全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 7期, 2010年 7月 677
收稿 2010-04-02 修定 　2010-05-20
资助 国家 “863”计划(2008AA10Z118)、国家自然科学基金
( 3 0 7 7 1 1 6 3 和 3 0 8 7 1 3 1 8 )和中南民族大学科研基金
(YZY 07 0 0 7)。
* 同等贡献。
** 通讯作者(E-mail: chuntaiwang@yahoo.com.cn; Tel/Fax:
02 7-67 84 32 39 )。
红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)水稻不育系与保持系中3个ANTs基因表
达模式的比较
罗凤燕 *, 程钢 *, 谭艳平, 刘学群, 刘新琼, 周杰, 王春台 **
中南民族大学生命科学学院, 生物技术国家民委重点实验室, 武汉 430074
提要: 探讨红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)水稻不育系 ‘粤泰A’ (‘YTA’)和保持系 ‘粤泰B’ (‘YTB’)中 3个腺苷酸转位酶
(ANT)基因在三叶期根、茎、叶以及不同发育时期的幼穗中的表达模式。结果表明: ANT1和ANT2在 ‘YTA’和 ‘YTB’三叶
期的根、茎、叶中的表达量都较高, 而在生殖生长不同时期的幼穗中表达量较低。‘YTA’中ANT1在不同时期的幼穗中表
达量都较低, 而ANT2的表达量到穗生长期 II的幼穗才较低。‘YTB’中ANT1在生殖生长的穗生长期 III的幼穗有很高的表
达。ANT3的表达水平在研究的各组织中的表达都较低, 在 ‘YTB’穗生长期V的幼穗中表达最高。相对于 ‘YTA’, ‘YTB’中
只有ANT3在穗生长期 III和穗生长期V的幼穗中呈现明显的优势表达; 而相对于 ‘YTB’, ‘YTA’中ANT2和ANT3在穗生长
期 I、ANT2在穗生长期VI幼穗具有明显的优势表达。3个ANTs基因在HL-CMS不育系 ‘YTA’和保持系 ‘YTB’不同组织及
发育时期的表达模式的差异, 暗示它们可能与HL-CMS水稻不育系和保持系的发育调控有关。
关键词: 水稻; ANTs; 实时荧光定量PCR; 基因表达
Comparison on Expression Mode of Three ANTs Genes between Sterile Line
and Its Maintainer Line in Honglian-Type Cytoplasmic Male Sterile (HL-CMS)
Rice (Oryza sativa L.)
LUO Feng-Yan*, CHENG Gang*, TAN Yan-Ping, LIU Xue-Qun, LIU Xin-Qiong, ZHOU Jie, WANG Chun-Tai**
Key Laboratory for Biotechnology of the State Ethnic Affairs Commission, College of Life Sciences, South-Central University for
Nationalities, Wuhan 430074, China
Abstract: The expression mode of the three adenine nucleotide translocase (ANT) genes in roots, stems and leaves
at the 3-leaf stage, and in spikes at the different developmental phases of sterile line ‘Yuetai A’ (‘YTA’) and its
maintainer line ‘Yuetai B’ (‘YTB’) of Honglian-type cytoplasmic male sterile (HL-CMS) rice was studied in this
paper. The results showed that the expression of ANT1 and ANT2 was obviously higher in roots, stems, leaves at
the 3-leaf stage than in the spikes at the reproductive stage in both ‘YTA’ and ‘YTB’. Compared with the higher
ANT1 expression at spike development stage III in ‘YTB’, the lower expression of ANT1 was observed during the
whole reproductive phases in ‘YTA’, and the lower expression of ANT2 was present only after the spike develop-
ment stage II. The expression of ANT3 at all the detected stages of both ‘YTA’ and ‘YTB’ was lower than ANT1
and ANT2, although a relatively high expression was observed at the spike development stage V in ‘YTA’. There
were the preponderant expressions of ANT2 at the spike development stage I and spike development stage VI in
‘YTA’, while ANT3 had the preponderant expression at the spike development stage III and spike development
stage V in ‘YTB’. The expression mode differences among the three ANTs between ‘YTA’ and ‘YTB’ may be
involved in the developmental control of sterile line and its maintainer line of HL-CMS rice.
