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‘嘎拉’苹果多酚氧化酶基因MdPPO的克隆与表达分析



全 文 :植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (8): 803~810 803
收稿 2013-04-15  修定 2013-06-08
资助 国家苹果产业技术体系项目(CARS-28-01-07)、山东省良
种产业化工程项目(620902)、青岛市科技计划基础研究项
目[12-1-4-5-(1)-jch]和山东省教育厅项目(J10LC12)。
* 通讯作者(E-mail: hydai@qau.edu.cn; Tel: 0532-86080752)。
‘嘎拉’苹果多酚氧化酶基因MdPPO的克隆与表达分析
马长青1, 柏素花2, 戴洪义1,*
青岛农业大学1园艺学院, 2生命科学学院, 山东青岛266109
摘要: 多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)被认为是植物的防卫蛋白。为获得苹果中多酚氧化酶基因序列信息及其表达
情况, 运用RACE技术从苹果品种‘嘎拉’中克隆、鉴定了一个PPO基因, 命名为MdPPO (GenBank登录号为KF032055)。
MdPPO全长2 022 bp, 包含一个1 851 bp的开放阅读框, 编码包含616个氨基酸残基的蛋白质。利用荧光定量PCR技术检测
MdPPO的表达, 发现在‘嘎拉’苹果的幼茎、幼叶、花瓣、枝皮等组织中均有表达, 在幼叶中的表达量最高, 在花瓣中的表
达量最低。不同非生物胁迫及激素处理的时序表达分析表明, NaCl、低温均可显著诱导MdPPO表达, 而H2O2能诱导其持
续上调表达; 水杨酸、脱落酸、茉莉酸、乙烯等可诱导其上调表达, MdPPO对水杨酸和乙烯的响应最早, 这一表达模式暗
示MdPPO可能参与多种非生物胁迫过程, 且不同胁迫因素诱导MdPPO表达的信号转换过程可能存在差异。
关键词: ‘嘎拉’苹果; 多酚氧化酶; 基因克隆; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of Polyphenol Oxidase Gene (PPO) Identified
from ‘Gala’ Apple
MA Chang-Qing1, BAI Su-Hua2, DAI Hong-Yi1,*
1College of Horticulture, 2College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China
Abstract: In order to obtain the full-length sequence of polyphenol oxidase gene (PPO) and investigate its ex-
pression, we cloned PPO gene (named as MdPPO) from leaves of ‘Gala’ apple (Malus domestica) using RACE
technique. The cDNA of MdPPO had a length of 2 022 bp and contained an opening-reading frame (ORF) of
1 851 bp, which was supposed to encode a 616 amino-acid residues polypeptide of 166.5477 kDa. Quantitative
real-time PCR experiment revealed that MdPPO expressed in young stem, young leaf, flower and bark. The
highest mRNA expression was found in young leaf, and the lowest in flower. It was speculated that MdPPO
gene might be involved in the defense of apple leaf against stress. We also investigated the responses of MdPPO
expression to abiotic stresses and hormone treatments using quantitative real-time PCR. The results showed that
MdPPO expression was obivously induced by NaCl and cold stress, while, MdPPO up-expression was
continously enhanced by hydrogen peroxide (H2O2). Abscisic acid (ABA), salicylic acid (SA), ethylene (ETH)
and jasmonate (JA) also had inductive effects on MdPPO up-expression, but MdPPO expression was increased
rapidly by ethylene and salicylic acid. It seems to be possible that MdPPO gene might be involved in various
abiotic stresses; the processes of the signal transduction were probably different in diverse stresses.
