全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 4期，2009年 4月 329
收稿 2008-11-27 修定 　2009-01-21
资助 山东省农科院博士科研启动基金(2007YBS004)、国家林业
科技支撑计划(2006BAD01A1701、2006BAD18B02)和山
东省农业良种工程项目(2005LZ07-01、2006LZ07-01)。
* E-mail: qingrongsun@hotmail.com; Tel: 0538-8282059
生长素类物质对植原体感染酸枣组培苗的影响
孙清荣 1,*, 孙洪雁 1, 王妍 2, 刘嘉芬 1, 周广芳 1, 刘庆忠 1
1山东省果树研究所, 农业部泰安温带果树资源重点野外科学观测试验站, 山东省果树生物技术育种重点实验室, 山东泰安
271000; 2山东农业大学园艺学院, 山东泰安 271000
提要: 观察生长素类物质对感染植原体病酸枣试管苗影响的结果表明: 添加外源NAA和 IBA后的病苗丛枝症状和不加生
长素类物质相似, 均表现伸长生长和梢较上部位有多个分枝梢生长, 而在培养基中添加IAA后可使病苗从其基部产生更多
丛生芽。培养 9个月后, 用NAA、IBA和 IAA处理的都没有检测出植原体病原脱除的绿苗, 也没有观察到丛生症状减轻的
病苗。
关键词: 生长素; 植原体; 酸枣; 组培苗
Effects of Auxin Analogs on Phytoplasma in Infected Sour Jujube Shoots Grown
in vitro
SUN Qing-Rong1,*, SUN Hong-Yan1, WANG Yan2, LIU Jia-Fen1, ZHOU Guang-Fang1, LIU Qing-Zhong1
1Shandong Fruits Biotechnology Breeding Key Lab, The State Agriculture Ministry Experiment Station of Temperate Fruits Germplasm
Key Outdoor Observation in Taian, Shandong Institute of Pomology, Taian, Shandong 271000, China; 2College of Horticulture,
Shandong Agricultural University, Taian, Shandong 271018, China
Abstract: Sour jujube witches’ broom is resulted from imbalance of endogeneous hormones, which is caused by
phytoplasma. In order to investigate the effects of auxin analogs on witches’ broom phytoplasma, the infected
shoots of sour jujube (Zizyphus spinosus Hu.) were used as materials. The infected shoots were treated with
exogenous auxin analogs NAA, IBA and IAA, respectively. The results showed that NAA and IBA didn’t affect
witches’ broom, and IAA promoted shoot clumps production. After the treatments of NAA, IBA and IAA for 9
months, PCR analysis of phytoplasma presence showed the pathogen of witches’ broom phytoplasma was not
been eliminated in tested shoots, remission of witches’ broom symptom was not observed in all treatments.
Key words: auxin analogs; phytoplasma; sour jujube; in vitro shoots
枣疯病是由一种专门寄生于韧皮部筛管分子的
病原——植原体引起的, 是枣树生产的一种毁灭性
检疫病害。由于植原体病原不能人工培养, 使与致
病相关的分子生物学和病害生理研究不足, 极大地
增加了枣疯病的防治难度。最新的一些研究结果
表明 , 组织培养的方法可以保存植原体病原
(Jarausch等 1996; Wongkaew和 Fletcher 2004), 也
可以通过离体再生或添加外源生长素的方法脱除病
原(Dai等 1997; Gribaudo等 2007; Mirna等 2007;
Parmessur等 2002)或茎尖培养结合超低温处理脱
除病原(Wang和Valkonen 2008)。但在组织培养中
添加外源生长素对酸枣枣疯病试管苗症状的影响未
见报道。枣疯病丛枝症状的形成是由于细胞分裂
素和生长素(C/A)的比值异常增高, 主要是细胞分裂
素含量的增加所引起(赵锦等 2006)。本文的目的
是想采用组织培养方法, 在培养基内附加不同种类
和不同浓度的生长素类物质, 研究外源生长素类物