Key words: rice (Oryza sativa); ANTs; real-time quantitative PCR; gene expression
植物细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,
CMS)现象普遍存在于高等植物中, 花粉的败育是雄
性不育的典型特征, 是一种早期的细胞凋亡(Young
和Hanson 1987; Balk和Leaver 2001)。红莲型CMS
(HL-CMS)水稻的不育系‘粤泰A’ (‘YTA’)的小孢子
形成时期发生典型的细胞凋亡现象, 在花粉败育过
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程中 ‘YTA’的线粒体内膜可能出现了崩解, ‘YTA’
花粉的败育与活性氧的过剩以及超氧物歧化酶活性
下调有关(Li等 2004)。
线粒体是真核生物细胞的能量工厂, 同时也是
细胞死亡的调节和控制中心。腺苷酸转位酶
(adenine nucleotide translocase, ANT)的主要作用是
介导细胞溶质ADP与线粒体ATP的交换(Riccio等
1975; Klingenberg 1980, 1985; Palmieri 2004), 在维
持细胞能量平衡 /稳态中发挥着重要作用(Dolce等
2005), 该酶由氧化磷酸化产生的ATP的亚细胞供
应, 是维持真核细胞不同线粒体功能所必需的
(Giraud等 1998; Pebay-Peyroula等 2003; Nury等
2006)。除了作为ATP/ADP转运酶, ANT也被认
为是细胞凋亡的正调节蛋白和负调节蛋白
(Luciakova等 2008)。尽管ANT在细胞凋亡中的
关键作用还存在相当争议(Vyssokikh等2001), 但有
证据表明ANT可能是线粒体渗透性转换孔的重要
调控子, 而线粒体渗透性转换孔能调控细胞凋亡
(Halestrap和 Brenner 2003; Lemasters等 1998)。
尽管多数物种都含有不止一个ANT家族成员,
但是他们在发育过程的具体作用还有待深入研究。
我们实验室前期用HMMER (Eddy 1998)对粳稻‘日
本晴 ’全基因组进行扫描, 鉴定出在 ‘日本晴 ’基因
组中至少存在3个ANT基因, 并通过实验证明了这
3个 ANT基因的存在。本文用实时荧光定量 PCR
比较分析ANTs基因在红莲型水稻不育系‘YTA’与
保持系‘粤泰B’ (‘YTB’)三叶期幼苗的不同组织及不
同发育时期幼穗的表达特性, 以探索ANT在水稻发
育过程中的作用及其与水稻 CMS的潜在关联性。
材料与方法
水稻(Oryza sativa L.) HL-CMS不育系 ‘YTA’
和保持系‘YTB’ (籼稻)种子由武汉大学生命科学院
植物发育生物学教育部重点实验室遗传研究所提
供, 种植于中南民族大学网室, 常规方法种植。根
据幼穗长度及稃壳颜色采集不同发育时期幼穗: 穗
生长期 I为 1.0~2.9 cm长幼穗; 穗生长期 II为 3.0~
4.9 cm长幼穗; 穗生长期 III为 5.0~5.4 cm长幼穗;
穗生长期 IV为 7.0~7.9 cm长幼穗; 穗生长期V为
稃壳半绿的幼穗; 穗生长期VI为稃壳变绿的幼穗。
总 RNA提取试剂 Trizol购自 Invitrogen公司,
反转录试剂盒(ReverTra Ace-α-TM)和荧光定量试剂
盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix QPK-201)
购自 TOYOBO (日本), Taq DNA聚合酶和DNA
Marker-DL2000购于 TaKaRa公司, DEPC购自
Promrga (美国), PCR引物由上海赛百盛生物技术
公司合成, 其余试剂均为国产分析纯产品。
根据 GenBank上已公布的水稻内参基因 β-
actin序列设计合成引物 actinF/actinR, 根据夏春皎
(2006)搜索得到的水稻 ‘日本晴 ’ ANT基因的基因
组DNA序列以及 cDNA序列, 使用 Premer 5.0分
别设计引物。引物由上海赛百盛生物技术公司合
成。
总RNA提取采用Trizol法。分别称取约80 mg
新鲜 ‘YTA’和 ‘YTB’三叶期根、茎、叶和不同发
育时期的幼穗, 按陈为等(2009)采用的方法提取
RNA, 然后用 20 μL DEPC水溶解, 电泳检测 RNA
质量后, 利用反转录试剂盒 ReverTra Ace-α-TM按
其说明进行反转录合成 cDNA。
以上述操作获得的 cDNA 为模板, 并以 Actin
作内标进行实时荧光定量 PCR分析。试验方法按
照仪器 Rotor-Gene 2000说明书进行, PCR反应体
系(10 μL)由5.0 μL SYBR® Green PCR Master Mix、
引物各 0.2 μL、cDNA模板 1.0 μL组成; 采用三