Key words: ‘Gala’ apple (Malus domestica); polyphenol oxidase; gene clone; expression analysis
多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)是一种
金属铜蛋白, 催化酚类物质转化为醌类物质(王曼
玲等2005), 后者能直接杀灭病原菌, 在植物的防御
反应中发挥积极作用。PPO还可通过催化木质素
及醌类化合物形成, 构成保护性屏蔽而使细胞免
受病菌的侵害。在高等植物中, PPO与底物存在着
空间上的分隔, PPO存在于质体内囊体, 它的底物
存在于液泡中, 只有当植物受到伤害, 例如遇到食
草动物的啃食、机械损伤、病原物入侵等打破隔
离, PPO才能与底物相互接触作用, 对植物起到保
护作用(许传俊和李玲2002)。Steffens JC将马铃薯
PPO基因转移到番茄植株中, 将病原菌Pseudomonas
Syringae pv. tomato接种转化植株, 发现转化植株
比对照具有显著增强的抗性, 认为PPO可用于植物
抗病性的遗传改良(Thipyapong等2004)。
植物生理学报804
目前PPO的编码基因已在多种植物中被克
隆、鉴定。这些已鉴定的PPO基因主要在果实、花
和叶中表达(Hunt等1993; Nandi等2003; Thipyapong
等1997)。尽管PPO基因广泛的存在于植物体中,
但只有在植物体受损伤的部位其活性才有所上调,
因此PPO被认为是植物的防卫蛋白(Constabel等
1995; Pinto等2008; Stewart等2001; Thipyapong等
1995)。Boss等(1995)发现病虫害的侵袭也能诱导
PPO基因的表达, 证明了PPO基因在植物防御反应
中发挥重要作用。苹果是我国的主要果树之一,
栽培面积和产量均居世界第一位 (刘超超等
2011)。苹果会遭遇各种病原细菌、真菌、虫害和
病毒等的侵袭, 造成产量和质量的下降。挖掘苹
果基因组中与抗性相关的基因用于遗传改良, 对
苹果产业的发展具有积极意义。本研究从苹果中
分离、鉴定了一个完整的PPO基因并对其在逆境
条件下的表达进行了分析, 以期探索该基因与苹
果植物抗逆境之间的关系。
材料与方法
1 植物材料及其处理
试验所用的植物材料为‘嘎拉’苹果(Malus do-
mestica. Gala), 2011年5~7月期间于青岛农业大学
胶州实验农场的温室中分别摘取盆栽培养的5棵
树上的幼叶、幼茎、枝皮、花瓣, 置于液氮中冷
冻后, 于–70℃保存, 用于目的基因的克隆及组织
表达分析。
环境胁迫处理试验选用的是通过茎尖培养获
得的‘嘎拉’组培苗进行。组培苗的培养按本实验
室以前报道的方法(柏素花等2012)进行。
胁迫处理试验方法为: 选择10 mg·L-1 H2O2、4
℃、250 mmol·L-1 NaCl、1 μg·L-1水杨酸(salicylic
acid, SA)、0.05 mmol·L-1茉莉酸(jasmonate, JA)、
100 μmol·L -1脱落酸(abscisic acid, ABA)、1
μmol·L-1 1-氨基环丙烷1-羧酸(1-aminocyclopro-
pane-1-carboxylate, ACC)分别处理‘嘎拉’组培苗叶
片, 于处理后0、4、8、12、24、36和48 h后取样,
提取总RNA, 分析基因表达。每个时间点设3次重
复, 每次采用1株用于各种胁迫下的MdPPO的相对
表达量分析。
2 PPO cDNA全长序列克隆
采用原平皓(天津)生物有限公司的EASYspin
植物RNA快速提取试剂盒提取苹果幼叶的总
RNA, 按说明书反转录成cDNA, 放置于–20 ℃冰
箱中备用。
以杨树(Populus trichocarpa) PPO蛋白的氨基
酸序列作为探针, 搜索苹果基因组数据库, 将所获
得的基因组序列用FGENGSH软件预测其编码区,
根据编码区序列设计引物MdPPO-FB和MdPPO-
RB (表1)进行扩增。测序后, 根据得到编码区中间
片段设计引物MdPPO-FA和MdPPO-RA, 进行目标
基因5′端片段的PCR扩增, 利用RACE技术扩增目
标基因的3′末端。为方便进行3′ RACE反应, 反转
录引物在Oligo (dT)的5′端连接一个Adaptor接头序
列(表1)。3′ RACE的上游引物为MdPPO-FC, 以接
头序列Adaptor作为下游引物, 以合成的带接头的
