异表
达。将这 3 个基因的启动子融合 GUS 基因在烟草
中检测 GUS 酶活性的结果显示: EgraCesA2 和
EgraCesA3 启动子控制的 GUS 基因在烟草茎的次
生木质部中表达。而 EgraCesA1 启动子控制的
GUS 基因则不表达。在应拉木中, EgraCesA2 和
E gr a Ce s A3 基因在木质部细胞中的表达上调。
EgraCesA1基因却没有受到机械力的影响而发生变
化。因此认为 E g r a C e s A 2、E g r a C e s A 3 与
EgraCesA1所表达的纤维素合酶都参与了桉树木质
部的形成。但是它们所组成的纤维素合酶复合体
不相同。
Creux 等(2008)对拟南芥、杨树和桉树的
CesA基因启动子进行序列比较分析的结果表明这3
种被子植物的CesA基因启动子中存在保守的顺式
调节元件, 表明在维管植物中调节纤维素生物合成
具有保守的转录网络。
深入研究木质部特异表达和受机械力影响的
纤维素合酶基因的表达以及它们所组成复合体的结
构与功能将最终阐明桉树纤维素合成的机制。
2.1.2 皮层微管 微纤丝是纤维素结构与功能的基
本单位, 它的方向和角度直接影响着木材强度和柔
韧性等品质。目前的研究表明高等植物微纤丝的
合成受到皮层微管的指导, 因此研究桉树皮层微管
蛋白基因很有意义。Spokevicius 等(2007)从巨桉
中分离和鉴定了一个在木质部特异表达的 β- 微管
蛋白基因 EgrTUB1。在枝条上侧, 微纤丝角度小,
EgrTUB1 的表达上调。在枝条下侧, 微纤丝角度
大, EgrTUB1 的表达下调。用基因干扰和过表达
的方法对 EgrTUB1基因的表达水平进行调节也发
现微纤丝的角度与 EgrTUB1基因的表达水平呈负
相关性。这项研究暗示, 微管对微纤丝角度的调节
影响到微纤丝在细胞壁中的定向, 进而可以影响到
木纤维的张力、硬度等特性, 表明微管在木材形成
中是有作用的。
2.2 木质素合成途径中的酶 木质素的含量和组成
直接影响着木材的材性及其利用。多年来, 人们一
直希望通过调控木质素的合成途径来降低木质素的
总含量, 提高 S- 木质素(syringyl lignin)和 G- 木质
素(guajacyl lignin)的S/G比例。迄今木本植物杨树
中的木质素合成代谢途径已经得到深入的研究和阐
明(Li等1997, 1999, 2000, 2001, 2005, 2006; Osakabe
等 1999)。主要有以下 8类酶参与了木质素的合成
途径: (1)苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)、(2)肉桂酸 -4-
羟基化酶(C4H)、(3)香豆酸 -3- 位羟基化酶(C3H)、
(4) 4- 香豆酸辅酶A连接酶(4CL)、(5)咖啡酰辅酶A
3-O-甲基转移酶(CCoAOMT)和5-羟基松柏醛5-O-
甲基转移酶(COMT/AldOMT)、(6)肉桂酰辅酶A还
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原酶(CCR)、(7)阿魏酸 -5-羟基化酶(F5H)/松柏醛 -
5-羟基化酶(CAld5H)、(8)肉桂醇脱氢酶(CAD)和芥
子醇脱氢酶(SAD)。其中4CL控制着植物木质素单
体的总含量。CCR 是木质素单体合成途径中第一
个特异性的酶。CAD控制G-单体木质素合成过程
中的最后一步反应。CAld5H、AldOMT和SAD控
制着 S- 木质素单体的生物合成途径。现在桉树中
的 CCR 和 CAD 基因已有了初步的研究。
C CR 催化肉桂醇辅酶 A 酯转化为肉桂醛。
La comb e 等(1 997 )克隆了冈尼桉 C CR 基因的
cDNA。分析 PromoterEgCCR::GUS 在烟草中的表达
表明, EgCCR启动子的活性在木质化的器官中最强,
如茎和根中( L a c o m b e 等 2 0 0 0 ) 。拟南芥中
PromoterEgCCR::GUS 在所有木质化细胞(导管、木
质部纤维等)中均有表达(Baghdady等 2006)。采用
启动子缺失分析和功能获得分析的结果显示-119