步法40个循环, 在72 ℃延伸时收集荧光信号。PCR
完成后设置 57~99 ℃的熔解温度, 每 1 ℃采集 1次
信号。每个反应重复 3 次。
用对数模式图显示 PCR全过程, 在指数期内,
根据仪器使用指南及实际情况, 设定参数值, 得到
每个 PCR反应的循环域(cycle threshold, Q)值。本
文采用统一的参数(域值为 0.018), 依据 2-ΔΔCT方法,
将原始数据经转换后进行统计学分析。
实验结果
1 ANTs基因的RT-PCR扩增
分别提取 ‘YTA’和 ‘YTB’三叶期幼苗的根、
茎、叶以及不同发育时期幼穗的 RNA, 反转录后
以等量 cDNA为模板进行 PCR扩增, 以 Actin检测
RNA的质量, 结果(图1)表明, ANTs基因在‘YTA’和
‘YTB’发育的各时期均有表达。
2 ANTs基因的定量表达分析
为进一步确定ANTs基因在‘YTA’和‘YTB’不
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同生长发育时期的表达特异性, 提取各组织的RNA
后进行实时荧光定量 PCR分析, 以 Actin基因作为
持家基因参照, 以 ‘YTB’三核期幼穗中 ANT1的表
达量为 1, 采用 2-ΔΔCT法比较目的基因与 Actin的相
对表达量(图 2)。从图 2可以看出, ANT3在不同组
织中表达量都很低, ANT1和ANT2在‘YTA’和‘YTB’
三叶期幼苗的根、茎、叶中的表达量都较高, 而
在生殖生长不同时期的幼穗表达量较低。‘YTA’
中 ANT1在三叶期幼苗的叶中表达水平最高, 生殖
生长不同发育时期的幼穗中表达量都非常低, 而
ANT2在茎中表达量最高, 穗生长期I的幼穗表达量
还很高, 但到穗生长期 II的幼穗则表达量很低。在
‘YTB’中ANT1和ANT2都是在茎中表达量最高, 但
ANT1在穗生长期 III有很高的表达。与 ANT1和
图 1 ‘YTA’和 ‘YTB’不同组织 ANTs cDNA质量检测
Fig.1 Quality checking for cDNA of ANTs in different tissues of ‘YTA’ and ‘YTB’
A: ANT1; B: ANT2; C: ANT3; D: Actin。M: 分子量标准DL2000; 1: 根; 2: 茎; 3: 叶; 4~9: 分别为穗生长期 I~VI的幼穗。
图 2 ANTs基因在 ‘YTA’和 ‘YTB’不同组织中定量表达分析
Fig.2 Quantitative expression analysis of ANTs in different tissues of ‘YTA’ and ‘YTB’
1: 根; 2: 茎; 3: 叶; 4~9: 分别为穗生长期 I~VI的幼穗。
ANT2不同, ANT3在所有研究的组织中表达都较低。
3 ANTs基因在‘YTA’和‘YTB’中表达趋势的比较
分析
为了比较分析ANTs基因在‘YTA’和‘YTB’中
的表达趋势, 采用 2-ΔΔCT法分析了 3个ANTs基因在
水稻 ‘YTB’和 ‘YTA’不同组织中的相对表达量(图
3), 相对表达超过 3倍则认为基因优势表达。结果
表明, 相对于 ‘YTA’, 在 ‘YTB’中ANT1和ANT2基
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图 3 ANTs基因在 ‘YTB’与 ‘YTA’不同组织中的相对表达分析
Fig.3 Relative expression analysis of ANTs in different tissues of ‘YTB’ and ‘YTA’
1: 根; 2: 茎; 3: 叶; 4~9: 分别为穗生长期 I~VI的幼穗。
本上没有表现出优势表达; 尽管ANT3在 ‘YTA’和
‘YTB’中的总体表达水平较低, 但ANT3在‘YTB’穗
生长期 III和穗生长期V的幼穗中呈现明显的优势
表达(图 3-A)。相对于 ‘YTB’, ‘YTA’中只有 ANT2
在穗生长期I和穗生长期VI的幼穗具有明显的优势
表达(图 3-B)。推测 ANT2和 ANT3的表达与HL-
CMS水稻花粉发育关系更密切, 3个 ANTs基因可
能在水稻HL-CMS中发挥不同的功能, 还有待进一
步研究。
讨　　论
HL-CMS水稻的小孢子形成时期发生典型的
细胞凋亡现象(Li等 2004)。线粒体ANT是双功能
蛋白, 负责跨线粒体内膜ADP和ATP的运输, 以
及调控能启动细胞凋亡的线粒体渗透性转换孔
(Brown和Wallace 1994)。
本文用实时荧光定量PCR, 发现ANT1和ANT2
在 ‘YTA’和 ‘YTB’中的表达模式相似, 即在三叶期
营养器官表达强而在生殖生长阶段的生殖器官表达
弱; 而 ANT3表达模式较前两者明显不同。这与我
们实验室前期生物信息学研究得出 ANT1和ANT2