第一链cDNA为模板, 扩增获得基因3′ cDNA末
端。引物交由上海生工生物工程技术服务有限公
司合成。PCR反应程序: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃
变性30 s, 58 ℃ 退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 扩增32
表1 试验中使用的引物
Table 1 Primers used in this study
引物类型 引物名称 引物序列(5′→3′)
5端片段扩增引物 MdPPO-FA ATGTGTACGGCCTGCCACCT
MdPPO-RA CAATAGGCACAGTGGAG
中间片段扩增引物 MdPPO-FB CTCCACTGTGCCTATTGC
MdPPO-RB TTTGATGCTACCGATCTTAA
3端片段上游引物 MdPPO-FC GATGTGGCTGTGAAGTTTGA
3端下游接头序列 Adaptor CATGACTAGTCGGACTGAAC
荧光定量RT-PCR引物 RT-PPO-F AACGGCACGGATGAAACAAT
RT-PPO-R GGGCGAACCAAAGAACAACA
内参引物 MdActin-F1 CTGAACCCAAAGGCTAATCG
MdActin-R1 ACTGGCGTAGAGGGAAAGAA
马长青等: ‘嘎拉’苹果多酚氧化酶基因MdPPO的克隆与表达分析 805
个循环; 72 ℃延伸10 min。用大连宝生物工程有
限公司的胶回收试剂盒回收目的片段, 与pMD18T
载体连接, 阳性克隆交由上海生工生物工程股份
有限公司测序。
3 生物信息学分析
使用DNAMAN6.0 软件对得到的5′片段, 中间
片段和3′ RACE片段进行拼接, 得到该基因全长序
列, 用ORF Finder分析开放性阅读框; 运用Prot-
Param tool (http://www.expasy.org/tools/)和PBIL
LYON-GERLAND软件分别分析氨基酸基本成分
和对MdPPO进行二级结构预测; 采用蛋白质专家
分析(http://www. expasy. org/)网站对蛋白质的结构
特征进行分析。蛋白的修饰性位点及蛋白质结构域
的预测在ExPASy网站(www.expasy.org)和SMART
网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)上进行。构
建系统进化树是利用MEGA 5 .0软件Tamura等的
NJ算法(Tamura等2007), Bootstrap值取为1 000。
4 实时定量PCR
用罗氏LightCycler 480系统定量分析MdPPO
基因的表达。分别提取‘嘎拉’苹果树的幼叶、幼
茎、枝皮、花瓣等的RNA, 反转录后得到的cDNA
作为实时荧光定量PCR的模板。每一个cDNA模
板分别同时扩增MdPPO基因和β-actin基因, 每个
样品均进行3次重复试验。在拼接序列的完整阅
读框(ORF)内设计荧光定量引物RT-PPO-F和RT-
PPO-R, 内参基因的引物为MdActin-F1和MdActin-
R1 (表1)。MdPPO相对表达量按Livak和Schmitt-
gen (2001)的2-△△Ct法进行数据分析。所有的数据
都以相对mRNA表达量表示, 并经过单因素方差分
析和Duncan’s检验(柏素花等2012)。
实验结果
1 MdPPO的克隆和序列分析
通过搜索苹果基因组数据库(http://www.rosa-
ceae.org/gb/gbrowse/malus_x_domestica/), 获得了
与杨树PPO基因(AEH41424.1)同源的苹果基因组
DNA序列(ACYM01129445.1), 根据此序列设计基
因特异性引物, 以苹果幼叶cDNA为模板利用RACE
技术获得基因2 022 bp全长cDNA序列, 命名为
MdPPO (GenBank登录号为KF032055)。基因全长
cDNA序列包括1 851 bp的开放阅读框, 编码1条含
616个氨基酸的多肽链, 分子量为166.5477 kDa, 等
电点pI为4.91, 分子式为C6041H10060N2024O2489S489, 无
信号肽序列。基因的3′端有PolyA结构, 5′端有96
bp非编码区 , 基因序列如图1所示。利用NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.
