全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (2): 137~143 137
收稿 2012-09-26　　修定 2012-12-24
资助 上海市农业科技转化项目(农科转字2011第1-1号)。
* 通讯作者(E-mail: shiyimin@sjtu.edu.cn; Tel: 021-34206594)。
低温解除休眠过程中喇叭水仙鳞片中酚酸类物质代谢及相关酶活性的变化
程鹏, 马晓红, 史益敏*
上海交通大学农业与生物学院, 上海200240
摘要: 测定了低温解除休眠过程中喇叭水仙‘上农早春’鳞片内酚酸类物质的成分和含量变化, 以及与酚酸代谢相关的多酚
氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性变化, 结果表明, 总酚含量呈下降趋势; 在检测到的没食子酸、绿原酸、4-羟
基苯甲酸、3,4-二羟基肉桂酸、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸5种酚酸类物质中, 4-羟基苯甲酸含量最高; 酚酸类物质含量与PPO
活性呈负相关, 与PAL活性呈正相关。酚酸类物质含量下降可能是喇叭水仙休眠解除的机制之一。
关键词: 喇叭水仙; 休眠; 酚酸类物质; 苯丙氨酸解氨酶; 多酚氧化酶
Changes of Phenolic Acid Metabolism and Related Enzyme Activities in Narcis-
sus pseudonarcissus L. Bulbs Stored at Low Temperature for Dormancy Release
CHENG Peng, MA Xiao-Hong, SHI Yi-Min*
School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China
Abstract: Changes of phenolic acids and activities of polyphenol oxidase (PPO) and phenylalanin ammonia-
lyase (PAL) were studied in Narcissus pseudonarcissus var. ‘Shangnong Zaochun’ bulbs stored at 7 ℃. Results
indicated that total phenolic content decreased dramatically during the low temperature storage. Five phenolic
acids (gallic acid, chlorogenic acid, 4-hydroxybenzoic acid, 3,4-dihydroxycinnamic acid and 4-hydroxy-3-
methoxybenzoic acid) were identified in narcissus bulbs. The content of 4-hydroxybenzoic acid was the highest
during the dormancy release. Negative correlation existed between total phenolic content and PPO activity,
while positive correlation was observed between total phenolic content and PAL activity. The decrease of phe-
nolic acid content may be one of the mechanisms of narcissus dormancy release.
Key words: Narcissus pseudonarcissus; dormancy; phenolic acids; phenylalanin ammonialyase; polyphenol
oxidase
喇叭水仙为石蒜科水仙属多年生草本植物,
作为著名球根花卉而被广泛栽培, 不仅极具观赏
性, 也具有一定的药用价值(吴艳涛等2009)。目前,
由荷兰进口的喇叭水仙品种在国内大量种植, 与
中国水仙相比, 喇叭水仙鳞茎的花芽具有休眠特
性, 其种球需经一定的低温过程才能萌发生长。
李小方等(2009)研究发现, 15 ℃温度处理一定时间
可解除中国水仙休眠, 而武文琪等(2007)的研究表
明, 喇叭水仙鳞茎须经7~9 ℃低温处理8周才可解
