全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (5): 665~674　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2013.0447 665
大豆两个C2H2型转录因子基因序列特征及表达分析
侯思宇1,2,3, 孙朝霞1, 郭彬1, 王玉国1, 李贵全1, 韩渊怀1,2,3,*
山西农业大学1农学院, 2农业生物工程研究所, 山西太谷030801; 3农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室, 太
原030031
摘要: 干旱气候已严重影响需水作物大豆的产量, 而植物中C2H2型转录因子在应答非生物逆境中起到重要作用, 因此充分
挖掘优异抗旱大豆种质的基因资源及功能研究, 为利用基因工程手段获得抗旱大豆种质奠定理论基础。本研究从大豆叶
片中克隆到2个基因, 分别命名为GmZAT9-like和GmZAT5-like。序列特征分析表明二者都属于C2H2型转录因子, 均包含典
型双锌指结构域和EAR保守基序, 且氨基酸同源性低于其他物种同源基因。分子进化树分析表明, 2个基因分别与拟南芥
AtZAT9和ATZAT5基因划分为一类。基于荧光实时定量PCR技术检测到2个基因分别在叶片和根部组织特异性表达。通过
半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析大豆幼苗在PEG、SA、ABA、NaCl和4 ℃胁迫处理条件下2个基因的表达模式。结果
表明, 在PEG和SA胁迫条件下, 叶片中GmZAT9-like基因表达在处理后期有升高趋势, 而根部GmZAT5-like基因在处理早期
受到诱导表达; ABA胁迫条件下, 2个基因均在处理初期呈现表达升高趋势而后下降; 盐和冷胁迫条件下, 叶片中GmZAT9-
like基因表达受到抑制, 而根部GmZAT5-like基因表达在冷胁迫处理初期呈现升高趋势。因此推测这两个基因与大豆非生
物胁迫响应相关。
关键词: 非生物胁迫; C2H2型; 转录因子; 基因表达分析
Cloning and Expression Analysis of Two C2H2 Transcription Factors in Soybean
HOU Si-Yu1,2,3, SUN Zhao-Xia1, GUO Bin1, WANG Yu-Guo1, LI Gui-Quan1, HAN Yuan-Huai1,2,3,*
1School of Agriculture, 2Institute of Agricultural Biotechnology, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801, China; 3Key
Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture, Taiyuan 030031, China
Abstract: Soybean yield can be greatly affected under dehydration condition. Since C2H2-type transcription
factor plays an important role in the response to abiotic stresses, expecially drought stress, in plants, we cloned
two C2H2-type genes, GmZAT9-like and GmZAT5-like, from soybean leaves. Their DNA and protein sequences
were analyzed further. The results showed that GmZAT9-like and GmZAT5-like genes contained two conserva-
tive zinc finger domains and one EAR motif. Phylogenetic tree analysis showed that GmZAT9-like and
GmZAT5-like genes, together with AtZAT9 and ATZAT5, were clustered to one group. The expression patterns
of these two genes under abiotic stresses and hormone treatments were also investigated. It showed that under
PEG and SA treatments GmZAT9-like gene was upregulated in leaves at the later time points, while the
GmZAT5-like gene was induced at the early time points in roots. As for ABA treatment, the expression of these
two genes were increased at the early time point and then decreased. Under the salt and cold stress condition,
GmZAT9-like gene expression was suppressed in leaves, and the GmZAT5-like gene expression was increased at
the beginning of cold treatment in root. Therefore, we speculate that these two genes may be involved in abiotic
stress response.