质对酸枣丛枝病试管苗症状的影响, 为枣疯病病树
的治愈提供参考。
材料与方法
以感染植原体病(JWB)具有丛枝症状的泰山
酸枣(Zizyphus spinosus Hu.)为试材, 按照常规方法
培养试管苗, 带病试管苗在不加任何生长调节物质
的MS培养基(MS0)上保存。剪取试管苗茎尖部
分, 高度 1 cm左右, 转移到附加 IBA、IAA和NAA
的MS培养基上, 每一种生长素类物质分别取0.5、
1.0、2.0和 4.0 mg·L-1, 共设 12个处理, 每一处理
30个梢, 重复 3次, 以不加任何生长调节物质为对
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照。每一继代培养周期为 45 d, 继代培养 6次。
观察每一处理的丛枝症状并测算苗高、增殖芽梢
数和总干重。
1/2MS培养基中分别附加 IBA、IAA或NAA,
浓度均为 0.3 mg·L-1, 观察生长素类物质对丛枝病
苗生根的效应。
从经过生长素类物质处理培养的病株试管苗
的幼嫩顶梢提取总 DNA, 以健康试管苗作对照。
采用通用引物 P1 (5 aagagtttgatcctggctcaggatt 3)和
P7 (5 cgtccttcatcggctctt 3 )进行直接 PCR, 用
R16F2n (5 gaaacgactgctaagactgg 3)和 R16R2 (5
tgacgggcggtgtgtacaaaccccg 3)进行Nested-PCR (Lee
等 1998), 扩增产物用 0.8%琼脂糖凝胶电泳, 溴化
乙锭染色, 置紫外灯下检测 1.8 kb (直接PCR产物)
和 1.2 kb (Nested-PCR产物)植原体特异扩增片段
的有无。
试验结果采用DPS v3.01软件进行统计分析,
不同处理平均值用Duncan法进行多重比较分析。
实验结果
1 不同生长素类物质对酸枣丛枝病试管苗生长的
影响
通过对加IBA和NAA以及不加任何生长调节
物质的培养基上的丛枝试管苗的生长形态进行系统
调查分析的结果表明, 不同处理之间差异不明显, 都
表现出苗高, 从上部叶腋处产生腋芽梢(图 1-a~c)
(NAA资料未列出), 即都表现出枣疯病试管苗的丛
枝症状。而 IAA处理的病苗增高变差, 增殖变强,
从病苗基部产生更多的丛生芽梢(图 1-d、e)。当
浓度低于 0.5 mg·L-1时, 三种生长素类物质对病苗
症状都无明显影响(资料未列出)。而健康对照在
附加任何生长素类物质的培养基上都只表现伸长生
长而无增殖生长(图 1-f)。
2 不同浓度生长素类物质对酸枣丛枝病苗症状的
影响
IBA或NAA处理和不加生长素类物质的对照
相似, 母梢平均生长高度及其增殖后所有梢的平均
高度差异不明显(表 1)。IAA处理, 浓度在 0.5~
2.0 mg·L-1时, 和不加生长素类物质的对照差异不显
著, 但浓度由 2 mg·L-1升高到 4 mg·L-1, 母梢和所有
梢的平均高度都明显变小, 和不加生长素类物质的
对照差异显著(表 1)。这一结果反映了生长素类物
质对植物生长的两重作用, 浓度较低促进伸长生长,
浓度较高抑制伸长生长。但本文中浓度较低的生
长素类物质与不加生长素类物质的对照相比, 都不
表现对丛枝病苗伸长生长的促进作用, 这可能是病
图 1 不同生长素类物质对酸枣丛枝病试管苗的影响
Fig.1 Effects of auxin analogs on sour jujube witches’ broom shoots
a、b: 不加生长素类物质的对照病苗, a: 培养 40 d, b: 培养 130 d; c: 培养基中附加 4.0 mg·L-1 IBA; d、e: 培养基中附加 4.0 mg·L-1
IAA, d: 培养 40 d, e: 培养 130 d; f: 不加或只加生长素类物质的培养基上的健康苗。
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苗自身的内源细胞分裂素过高所致(赵锦等2006)。
IBA和NAA在较低浓度0.5和1.0 mg·L-1时, 每
个母梢增殖芽梢数比不加生长素类物质的对照显著
增加。但当浓度升高到 2.0 mg·L-1以上时, 随浓度
的增加, 增殖数下降, 增殖倍数和不加生长素类物
质的对照差异不显著。IAA处理的病苗增殖倍数
随其浓度的增加而增加, 所有加和不加生长素类物
质处理之间差异显著。1.0 mg·L-1到 4.0 mg·L-1处
理之间也差异显著, 而 0.5 mg·L-1和 1.0 mg·L-1之间
差异不显著。植物生长素类物质的生理作用是促
进细胞伸长, 对细胞分裂没影响, 而本文中 IBA和
NAA在 0.5 mg·L-1和 1.0 mg·L-1及 IAA从 0.5 mg·L-1
升高到4.0 mg·L-1时都表现出促进丛枝病苗增殖生
长的作用, 这可能是由于在培养基中附加外源生长
素类物质后丛枝病苗中异常高的C/A值趋于平衡,
形成有利于试管苗增殖生长的 C/A比值所致。因
为在组织培养中, 大多数植物包括健康酸枣的组培
快繁以细胞分裂素和生长素的适当配比最有利于增
殖(刘翠云等 1995; 代丽等 2006)。本文中健康的
对照植株最适宜增殖和伸长的培养基为MS添加
2.0 mg·L-1和 0.4 mg·L-1 IBA (资料未列出)。
3 不同生长素类物质对酸枣丛枝病苗干重的影响
IAA和较低浓度(0.5~1.0 mg·L-1)的IBA和NAA
处理与不加生长素类物质的对照相比, 其丛枝病苗