至-77之间的区域是茎维管组织中表达所必需的。
凝胶阻滞实验表明, 烟草茎中的核蛋白可以特异识
别这一区域(Lacombe 等 2000)。这些结果表明,
EgCCR 基因是特异性地参与冈尼桉木质部中木质
素合成的。
CAD 催化松柏醛转化为松柏醇。Feuillet 等
(1993)从冈尼桉中纯化2个CAD的同工酶(CAD1和
CAD2)的研究表明, 它们的生化功能存在差异。以
烟草的异源探针筛选冈尼桉悬浮细胞的 cDNA 文
库, 分离得到了编码 CAD2 的 cDNA。序列分析表
明, 其蛋白序列与烟草的CAD具有 78%的同源性,
与火炬松的CAD有81%的同源性。Samaj等(1998)
以免疫金定位的方法检测的结果表明, CAD2组织
定位于茎形成层细胞、射线细胞和未成熟木质部
细胞中, 亚细胞定位于内质网和高尔基体囊泡上。
Feuillet等(1995)从桉树中分离CAD2基因的基因组
序列, 并将CAD2基因的启动子与GUS报告基因融
合再以农杆菌介导转化杨树, 而后对 8个独立的转
化体进行荧光定量分析的结果表明, GUS 活性在
根、茎和叶中都有表达。进一步的 GUS 组织化
学分析表明, CAD2 的启动子在根、茎、叶的维
管系统中有较强的表达。Baghdady 等(2006)构建
并检测了PromoterEgCAD2::GUS在拟南芥中表达的结
果显示, 冈尼桉EgCAD2基因启动子在所有木质化
细胞中均有表达。Goffner 等(1998)的分子克隆和
鉴定CAD1 cDNA的结果表明CAD1在木质化和非
木质化的组织和细胞中均有表达。这些结果表明,
EgCAD2 基因在桉树细胞木质化过程中发挥作用,
是桉树木质素单体合成途径中的关键酶基因。
克隆与鉴定桉树中木质素合成途径中其他关
键酶基因(如 4CL、CAld5H 和 SAD)将有助于利用
RNAi的技术来降低桉树中木质素的含量, 提高S/G
比值, 为造纸工业和生物能源产业提供优质的原材
料。
2.3 转录因子 近年来, 桉树中控制次生生长的转录
因子基因已有了初步的研究, 主要有两类: 调控木
质素合成的 R2R3-MYB 和响应环境温度变化的
CBF。至于其他植物中已知的调控次生生长的转
录因子(如: HD-ZIPIII、NAC 等)尚无报道。
MYB转录因子是目前已知的植物中最庞大的
基因家族, 这也反映了这一家族的功能多样性。
Goicoechea等(2005)从冈尼桉中克隆了一个转录因
子基因EgMYB2, 它属于R2R3-MYB基因亚家族, 在
遗传图谱上与控制木质素含量的一个 QTL 连锁。
定量 PCR检测表明其在分化中的木质部中特异性
的表达。体外重组的 EgMYB2 蛋白能够特异性地
结合 2个木质素生物合成途径中基因CCR和CAD
的启动子的顺式调节区, 并且在烟草中能够诱导与
CCR和CAD的启动子融合的GUS基因的表达。过
量表达EgMYB2的转基因的烟草株高降低, 次生壁
加厚明显, 木质素总量没有发生明显变化, 但是 S/
G 比值升高。木质素单体生物合成途径中一些特
异的酶基因的转录丰度有着不同程度的增加。这
些表明, EgMYB2基因是通过调控木质素单体合成
途径中不同酶基因的转录而调节木质素的合成以及
植物次生细胞壁形成的。
Legay等(2007)从冈尼桉 cDNA文库中克隆了
另一个 R2R3-MYB 基因亚家族的转录因子基因
EgMYB1。研究表明, 它在桉树的根和茎的次生木
质部中优先表达。EgMYB1 蛋白定位于细胞核
内。体外条件下能够特异性地结合在木质素合成
基因 CCR 和 CAD 基因启动子的 MBSIIG 位点, 并
且在烟草中EgMYB1抑制CCR和CAD基因启动子
控制下的GUS基因的表达。实验表明, EgMYB1是
一个木质素代谢途径的负调节因子。在桉树木质
部中与转录激活子 EgMYB2 协调表达, 相互竞争,
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从而调控木质素沉积的时空特异性, 实现对木质素
生物合成和次生壁形成过程中的精细调节(Legay等
2007)。
冷害会导致细胞壁脱水伤害, 影响植物的生长