cgi) 提供的蛋白结构域在线分析方法, 对MdPPO
进行保守功能域分析发现, 其氨基酸序列中180~
389区域与酪氨酸酶超级家族的核心序列高度同
源, 具有PPO蛋白典型的特征, 含PPO1_DWL (多酚
氧化酶中间域, 含有一个保守的DWL基序)和PPO1_
KFDV两个结构域。进一步对苹果多酚氧化酶序
列进行蛋白修饰位点预测, 发现其氨基酸序列中
211~228区域(序列为HQSWLFFPFHRYYLYFHE)
有1个酪氨酸CuA结合位点, 369~380区域(序列为
DPIFFSHHSNID)具有1个酪氨酸酶CuB结合位
点。这两个位点的位置与酪氨酸酶超级家族相对
应, 且具有典型家族成员的特征。
2 MdPPO同源性及系统演化分析
利用Blast工具在NCBI网站的蛋白质数据库
中分析MdPPO与其他蛋白的同源性, 发现MdPPO
与其他植物的多酚氧化酶有较高的同源性(图2)。
同源性最高的为蔷薇科、苹果亚科植物鸭梨PbP-
PO, 相似氨基酸达到85.29%, 表明同亚科内不同植
物之间PPO序列有较高的同源性。与其他科植物
比如莲科植物荷花NnPPO相比, 相似氨基酸达到
59.39%, 表明不同科之间, PPO的同源性也相对较
高。由图3的系统进化树也可看出, 该基因与同亚
科内鸭梨(ADF59059.2)、砂梨(BAB64530.1)等植
物的PPO基因距离较近, 与鼠李科植物枣(ADR-
78836.1)、山茶科植物金花茶(ACM43505.1)、木
犀科植物橄榄(AEY78528.1)等植物的PPO基因的
遗传距离也相对较近(图3)。
3 MdPPO组织表达特性分析
为了解MdPPO基因在不同组织和器官的表达
情况, 用荧光定量PCR技术分析‘嘎拉’苹果幼叶、
幼茎、枝皮和花瓣中MdPPO的相对表达量(图4),
发现在不同组之间MdPPO基因的表达存在显著差
异(P<0.05), 其中花瓣中MdPPO相对表达量最小,
其次是枝皮; 幼茎中MdPPO的相对表达量较大, 幼
叶中MdPPO的表达量最大, 为花中的8.6倍。
4 H2O2、NaCl及低温胁迫对苹果叶片MdPPO基
因表达的影响
为了解MdPPO基因在苹果抗逆境中的功能,
植物生理学报806
分别用不同逆境胁迫处理‘嘎拉’苹果组培苗, 并用
荧光定量PCR技术分析MdPPO基因的表达。实验
结果显示(图5), 叶片中MdPPO的本底水平表达较
低, 但在250 mmol·L-1的NaCl、10 mg·L-1的H2O2、及4
℃低温处理后, MdPPO表达均被显著上调, 但峰值
的出现时间, 在不同的逆境处理组上存在差异。
图1 MdPPO的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
Fig.1 Nucleotide sequences of MdPPO gene and deduced amino acid sequences by MdPPO protein
a、b、c、d、e五部分分别代表酪氨酸酶超级家族的核心序列、PPO1_DWL序列、PPO1_KFDV序列、酪氨酸CuA结合位点、酪氨
酸酶CuB结合位点,*代表终止密码子。
马长青等: ‘嘎拉’苹果多酚氧化酶基因MdPPO的克隆与表达分析 807
图2 MdPPO与其他物种PPO基因的氨基酸序列的同源性比较
Fig.2 Alignment of the predicted amino acid sequences of MdPPO and other PPOs
a、b、c三部分分别代表PPO1_DWL序列、酪氨酸CuA结合位点、酪氨酸酶CuB结合位点。 蛋白名称和序列号如下: MdPPO (苹果,
KF032055), PbPPO (鸭梨, ADF59059.2), CnPPO (金花茶, ACM43505.1), NnPPO (荷花, ADC92563.1), FpPPO (草莓, ADI44161.1), PsPPO (油
木奈, AAW65103), ToPPO (蒲公英, CAQ76694.1)。
植物生理学报808
NaCl处理MdPPO表达量于24 h达最高水平, 为对
照的6.4倍(P<0.05)。在被检测的时间段内, H2O2可
诱导MdPPO持续上调表达, 处理后MdPPO表达量
于48 h达最高水平, 为对照的5.6倍(P<0.05)。4 ℃低
温处理, MdPPO基因表达于处理8 h达最大值, 为
对照的2.6倍(P<0.05)。暗示MdPPO表达对H2O2、
NaCl、4 ℃处理的响应机制可能存在差异。
5 外源SA、JA、ACC、ABA对苹果叶片MdPPO
相对表达量的影响
JA、SA、ETH和ABA是植物体内响应逆境
胁迫的重要信号分子, ACC为ETH生物合成的直
接前体。为了解MdPPO基因表达是否与这些信号
分子相关, 用1 μg·L-1 SA、0.05 mmol·L-1 JA、100