的干重显著增加(表1), 表明外源生长素类物质调节
C/A值使丛枝病苗能更好的生长, 但与已报道的甘
蔗(Wongkaew和 Fletcher 2004)和长春花(Mirna等
2007)病苗加入外源生长素类物质使部分植株病原
脱除的结果不同。因为生长素类物质处理后的病
苗经 PCR检测植原体病原仍存在(图 2)。
表 1 不同浓度生长素类物质对酸枣丛枝病苗生长高度、增殖梢数及干重的影响
Table 1 Effects of different auxin analog concentrations on plant height, shoot proliferation and
shoot dry weight of sour jujube witches’ broom shoots
生长素类物质 浓度 /mg·L-1 母梢高度 /cm 所有梢高度 /cm 增殖芽梢数 /个 增殖梢数总干重 /mg
对照 0 4.3±0.8a 2.1±0.7a 3.9±0.8ef 73.2±4.2d
IAA 0.5 4.1±1.0a 1.9±0.7ab 7.3±1.1cd 141.2±26.4c
1.0 3.6±0.9ab 1.5±0.4ab 8.3±1.3c 155.3±15.2c
2.0 3.0±0.9ab 1.5±0.6ab 14.8±1.3b 221.9±13.2b
4.0 2.3±0.6b 1.0±0.4b 17.3±1.6a 407.4±15.7a
IBA 0.5 4.3±0.7a 1.8±0.6ab 8.1±0.8cd 145.7±18.1c
1.0 3.2±0.5ab 1.5±0.4ab 6.5±0.7d 141.0±16.7c
2.0 3.2±0.6ab 1.4±0.7ab 2.7±0.7f 74.9±10.0d
4.0 3.6±0.7ab 1.5±0.4ab 3.3±0.5ef 68.9±16.9d
NAA 0.5 4.2±0.3a 1.8±0.4ab 8.1±0.6cd 134.0±5.6c
1.0 3.3±0.4ab 1.4±0.4ab 7.9±0.4cd 129.0±13.7c
2.0 3.5±0.6ab 1.6±0.2ab 4.9±1.1e 75.1±4.9d
4.0 3.4±0.4ab 1.5±0.3ab 4.2±0.9ef 71.1±11.4d
　　同一列中标有不同字母的表示差异显著(P<0 .05 )。
图 2 生长素类物质处理后和不经生长素类物质
处理的酸枣病苗植原体病原 PCR检测
Fig.2 PCR analysis of phytoplasma pathogens in infected
shoots with treatment of auxin analogs
a: 通用引物 P1/P7扩增 1.8 kb片段; b: Nested-PCR R16F2n/
R16R2扩增 1.2 kb片段。M: DNA分子量标准; 1: 不加生长素
处理的病苗; 2 : 加生长素处理的病苗; 3 : 健康对照。
4 不同生长素类物质对酸枣丛枝病苗生根的影响
据范国强等(2006)报道, IBA对泡桐丛枝病苗
生根作用明显, 根粗, 须根多, 而NAA的作用不明
显, 根细, 须根少。而本文结果是 NAA更有利于
酸枣丛枝病苗生根, 生根率高, 根粗而短, 而健康对
照形成的根细而长(图3）, 其次为IAA, 第三为IBA,
这表明植原体类型不同或侵染的植物基因型不同其
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对外源生长素类物质的反应也不同。根据 Lee等
(1998)的分类, 酸枣丛枝病的植原体为第V组B亚
组, 而泡桐丛枝病的植原体则为第 I组 D亚组。
2002), 而桑在不加任何激素的培养基上培养就可以
脱除桑矮化病(Dai等 1997)。田国忠等(2001)也报
道, 含有激素合成相关基因的根癌农杆菌接种感染
植原体的泡桐丛枝组培苗, 可使丛枝症状减轻。这
些结果都表明植原体可影响植物的激素代谢, 但在
不同的植物中其影响的作用不同(赵锦等 2006; 田
国忠等 2001)。总之, 植原体影响植物激素代谢的
机制尚不清楚, 值得深入研究。
参考文献
代丽, 王玖瑞, 刘孟军, 赵锦, 周俊义, 刘晓光, 刘彩霞(2006). 酸枣
组培快繁的影响因素. 河北农业大学学报, 29 (3): 26~28
范国强, 冯志敏, 翟晓巧, 曹艳春, 董占强, 蒋建平(2006). 植物生
长调节物质对泡桐丛枝病株幼苗形态和叶片蛋白质含量变
化的影响. 河南农业大学学报, 40 (2): 137~141
刘翠云, 张小红, 马洪明(1995). 酸枣微繁技术研究. 西北植物学
报, 15 (4): 301~306
田国忠, 朱水芳, 罗飞, 李怀方, 裘维蕃(2001). 根癌农杆菌对感
染植原体的泡桐组培苗症状的影响. 林业科学研究, 14 (3):
258~264
赵锦, 刘孟军, 代丽, 周俊义(2006).枣疯病病树中内源激素的变
化研究. 中国农业科学, 39 (11): 2255~2260
Dai Q, He F-T, Liu P-Y (1997). Elimination of phytoplasma by
stem culture from mulberry plants (Morus alba) with dwarf
disease. Plant Pathol, 46: 56~61
Gribaudo I, Ruffa P, Cuozzo D, Gambino G, Marzachi C (2007).