除种球休眠, 从而正常出苗、生长、开花。
酚酸类物质为次生代谢产物, 在植物体内广
泛分布, 通常以自由酸、糖苷或糖脂类存在于液
泡中, 在植物抗病、化感作用、抗氧化、植物生
长调节等方面起重要作用(Wojdyło等2008)。关于
酚酸类物质与植物休眠的关系已有研究(Cevallos-
Casals和Cisneros-Zevallos 2010), 然而, 目前有关
酚酸类物质与水仙解除休眠的关系尚未见报道。
本研究对‘上农早春’水仙鳞茎在低温解除休眠过
程中酚酸类物质的种类、含量及相关酶活性的变
化进行了探讨, 以期为阐明喇叭水仙休眠机制提
供理论依据。
材料与方法
1 植物材料
以上海交通大学选育的喇叭水仙(Narcissus
pseudonarcissus L.)新品种‘上农早春’为试验材
研究报告 Original Papers
植物生理学报138
料。选取周经12 cm健康无病害、鳞片抱合紧密
的种球, 采收后清理干净, 用50%多菌灵可湿性粉
剂800倍液消毒, 2011年9~11月期间分别在7 ℃和
室温下贮藏8周, 每周取样。随机选取3个种球, 剥
取中层鳞片, 加入液氮, 研磨成粉末后充分混匀,
放入−80 ℃超低温冰箱中保存备用。
2 方法
2.1 总酚的提取与测定
总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu法(Sin-
gleton等1999)。
2.2 酚酸类物质的定性和定量分析
2.2.1 酚酸类物质提取 采用Ferreres等(2008)的方
法并稍加改进。取处理0、2、4、6、8周的喇叭
水仙鳞片0.5 g, 置于研钵中, 加入20 mL 80%色谱
甲醇匀浆后转入离心管, 30 ℃超声30 min, 在5 ℃
下12 000×g离心15 min。取上清液, 加入10 mL的4
mol·L-1 NaOH溶液, 室温避光孵化4 h, 用4 mol·L-1
HCl调pH至2.0, 在酸化的提取液中2次加入20 mL
色谱纯乙酸乙酯萃取, 静置分层, 取上层清液, 转
入真空干燥箱中35 ℃真空干燥, 待乙酸乙酯挥发
完全后加入10 mL 80%甲醇溶解。上样前 , 用
0.22 μm微孔滤膜过滤。
2.2.2 色谱条件 采用美国Waters公司的超高效液
相色谱-飞行时间质谱联用仪。色谱柱: ACQUITY
UPLC BEH C18柱 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm); 流动
相: A液为0.1%甲酸水溶液, B液为乙腈; 梯度洗脱
条件为: 0~8 min, B液1%~99%; 8~10 min, B液
99%~1%; 流速: 0.4000 mL·min-1; 柱温: 30 ℃; 进样
量: 10 μL; 检测波长: 280 nm。
2.2.3 质谱(MS)条件 采用电喷雾(ESI)负离子扫描
模式, 扫描范围为质荷比(m/z) 0~600。毛细管电
压: 3.0 kV; 锥孔电压: 30 V; 提取锥电压3 V; 光电
倍增电压: 650 V; 锥孔气流量: 50 L·h-1; 脱溶剂气
流量: 600 L·h-1; 离子源温度: 100 ℃; 脱溶剂气温
度: 300 ℃; 碰撞气氩气流速0.30 mL·min-1; 灵敏度:
2.000 AUFS; MS扫描时间: 0.300 s; 内扫描时间:
0.020 s; 检测波长: 280 nm。
2.2.4 酚酸类物质的定性分析 采用飞行时间质谱
(time-of-flight mass spectrometry)结合参考文献的
方法(Fan等2012)进行。
2.2.5 酚酸类物质的定量分析 含量测定均以没食
子酸标准品(购自国家标准物质中心)为标样, 其标
准曲线方程为y=0.1409x−0.6354 (R2=0.9980), 采用
外标法定量, 计算不同贮藏温度下喇叭水仙鳞片
中所含不同种类酚酸物质的含量, 单位以μg·g -1
(DW)表示。
2.3 多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)的提取
与测定
采用Keenan等(2012)的方法。
2.4 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonialyase,
PAL)的提取与测定
采用王敬文和薛应龙(1981)的方法。
2.5 数据分析
试验数据使用Excel软件整理并作图, SAS 9.1
软件进行统计分析, 统计方法采用One-Way ANO-
VA (P<0.05)和Duncan’s新复极差法检验分析。
实验结果
1 不同贮藏温度下喇叭水仙鳞片中总酚含量的变化