μmol·L-1 ABA和1 μmol·L-1ACC处理苹果组培苗叶
片, 发现这几种外源的信号分子均可诱导‘嘎拉’叶
片MdPPO相对表达量显著增加(P<0.05), 峰值和对
照相比分别增加2.3、7.3、12.6和5.7倍(图6)。JA
诱导MdPPO的相对表达量最高值出现在8 h, 而后
降低; ABA处理后MdPPO的相对表达量于36 h达
到最高值; MdPPO对SA和ACC反应迅速, 都在4 h
达到最高值, 之后逐渐降低。
讨  论
大量研究表明, 植物体内的多酚氧化酶是由
图3 MdPPO蛋白系统进化树分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of MdPPO proteins
图4 MdPPO在苹果各组织和器官中的表达
Fig.4 The expression of MdPPO in different tissues and
organs of apple
不同字母表示差异达显著水平(P<0.05), 图5和图6同此。
马长青等: ‘嘎拉’苹果多酚氧化酶基因MdPPO的克隆与表达分析 809
多基因控制的金属蛋白酶, 表现出多基因的家族
性(王曼玲等2005)。本试验以苹果品种‘嘎拉’为材
料, 克隆得到MdPPO cDNA序列, 序列分析证实
MdPPO编码的氨基酸序列与其他物种同源性很
高 , 具有PPO1_DWL序列、酪氨酸CuA结合位
点、酪氨酸酶CuB结合位点, 该基因编码的氨基酸
序列包含1个由209个氨基酸残基组成的酪氨酸酶
超级家族保守结构域, 属于PPO家族中的酪氨酸
酶。BLAST比对表明, MdPPO的氨基酸序列与鸭
梨PbPPO序列最为接近, 相似性达到85.29%。进
一步分析发现, MdPPO在‘嘎拉’幼叶中表达量最
高, 幼茎、枝皮、花瓣中表达相对较低。
苹果的各种生理活动、生化反应及生长发育
等过程, 都必须在一定的温度和适宜的酸碱度条
件下才能进行。否则, 其正常生长发育就会受抑、
受阻、受害甚至死亡。低温和盐害是苹果生产中
的重要限制因素, MdPPO可响应低温和盐胁迫迅
速上调表达, 推测其参与了低温和盐胁迫。在以
图5 低温(A)、NaCl (B)、H2O2 (C)和处理后MdPPO在苹果幼叶的表达
Fig.5 The expression of MdPPO in young leaves of apple after treatment with low temperature (A), NaCl (B) and H2O2 (C)
图6 SA (A)、JA (B)、ABA (C)和ACC (D)处理后MdPPO在苹果幼叶中的表达
Fig.6 The expression of MdPPO in young leaves of apple after treatment with SA (A), JA (B), ABA (C) and ACC (D)
植物生理学报810
前的报道中, Tamura等(2007)和胡庆辉(2012)曾分
别发现, 在菠萝和烟草中PPO同样参与了低温和盐
胁迫。H2O2是近期发现的应答逆境信号分子, 参
与植物对许多逆境的适应过程(Leon等1995)。本
研究表明用外源H2O2处理‘嘎拉’苹果的PPO基因
可显著诱导MdPPO表达, 暗示H2O2参与了MdPPO
应答逆境的信号转换过程。但MdPPO表达对NaCl
和4 ℃低温反应较为迅速, 而对H2O2反应较慢, 可
能与不同胁迫因素诱导MdPPO表达的信号转换过
程存在差异有关。SA、JA、ETH和ABA是重要的
逆境适应激素, 均可诱导拟南芥、葡萄等植物的
抗病基因表达(Nandi等2003; 侯丽霞等2012)。并
且四者之间存在信号网络交叉, 例如在植物抵御
病原菌浸染过程中, ABA作为一种信号可以影响
JA的生物合成并且激活拟南芥的抗性(Adie等
2007)。SA、JA和ETH在植物抗病信号转导途径
中既有协同作用也有拮抗作用。在拟南芥中可以
同时激发依赖SA的SAR途径和JA/ETH依赖的ISR
途径,并提高对P. syringae pv. tomato的抗性(Wan等
2002)。本文研究表明SA、JA、ACC和ABA对
MdPPO表达也有诱导作用, 且MdPPO对SA和ACC
的响应最早, 推测MdPPO对ABA和JA处理的响应
可能需要内源SA和ETH的累积或与SA和ETH调控
途径中与二者响应基因的互作, 最终引起MdPPO
表达量变化。
本试验从‘嘎拉’苹果中克隆分离得到了一个
PPO同源基因MdPPO, 试验结果表明MdPPO可被
NaCl、4 ℃等多种胁迫以及SA等多种激素和H2O2
等信号物质诱导, 这些过程的联系和相互作用有
待进一步探讨。
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