Attempts to eliminate phytoplasmas from grapevine clones
by tissue culture techniques. Bull Insectol, 60 (2): 315~316
Jarausch W, Lansac M, Dosba F (1996). Long-term maintenance of
nonculturable apple-proliferation phytoplasmas in their
micropropagated natural host plant. Plant Pathol, 45: 778~786
Lee I-M, Gundersen-Rindal DE, Davis RE, Bartoszyk IM (1998).
Revised classification scheme of phytoplasmas based on RFLP
analyses of 16S rRNA and ribosomal protein gene sequences.
Int J Syst Bacteriol, 48: 1153~1169
Mirna UP, Hrvoje L, Martina EM (2007). Effect of indole-3-
butyric acid on phytoplasmas in infected Catharanthus roseus
shoots grown in vitro. FEMS Microbiol Lett, 268: 171~177
Parmessur Y, Alijanabi S, Saumtally S, Dookun-Saumtally A
(2002). Sugarcane yellow leaf virus and sugarcane yellows
phytoplasma: elimination by tissue culture. Plant Pathol,
51: 561~566
Wang QC, Valkonen JPT (2008). Efficient elimination of
sweetpotato li ttle leaf phytoplasma from sweetpotato by
cryotherapy of shoot tips. Plant Pathol, 57: 338~347
Wongkaew P, Fletcher J (2004). Sugarcane white leaf phytoplasma
in tissue culture: long-term maintenance, transmission, and
oxytetracycline remission. Plant Cell Rep, 23: 426~434
图 3 NAA对酸枣丛枝病试管苗生根的影响
Fig.3 Effect of NAA on rooting of sour jujube witches’
broom shoots
讨　　论
酸枣丛枝病苗对不同的外源生长素类物质反
应不同, IBA和NAA对酸枣病苗的症状影响较小,
这和Mirna等(2007)报道的添加外源 IBA可以从长
春花病苗上脱除翠菊黄化病原(aster yellows)的结果
不同, 这可能是由于植原体病原的类型不同, 对生
长素类物质的反应也不同, 因为在Mirna的同一个
试验中添加IBA并没有从长春花上脱除榆树黄化病
(elm yellows)和蕃茄大芽病(stolbur) (Mirna等
2007)。
外源生长素类物质 IAA导致酸枣丛枝病苗产
生更多的丛生芽梢, 其表现类似于细胞分裂素的增
殖作用。在组织培养中, 大多数植物包括健康酸枣
的组培快繁以细胞分裂素和生长素的适当配比最有
利于增殖(刘翠云等1995; 代丽等2006), 本文中IAA
促进枣疯病苗从基部产生更多的丛生苗, 可能是由
于外源 IAA可促使枣疯病苗中细胞分裂素和生长
素(C/A)的异常高的比值降低并趋于正常, 因而IAA
表现出促进酸枣丛枝病苗的试管苗的增殖生长。
而IBA和NAA没有表现调节C/A值的作用, 表明不
同的植物基因类型或感染的植原体病原的类型不同
对外源生长素类物质的反应也不同。NAA和ABA
的使用可以减轻泡桐丛枝病症状(范国强等 2006),
2,4-D可以脱除甘蔗的甘蔗黄化病(Parmessur等