由图1可知, 两种贮藏温度下喇叭水仙鳞片中
总酚含量有不同程度的降低, 且7 ℃贮藏的下降幅
度明显大于室温下的。其中, 室温下总酚含量由
贮藏前的21.81 μg·g-1 (DW)降低至第8周的18.04
μg·g-1 (DW), 下降了17.3%, 前4周为快速下降期, 后
期趋于稳定; 7 ℃下贮藏8周, 总酚含量下降到15.29
μg·g-1 (DW), 下降幅度达29.9%, 除第3周略有回升
外, 整个贮藏过程一直处于下降趋势。差异显著
性检验显示, 7 ℃与室温贮藏不同时间的喇叭水仙
鳞片中总酚含量差异显著。
2 不同贮藏温度下喇叭水仙鳞片中酚酸类物质定
性和定量分析
喇叭水仙鳞片中酚酸类物质经色谱分析, 共
图1 不同贮藏温度下喇叭水仙鳞片中总酚含量的变化
Fig.1 Changes of total phenolic content in N. pseudonarcissus
bulbs stored at different temperatures
不同字母表示不同处理差异显著(P<0.05)。
程鹏等: 低温解除休眠过程中喇叭水仙鳞片内酚酸类物质代谢及相关酶活性的变化 139
图2 不同贮藏温度下喇叭水仙鳞片中酚酸类物质的液相色谱图
Fig.2 Ultra performance liquid chromatogram of phenolic acids in N. pseudonarcissus bulbs stored at different temperatures
A: 室温; B: 7 ℃。检测波长: 280 nm。UI: 未鉴定。
植物生理学报140
分离出7种物质, 出峰时间分别为: 2.90、3.02、
3.25、3.35、3.42、3.60、3.65 min (图2)。经质谱
分析, 确定了其中5种物质的成分(图3和表1)。峰1:
[M-H+]- m/z为169.7, 碎片离子m/z 125.2 (图3-A), 由
分子离子丢失一个羧基形成, 根据Gruz等(2008)的
报道, 推断为没食子酸; 峰2: [M-H+]- m/z为353.2,
碎片离子m/z 190.6 (图3-B), 为分子离子羧基断裂
丢失一个3,4-二羟基肉桂酸基团形成, 结合田晨煦
等(2007)的报道, 推断为绿原酸; 峰3: [M-H+]- m/z为
136.7, 碎片离子m/z 92.5 (图3-C), 为分子离子丢失
一个羧基形成的碎片, 结合Gruz等(2008)的报道,
推断为4-羟基苯甲酸; 峰4: [M-H+]- m/z为179.0, 碎
片离子m/z为161.0和134.8 (图3-D), 前者由[M-H+]-
m/z 179.0失去一个羟基而形成, 后者则是m/z 161.0
失去一个羰基形成, 结合Gayosso-García等(2011)
的报道, 推断为3,4-二羟基肉桂酸; 峰5: [M-H+]- m/z
为167.1, 碎片离子m/z为151.6和107.1 (图3-E), 前
者由[M-H+]- m/z 167.1丢失一个氧而形成, 后者是
m/z 151.6丢失一个羧基所得, 结合Gruz等(2008)的
研究结果, 推断为4-羟基-3-甲氧基苯甲酸。另外2
个峰尚未鉴定, 有待进一步研究。
表2显示, 两种贮藏温度下喇叭水仙鳞片中5
图3 喇叭水仙鳞片中酚酸类物质负离子模式质谱图
Fig.3 Negative mode mass spectrum of phenolic acids in N. pseudonarcissus bulbs
程鹏等: 低温解除休眠过程中喇叭水仙鳞片内酚酸类物质代谢及相关酶活性的变化 141
种酚酸类物质含量均随着贮藏时间的增加呈下降
趋势, 且7 ℃贮藏的下降幅度较大。5种酚酸类物
质中4-羟基苯甲酸在贮藏不同时间的含量都最高,
室温下其含量由贮藏前的8.66 μg·g-1 (DW)下降至
第8周的2.17 μg·g-1 (DW), 下降幅度74.9%, 而7 ℃
下贮藏8周时为0.78 μg·g -1 (DW), 下降幅度达
90.9%; 含量最低为3,4-二羟基肉桂酸。
3 不同贮藏温度下喇叭水仙鳞片中PPO和PAL活
性的变化
室温和7 ℃贮藏期间, 喇叭水仙鳞片中PPO活
性均呈上升趋势, 前者的上升幅度较小, 且上升缓
慢, 而后者的上升趋势更为明显, 幅度较大, 由贮
藏前的5.13 U·g-1 (DW)·min-1上升至16.14 U·g-1
(DW)·min-1。差异显著性检验显示, 7 ℃与室温贮
藏不同时间的喇叭水仙鳞片中PPO酶活性差异显
著(图4-A)。
由图4-B可见, 室温和7 ℃贮藏期间, 喇叭水仙
鳞片中PAL活性有波动, 但总体趋势是不断下降
的, 7 ℃贮藏的下降幅度较室温的要大。差异显著
