全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (4): 408~412408
收稿 2011-11-17　　修定 2012-02-28
资助 国家自然科学基金(NSFC: 30800742)、河南省高校科技
创新人才支持计划(2010HASTTT002)、河南省高等学校
骨干教师资助计划(2006-57和2010GGJS-072)和现代农业
产业技术体系建设专项资金(CARS-30-yz-1)。
* 共同通讯作者(E-mail: guodalong@mail.haust.edu.cn, liuchon-
ghuai@caas.net. cn; Tel: 0379-64282669, 0371-65330966)。
一种新的DNA分子标记技术——起始密码子-微卫星扩增多态性
郭大龙1,*, 侯小改2, 刘崇怀3,*, 郭明晓1
河南科技大学1林学院, 2农学院, 河南洛阳471003; 3中国农业科学院郑州果树研究所, 郑州450009
摘要: 综合SCoT和ISSR分子标记技术开发了一种既能将标记位点与表达序列紧密联系, 又具有相对较高的多态性的新的
分子标记技术——起始密码子-微卫星扩增多态性(start codon-simple sequence repeat, SC-SSR)。SC-SSR标记是基于PCR的
目的基因标记系统, 上游引物用SCoT标记引物, 瞄准基因区域, 下游引物用ISSR标记引物, 上下游引物间可自由组配。引
物设计原则同SCoT标记和ISSR标记。使用50 ℃的退火温度, 保证了扩增结果的稳定性。PCR结果采用琼脂糖凝胶电泳和
聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。SC-SSR分子标记结合了ISSR标记和SCoT标记的优点, 具有操作简单、成本低廉、多态性丰
富、重复性好、引物设计简单且通用性良好、同时与表达序列紧密连锁等诸多优点, 可用于种质资源的鉴定评价、遗传
图谱的构建、重要性状基因标记、gDNA与cDNA指纹分析乃至图位克隆等方面。
关键词: 分子标记; SC-SSR; SCoT; ISSR
A New Molecular Marker Technology—Start Codon-Simple Sequence Repeat
(SC-SSR)
GUO Da-Long1,*, HOU Xiao-Gai2, LIU Chong-Huai3,*, GUO Ming-Xiao1
1College of Forestry, 2College of Agriculture, Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan 471003, China;
3Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009, China
Abstract: A new molecular marker technology, start codon-simple sequence repeat (SC-SSR), was developed
based on SCoT and ISSR markers. It is highly polymorphic and associated with expressed sequences. SC-SSR
marker is a PCR-based molecular marker system which employed SCoT and ISSR primers as forward and re-
verse primers, the forward primer aimed to the gene region. The forward and reverse primers could be freely
combined. Annealing temperature was set at 50 ℃ in order to guarantee the stability of the amplification results.
PCR results were determined by standard agarose gel electrophoresis and PAGE gel. The SC-SSR marker
would be adapted for a variety of purposes in different crops including genetic fingerprinting, genetic map con-
struction gene tagging, and genetic diversity studies which combines the advantages of SCoT and ISSR mark-
ers, high degree of polymorphism, associated with gene regions, simplicity, reliability, low-cost, excellent re-
peatability and universal applicability.
Key words: molecular marker; SC-SSR; SCoT; ISSR
DNA分子标记是以个体间核苷酸序列变异为
基础的遗传标记, 直接在DNA水平上检测生物个