位于同一簇而 ANT3位于单独一簇的结论一致(夏
春皎 2006)。
本文证实 3个 ANTs基因在HL-CMS不育系
‘YTA’和保持系 ‘YTB’中存在表达差异, ANT1和
ANT2均在 ‘YTA’和 ‘YTB’三叶期的根、茎、叶
中的表达量较高, 而在生殖生长阶段发育不同时期
的小穗中的表达量较低。ANT3在 ‘YTA’和 ‘YTB’
的不同时期均表现为低水平表达, 且表达水平明显
低于ANT1和ANT2, ANT3在 ‘YTB’穗生长期V的
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表达量高于其他发育时期。3个 ANTs基因在HL-
CMS不育系‘YTA’和保持系‘YTB’不同组织及发育
时期的表达差异, 暗示它们在水稻HL-CMS中可能
行使不同的功能。在 ‘YTA’和 ‘YTB’营养生长中
可能是ANT1和ANT2在起主要生理作用, ANT3的
表达过低说明ANT3可能是应对某种特殊环境应激
性或生物特殊需求存在的。HL-CMS水稻‘YTA’和
‘YTB’中 3个ANTs基因所表现出来的这种表达特
性与目前在其他物种中发现的ANTs基因的表达特
性有相似之处。研究发现, 人类、老鼠及秀丽隐
杆线虫的不同 ANTs基因之间也存在着功能分工
(Torroni等1990; Giraud等1998; Chevrollier等2005;
Farina等 2008)。人类ANT蛋白表现为复杂的组
织特异性表达形式, 并在维持线粒体功能方面发挥
着必不可少的作用, ANT基因的双突变和调控失调
与一些人类疾病相关(Farina等 2008)。
ANTs基因在 ‘YTA’和 ‘YTB’的相对表达模式
也表现差别, ‘YTB’相对 ‘YTA’的比较分析显示,
ANT3在‘YTB’中穗生长期III和穗生长期V中呈现
明显的优势表达, 而相对于 ‘YTB’, ‘YTA’中则是
ANT2在穗生长期 I和穗生长期VI具有明显的优势
表达。这再次证明在水稻HL-CMS中, ANT2在营
养生长可能发挥着基础作用, 满足细胞的基本需求,
而在生殖生长阶段ANT2和ANT3的差异表达则满
足植物细胞的特殊功能需求。由于HL-CMS的不
育系‘YTA’在小孢子形成时期小孢子母细胞发生典
型的细胞凋亡现象(Li等2004), 在二胞花粉晚期花
药表现出败育(徐树华 1980), 根据冯九焕等(2001)
的水稻幼穗发育时期划分法, 穗生长期 I和穗生长
期VI可能分别对应于小孢子母细胞形成期和二胞
花粉晚期(其确切的发育时期尚需作进一步的细胞
学观察), 而这两个时期中不育系‘YTA’中ANT3的
表达明显低于保持系 ‘YTB’, 这是否暗示 ANT3可
能在 ‘YTB’的花粉正常发育中发挥着某种重要作
用, 还有待进一步研究。
参考文献
陈为, 周杰, 谭艳平, 程钢, 刘新琼, 王春台, 刘学群(2009). 水稻
HL-CMS中 2个雄性不育候选基因表达模式的初步研究. 华
中农业大学学报, 28 (4): 394~397
冯九焕, 卢永根, 刘向东, 徐雪宾(2001). 水稻花粉发育过程及其
分期. 中国水稻科学, 15 (1): 21~28
夏春皎(2006). 水稻线粒体渗透性转换的鉴定及其相关基因家族
的系统发育分析[学位论文]. 武汉: 中南民族大学
徐树华(1980). 同核异质水稻雄性不育系花粉和花药发育的细胞
形态学观察. 作物学报, 6 (4): 225~230
Balk J, Leaver CJ (2001). The PET1-CMS mitochondrial muta-
tion in sunflower is associated with premature programmed
cell death and cytochrome c release. Plant Cell, 13: 1803~1818
Brown MD, Wallace DC (1994). Molecular basis of mitochon-
drial DNA disease. J Bioenerg Biomembr, 26: 273~289
Chevrollier A, Loiseau D, Chabi B, Renier G, Douay O, Malthiery
Y, Stepien G (2005). ANT2 isoform required for cancer cell
glycolysis. J Bioenerg Biomembr, 37: 307~316
Dolce V, Scarcia P, Iacopetta D, Palmieri F (2005). A fourth
ADP/ATP carrier isoform in man: identification, bacterial
expression, functional characterization and tissue distribution.