发育。由于桉树对冷较敏感, 目前其推广和种植主
要局限于南方地区。抗寒基因的分离和鉴定将有
助于桉树种植范围的扩大。冈尼桉是最耐寒的桉
树品种之一, 其成年树可以忍受低至 -18 ℃的低
温。因此, 冈尼桉抗寒基因的研究一直备受关注。
Gamboa等(2007)从蓝桉(E. globulus)中分离到一个
CBF (CRT/DRE-binding factor)的全长 cDNA克隆。
序列分析表明, 它编码一个 CBF转录激活子, 具有
CBF 蛋白的特征性的结构域。半定量 PCR分析表
明, 在蓝桉幼苗中EgCBF1的表达受低温的瞬时诱
导, 但不受盐或干旱胁迫的诱导。Kayal 等(2006)
从冈尼桉中分离鉴定出 2 个受冷诱导的 CBF 同源
基因, 分别命名为 EguCBF1a 和 EguCBF1b。序列
分析表明, 该基因的启动子和编码序列具有的CBF
转录因子的典型特征。细胞亚定位分析表明, 该基
因编码的蛋白质定位于核内。这 2 个基因对冷诱
导的速度和强度表现出明显不同的反应。
EguCBF1a在直接强烈的冷处理条件下诱导会瞬时
表达, 而EguCBF1b则在较温和的冷处理下诱导表
达, 并表现出更长的反应时间。光照条件对冷诱导
产生负效应, 在光照条件下, 这 2 个基因的诱导比
暗条件下低 3~9 倍。Navarro (2009)从冈尼桉中分
离到另外 2个CBF基因, EguCBF1c和EguCBF1d。
序列分析表明, EguCBF1c 蛋白的 AP2-DBD (AP2-
DNA结合结构域)与其他 3个CBF1蛋白有明显不
同。定量 PCR 的方法分析表明, 这 4 个基因都不
同程度地受到冷胁迫的诱导。这些 CBF转录因子
对冷处理的不同反应暗示, 它们是以互补调节的方
式应对自然环境条件下温度变化的。另外还发现
EguCBF1c 对盐胁迫和伤害胁迫也有响应, 而且相
对于冷胁迫来说, 更为敏感。这表明EguCBF1c 也
有可能在桉树盐胁迫和伤害胁迫的信号通路中发挥
一定的作用。
克隆与鉴定桉树中EgCBF转录因子下游基因
将有助于认识桉树响应冷信号、盐胁迫信号和伤
害胁迫信号的分子机制, 所以对此仍应该深入探讨。
2.4 抗病蛋白基因 桉树对许多病害敏感, 桉树抗病
性的转基因研究对于产业化种植非常重要。近年
来在桉树中已克隆了一种 PGIP 基因, 它编码一种
多聚半乳糖醛酸酶活性抑制蛋白(polygalacturonase-
inhibiting protein), 这种蛋白在植物抗病防御反应中
发挥作用。在尾叶桉(E. urophylla)、赤桉、亮果桉
和柳叶桉(E. saligna)中已得到部分序列(Chimwam-
urombe等2001), 在巨桉已得到全长序列(Bhoora等
2003)。总之, 更多的桉树抗病基因的克隆和深入
研究对今后培育具有更强抗病性的桉树来说是重要
的。
3 结语
桉树基因组的研究为发现和鉴定桉树特异的
优良性状基因提供了前提。采用比较基因组学的
方法将桉树基因组与已测序的模式物种拟南芥、
水稻和杨树基因组进行比较将有利于发现多年生木
本植物和一年生植物在发育和进化中的相关基因,
同时也可为此问题的研究提供新的视角。从而有
目的地调节这些基因的表达或者改造这些基因的功
能, 最终实现桉树的定向改良。
功能基因组的研究最终目的是用转基因的技
术调控关键基因的表达, 实现对桉树木材质量、抗
病虫性、耐冻性、耐旱性和耐盐碱特性的提高。
现在, 桉树转基因主要采用农杆菌介导的愈伤组织
转化技术, 其效率和稳定性较差, 而且受桉树基因
型的影响, 因此如何提高桉树转基因的效率还有一
系列的问题需要解决。另外, 引入一些桉树种质资
源库中的异源基因, 将会从根本上改变桉树林产品
的特性。如将 Bt基因导入桉树会有可能极大的提
高桉树的抗虫性。目前, 桉树功能基因组的研究尚
处于起步阶段, 因此如何借鉴其他物种中已知功能
的基因信息也是值得考虑的。总之, 从分子水平上
解析桉树的经济性状将可加速桉树的遗传改良, 提
高桉树生产力和木材质量以及扩展桉树的种植范
围。
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