体之间的差异, 是生物个体在DNA水平上遗传变
异的直接反映。自20世纪70年代以来, 众多基于
Southern杂交或PCR扩增技术的DNA分子标记陆
续建立起来并应用于高等植物遗传分析中 , 如
RAPD (random amplified polymorphism DNA)、
SSR (simple sequence repeat)、AFLP (amplified
fragment length polymorphism)和SNP (single nucle-
otide polymorphism)等, 另外还有在上述标记基础
上开发出来AP-PCR、ISSR、STS、CAP和SCAR
等分子标记。此类DNA分子标记所检测的多态性
在基因组的位置大多为随机分布, 因此可以通称
为随机DNA分子标记(random DNA markers,
RDMs)。随着结构及功能基因组学的飞速发展,
技术与方法 Techniques and Methods
郭大龙等: 一种新的DNA分子标记技术——起始密码子-微卫星扩增多态性 409
基于目的基因开发形成的目的基因标记(gene tar-
geted markers, GTMs)成为一类新型分子标记类型。
近几年, 目的基因分子标记类型被广泛开发
并应用, 它们的建立或是利用保守功能基序(Hayes
和Saghai Maroof 2000; Soriano等2005; Zhang等
2007), 或是利用真核生物中基因序列的特点(Li和
Quiros 2001; Pang等2009; 陆才瑞等2008; 郑靓等
2008), 或是利用植物在进化上的保守性(直系同源)
(Fulton等2002)。最近, Collard和Mackill (2009)开
发的目标起始密码子多态性(startcodon targeted
polymorphism, SCoT)分子标记技术也是一种目的
基因分子标记, 其依据植物基因中的ATG翻译起始
位点侧翼序列的保守性, 设计单引物并对基因组
进行扩增。SCoT标记作为一种基于PCR技术的新
型分子标记具有操作简单、引物具有通用性、成
本低廉、多态性高、可获得丰富的遗传信息等诸
多优点, 能更好地反映物种的遗传多样性和亲缘
关系(Collard和Mackill 2009)。SCoT标记不仅可以
作为ISSR和RAPD的有效补充, 而且是一种能跟踪
性状的新的分子标记, 但是引物的来源有限, 虽然
理论上能覆盖全基因组, 但要做大量的引物设计
和筛选工作。Li等(2004)结果表明SSR与基因功能
密切相关。并且SSR在基因组中大量分布, 检测
ISSR的方法和ISSR分子标记的引物设计较为简
单。如果能把SCoT分子标记的跟踪性状优势进一
步与ISSR的多态性结合, 那么在辅助选择育种时
目标性将更强, 选择范围将更大。基于此, 我们综
合SCoT和ISSR分子标记发展一种新的分子标记,
起始密码子-微卫星扩增多态性(start codon-simple
sequence repeat, SC-SSR), 并在葡萄中进行了初步
的应用。
材料与方法
1 试验材料
18份葡萄(Vitis vinifera L.)材料采自中国农业
科学院郑州果树研究所葡萄资源圃(表1)。
表1 试验所用葡萄材料
Table 1 Grape materials in the experiment
编号 名称 来源 拉丁文学名 编号 名称 来源 拉丁文学名
1 ‘京秀’ 欧亚种 V. vinifera L. 10 ‘赤霞珠’ 欧亚种 V. vinifera L.
2 ‘京亚’ 欧美杂种 V. vinifera L.×V. larbrusca L. 11 ‘佳利酿’ 欧亚种 V. vinifera L.
3 ‘洛浦早生’ 欧亚种 V. vinifera L. 12 ‘梅鹿辄’ 欧亚种 V. vinifera L.
4 ‘龙眼’ 欧亚种 V. vinifera L. 13 ‘北玫’ 欧山杂种 V. vinifera L. ×V. amurensis Rupr
5 ‘马奶’ 欧亚种 V. vinifera L. 14 ‘左山一号’ 山葡萄 V. amurensis Rupr.
6 ‘无核白’ 欧亚种 V. vinifera L. 15 ‘贝达’ 砧木 V. riparia Michx.×V. larbrusca L.
7 ‘巨峰’ 欧美杂种 V. vinifera L.×V. larbrusca L. 16 毛葡萄 野生种 V. heyneana Roem. & Schult.
8 ‘藤稔’ 欧美杂种 V. vinifera L.×V. larbrusca L. 17 刺葡萄 野生种 V. davidii Foex.
9 ‘白比诺’ 欧亚种 V. vinifera L. 18 蛇葡萄 野生种 V. piasezkii Maxim.
2 DNA提取
取葡萄的幼嫩真叶, 参照Lodhi等(1994)的方
法提取DNA。所得DNA用紫外分光光度法和琼脂
糖凝胶电泳法检测其质量及完整性。根据检测结
果, 将DNA稀释后, -20 ℃保存待用。
3 SC-SSR分子标记原理
SC-SSR分子标记扩增时所用引物一个为SCoT
标记引物, 另一个为ISSR标记引物(Zietkiewicz等
1994)。2种不同的引物结合产生了新的扩增产物,
从而形成一种新的标记方法(SC-SSR)。扩增片段
成为遗传标记的关键是其是否具有多态性。SC-
SSR的多态性来源于三方面: 一是ATG翻译起始位
点区域与SSR之间的区域(图1, 产物A); 二是SCoT