FEBS Lett, 579: 633~637
Eddy SR (1998). Profile hidden Markov models. Bioinformatics,
14: 755~763
Farina F, Alberti A, Breuil N, Bolotin-Fukuhara M, Pinto M,
Culetto E (2008). Differential expression pattern of the
four mitochondrial adenine nucleotide transporter ant genes
and their roles during the development of Caenorhabditis
elegans. Dev Dynam, 237: 1668~1681
Giraud S, Bonod-Bidaud C, Wesolowski-Louvel M, Stepien G
(1998). Expression of human ANT2 gene in highly prolifera-
tive cells: GRBOX, a new transcriptional element, is in-
volved in the regulation of glycolytic ATP import into
mitochondria. J Mol Biol, 281: 409~418
Halestrap AP, Brenner C (2003). The adenine nucleotide
translocase: a central component of the mitochondrial per-
meability transition pore and key player in cell death. Curr
Med Chem, 10: 1507~1525
Kl ingenberg M (1 9 8 0 ). T he AD P-AT P t ra nsloca t ion in
mitochondria, a membrane potential controlled transport. J
Membrane Biol, 56: 97~105
Klingenberg M (1985). Principles of carrier catalysis elucidated
by comparing two similar membrane translocators from
mitochondria, the ADP/ATP carrier and the uncoupling
protein. Ann NY Acad Sci, 456: 279~288
Lemasters JJ , Nieminen AL, Qian T, Trost LC, Elmore SP,
Nishimura Y, Crowe RA, Cascio WE, Bradham CA, Brenner
DA et al (1998). The mitochondrial permeability transition
in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis
and autophagy. Biochim Biophys Acta, 1366: 177~196
Li S, Wan C, Kong J, Zhang Z, Li Y, Zhu Y (2004). Programmed
植物生理学通讯 第 46卷 第 7期, 2010年 7月682
cell death during microgenesis in a Honglian CMS line of rice
is correlated with oxidative stress in mitochondria. Funct
Plant Biol, 31: 369~376
Luciakova K, Kollarovic G, Barath P, Nelson BD (2008). Growth-
dependent r epression of hu ma n a denine nucleot ide
translocator-2 (ANT2) transcription: evidence for the par-
ticipation of Smad and Sp family proteins in the NF1-
dependent repressor complex. Biochem J, 412: 123~130
Nury H, Dahout-Gonzalez C, Trezeguet V, Lauquin GJM, Brandolin
G, Pebay-Peyroula E (2006). Relations between structure
and function of the mitochondrial ADP/ATP carrier. Annu
Rev Biochem, 75: 713~741
Palmieri F (2004). The mitochondrial transporter family (SLC25):
physiological and pathological implications. Pflugers Arch,
447: 689~709
Pebay-Peyroula E, Dahout-Gonzalez C, Kahn R, Trezeguet V,
Lauquin GJM, Brandolin G (2003). Structure of mitochondrial
ADP/ATP carrier in complex with carboxyatractyloside.
Nature, 426: 39~44
Riccio P, Aquila H, Klingenberg M (1975). Purification of the
carboxy-atractylate binding protein from mitochondria. FEBS
Lett, 56: 133~138
Torroni A, Stepien G, Hodge JA, Wallace DC (1990). Neoplastic
transformation is associated with coordinate induction of
nuclear and cytoplasmic oxidative phosphorylation genes. J
Biol Chem, 265: 20589~20593
Vyssokikh MY, Katz A, Rueck A, Wuensch C, Dorner A, Zorov
DB, Brdiczka D (2001). Adenine nucleotide translocator
isoforms 1 and 2 are differently distributed in the mitochon-
dr ia l inner membra ne and have d ist inct affini ti es to
cyclophilin D. Biochem J, 358: 349~358
Young EG, Hanson MR (1987). A fused mitochondrial gene asso-
ciated with cytoplasmic male sterili ty is developmentally
regulated. Cell, 50: 41~49