性检验显示, 除了第5周外, 7 ℃与室温贮藏不同时
表1 喇叭水仙鳞片中酚酸类物质的质谱信息
Table 1 Mass spectrum information of phenolic acids in N. pseudonarcissus bulbs
峰号 分子离子m/z 碎片离子m/z 保留时间/min 物质种类
1 169.7 125.2 2.90 没食子酸
2 353.2 190.6 3.35 绿原酸
3 136.7 92.5 3.42 4-羟基苯甲酸
4 179.0 161.0、134.8 3.60 3,4-二羟基肉桂酸
5 167.1 151.6、107.1 3.65 4-羟基-3-甲氧基苯甲酸
图4 不同贮藏温度下喇叭水仙鳞片中PPO和PAL活性的变化
Fig.4 Changes of PPO and PAL activities in N. pseudonarcissus bulbs stored at different temperatures
不同字母表示不同处理差异显著(P<0.05)。
表2 不同贮藏温度下喇叭水仙鳞片中酚酸类物质的含量变化
Table 2 Changes of phenolic acid content in N. pseudonarcissus bulbs stored at different temperatures
μg·g-1 (DW)
贮藏时间/周
没食子酸 绿原酸 4-羟基苯甲酸 3,4-二羟基肉桂酸 4-羟基-3-甲氧基苯甲酸
室温 7 ℃ 室温 7 ℃ 室温 7 ℃ 室温 7 ℃ 室温 7 ℃
0 4.66 4.66 4.08 4.08 8.66 8.66 0.33 0.33 0.57 0.57
2 3.39 2.07 5.43 3.30 11.14 5.75 0.46 0.21 1.36 0.66
4 1.60 0.89 2.85 1.43 5.34 3.21 0.45 0.37 1.23 0.52
6 0.65 0.21 1.37 1.00 2.91 1.78 0.31 0.31 0.45 0.87
8 0.50 0.11 0.71 0.51 2.17 0.78 0.18 0.15 0.35 0.46
植物生理学报142
间的喇叭水仙鳞片中PAL活性有显著差异。
讨　　论
从上世纪人们发现抑制生长的物质对休眠以
及萌发有影响以来, 酚酸类化合物便被认为是植
物体内的一类主要的生长抑制剂。Macdonald和
Osborne (1988)研究认为, 酚酸类物质对休眠的调
控可能是通过影响细胞分裂、rRNA合成以及蛋白
质合成等起作用。而目前有关酚酸类物质与植物
休眠之间的关系, 既有抑制作用的报道, 也有促进
作用的报道。如王海波等(2006)研究发现, 不同高
温处理下桃芽的萌芽级数和总酚含量之间具有相
关性, 认为总酚含量的降低可能是高温解除休眠
的原因; 彭昕等(2012)关于浙贝母鳞茎酚酸类物质
含量及相关酶活性与休眠解除关系的研究表明,
低温解除休眠过程中, 鳞茎及芽内酚酸类物质含
量均呈降低趋势; 而孙红梅等(2004)研究发现, 兰
州百合鳞茎在低温冷藏过程中酚酸类物质含量呈
增加趋势, 而且发芽鳞茎的酚酸类物质含量明显
高于休眠鳞茎, 认为酚酸类物质对植物休眠解除
有促进作用。本文研究结果表明, 低温下喇叭水
仙新品种‘上农早春’鳞茎中总酚含量不断下降, 鉴
定出没食子酸、绿原酸、4-羟基苯甲酸、3,4-二羟
基肉桂酸、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸5种酚酸类物
质, 其中, 4-羟基苯甲酸含量最高, 且5种酚酸含量
在休眠解除过程中均呈降低的趋势; 这与孙红梅
等(2008)在兰州百合鳞茎不同部位的酚酸类物质
成分和含量的研究中, 检测到4-羟基苯甲酸且其含
量显著高于其他酚酸类物质含量的结果一致。本
研究初步鉴定出5种酚酸类物质, 其对喇叭水仙鳞
茎休眠的生理作用还需进一步研究。
高等植物酚酸类物质的合成是从PAL催化的
苯丙氨酸脱氨反应开始的, PAL是形成酚类物质的
关键酶(江昌俊和余有本2001), 而PPO是酚酸类物
质氧化的关键酶(代丽等2007)。本文结果表明, 低
温贮藏过程中PAL活性不断下降, 与酚酸含量变化
呈正相关, 而PPO活性变化与酚酸含量变化呈负相
关, 显示PPO是酚酸类物质降解的关键酶; 这与彭
昕等(2012)的研究结果一致。综上所述, ‘上农早
春’水仙鳞片中的酚酸类物质与其休眠有一定的相
关性, 酚酸类物质含量下降可能是低温解除鳞茎
休眠的生理机制之一。
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