单引物可同时结合在双链DNA的正负链上的ATG
翻译起始位点区域, 从而扩增出两结合位点之间
的序列(图1, 产物B); 三是ISSR引物扩增位于反向
排列、间隔不太大的重复序列间的基因组区段(图
1, 产物C)。
4 PCR扩增和产物检测
PCR扩增所用正向和反向引物分别为SCoT引
物和ISSR引物。本研究中所用引物序列为SC15: 5
ACGACATGGCGACCGCGA 3; 835: 5 AGAGA-
植物生理学报410
GAGAGAGAGAGYC 3。PCR反应体系为2.5
mmol·L-1 Mg2+、0.4 mmol·L-1 dNTPs、1.0 U Taq酶、
0.3 μmol·L-1引物、30 ng DNA模板, 总体积20 μL。
扩增程序为: 94 ℃预变性5 min; 前2个循环: 94 ℃
变性50 s, 40 ℃退火50 s, 72 ℃延伸1 min 30 s; 后28
个循环: 94 ℃变性50 s, 50 ℃退火50 s, 72 ℃延伸1
min 30 s; 最后72 ℃延伸8 min。PCR产物用Ultra-
Power TM核酸花菁染料点染(北京百泰克生物技
术有限公司, 参照说明书进行), 在1.0%琼脂糖凝胶
中电泳, 最后在UVitec凝胶成像系统观察和记录。
结果与讨论
1 SC-SSR分子标记与SCoT和ISSR标记的比较
为了验证SC-SSR分子标记的效果和适用性,
我们利用SCoT引物15、ISSR引物835及其组合在
随机挑选的18个葡萄种质材料中分别进行扩增。
结果(图2~4)显示, SCoT的扩增条带较多, 但强弱
带区分不明显, 且大都是弱带, 条带的轮廓和界限
不是很明显(图2)。ISSR扩增的带型较简单, 除在
个别材料中外, 大部分材料中扩增的带数都较少,
品种区分能力不强(图3)。而SC-SSR扩增的强弱
带区分明显, 条带的轮廓清晰, 带型丰富, 在不同
品种中扩增结果大都不同, 区分能力强(图4)。对
比电泳图谱, 在相同的引物、反应条件和材料的
情况下, 三者的扩增结果有明显的差异, 从扩增的
DNA产物的数量、带型的清晰程度和在不同材料
中的多态性表现, 都可以看出SC-SSR标记在18份
葡萄材料中扩增的带型要比SCoT和ISSR标记丰富
的多, 在每份材料中平均扩增出的带数多, 同时带
型清晰易辨, 多态性非常丰富, 品种区分度较好,
图1 SC-SSR标记技术扩增多态性示意图
Fig.1 The schematic diagram of amplification polymorphism of SC-SSR molecular markers
图2 SCoT标记引物SCoT 15在葡萄中的扩增结果
Fig.2 The amplification profiles of SCoT 15 primer of SCoT molecular marker in grape
M: DL2000分子标记; 1~18代表葡萄种或品种名(表1)。下图同此。
郭大龙等: 一种新的DNA分子标记技术——起始密码子-微卫星扩增多态性 411
综合分析可以明显看出SC-SSR分子标记明显优于
SCoT和ISSR标记。
2 SC-SSR分子标记的技术特点和优势
众所周知, RAPD的不稳定性限制了其发展,
而RFLP、AFLP和SSR等分子标记技术操作复
杂、耗时、昂贵 , 也为其普及带来了障碍。与
RAPD相比, SC-SSR更可靠, 重复性高, 能产生更高
的多态性, 同时具备RAPD的简便及易操作性。与
RFLP、AFLP相比, 更快捷、稳定、成本较低、
DNA用量小、安全性较高。与SSR相比, 不需要预
先获知序列信息, 程序简化因而成本更低。与第
三代分子标记SNP相比, SC-SSR标记是基于PCR
的标记系统, 因而操作更简便。由于SC-SSR标记
的引物由其依据植物基因中的ATG翻译起始位点
侧翼序列的保守性序列开发而来, 使得到的位点
与表达序列紧密连锁, 为它的应用提供了一个广
阔的前景。
SC-SSR是一种既能将标记位点与表达序列
紧密联系, 并具有相对较高的多态性的新的分子
标记技术, 有以下几大特点: (1)建立在PCR基础上
的单引物扩增, 操作简单; (2)和ISSR标记相比, 它
是一种目的基因分子标记, 能有效产生和性状连
锁的标记, 方便分子标记辅助育种; (3)与SCoT标
记相比, 因为扩增了SSR区间, 所以多态性更强; (4)
直接在原有引物基础上进行组合, SC-SSR标记上
游引物与下游引物之间可自由组配, 因而用少数
的引物可进行多种组合, 减少了合成引物的费用,
也提高了引物的使用率, 同时引物可以在物种间
通用。
参考文献
陆才瑞, 喻树迅, 于霁雯, 范术丽, 宋美珍, 王武, 马淑娟(2008). 功能
图3 ISSR标记引物835在葡萄中的扩增结果
Fig.3 The amplification profiles of ISSR 835 primer of SCoT molecular marker in grape
图4 SC-SSR标记引物SCoT 15/ISSR 835在葡萄中的扩增结果
Fig.4 The amplification profiles of SCoT 15/ISSR 835 primer pairs of SCoT molecular marker in grape
植物生理学报412
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