Key words: abiotic stress; C2H2-type; transcription factor; gene expression analysis
干旱已成为当前影响作物产量的主要障碍因
素之一, 水分亏缺对需水量高、根系不发达的大
豆来说是严重的威胁(杨鹏辉等2003)。因此, 消除
干旱威胁, 除了改善生态环境以外, 提高和利用大
豆自身的抗旱能力是一种重要、经济和有效的措
施。已有研究表明, 作物的抗旱性是可遗传的, 因
此充分挖掘我国特有抗旱大豆种质资源的优良基
因, 借用基因工程手段遗传改良大豆种质, 创造新
收稿 2013-12-06　　修定 2014-04-10
资助 山西省青年科技基金(2011021032-1和2011021032-3)、山
西农业大学引进人才基金(XB2009017)、山西省科技攻关
项目(20120311005-3)和山西省留学基金(2010050)。
* 通讯作者(E-mail: hanyuanhuai@163.com; Tel: 0354-6286399)。
型高产优质大豆品种是当前我国育种家亟待解决
的任务之一。
在真核生物中, 包括植物已经鉴定出许多包
植物生理学报666
含锌指结构域蛋白的基因, 而且大多数基因都是
与DNA结合的转录因子, 在植物、动物和真菌的
发育过程中起到关键作用(Riechmann和Ratcliffe
2000)。锌指蛋白是指具有“指状”结构域, 且通过
结合Zn2+折叠成稳定的多肽空间构型, 与下游调控
基因的启动子序列结合, 从而负责基因的表达调
控。在拟南芥、矮牵牛、小麦、棉花、大豆和水
稻等植物中已有锌指蛋白的一些报道, 根据其结
构特征可分为C8型、C6型、C4型、C2H2型、
C3HC4型、C4HC3型、C2HC型和LIM (C2HC5)等
亚类, 其中C2H2型锌指蛋白的研究报道较多(赵楠
等2009; 蔡晓峰等2013)。随着模式植物基因组测
序的完成以及数据库的公开, 通过生物信息学预
测分析在拟南芥中共鉴定出176个C2H2型转录因
子(Englbrecht等2004), 在水稻中分别鉴定出99个
C2H2型转录因子(Agarwal等2007), 小麦中鉴定出
47个C2H2型转录因子(Kam等2008), 可见植物的
C2H2型锌指蛋白是个庞大的基因家族。尽管这些
物种所鉴定出C2H2型转录因子的核酸和蛋白序列
已公开, 但该类基因家族的表达调控模式和功能
尚待进一步研究。目前报道的C2H2型锌指蛋白主
要参与了调控植物花器官、种子和幼苗发育以及
抗逆胁迫相关基因的表达。例如 : 矮牵牛中的
DNA结合蛋白ZPT2-1是第一个在植物中发现的
C2H2型锌指蛋白, 研究表明该基因参与调控了花
瓣特异表达基因烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶
(EPSPE)基因(Takatsuji等1992)。拟南芥中的SU-
PERMAN和AtZFP1锌指蛋白基因分别参与了调控
调控花器官发育和叶原基细胞分化相关基因的表
达(Sakai等1995)。此外拟南芥中的STZ以及其他3
个C2H2双锌指蛋白基因AZF1、AZF2和AZF3都参
与了盐和冷胁迫调控的过程(Sakamoto等2004)。
而大豆SCOF1基因过量表达可增强拟南芥和烟草
的耐冷性(Kim等2001)。这些研究成果揭示了植物
C2H2型锌指蛋白功能的复杂性和多样性, 而且主
要在植物的发育和环境响应的过程中起到了关键
作用。尽管大豆基因组已经测序成功, 但与抗旱
相关转录因子C2H2型基因的分离鉴定、表达模式
和功能机制的研究目前仍在探索阶段。本研究克
隆获得两个C2H2型转录因子, 通过分析其序列特
征和非生物胁迫条件下基因的表达模式, 初步揭
示这两个基因在非生物胁迫条件诱导下的表达机
制, 为大豆分子育种及相关抗旱基因的功能研究
奠定基础。
材料与方法
1 材料
试验中所用材料由山西农业大学农学院李贵
全老师惠赠的大豆[Glycine max (L.) Merr.]强抗旱
品种‘晋大74’ (李贵全等 2006)。胁迫处理试验材料
种植于培养基质为细沙的营养钵中, 使用1/3Hoag-
land营养液浇透后, 每隔3 d浇定量的蒸馏水, 每个
处理种植10株。放置于恒温光照培养箱中(HPG-
400, 哈尔滨市东联电子开发技术有限公司), 温度
25 ℃、光强度150 μmol·m-2·s-1、光照时间16 h/8 h
条件下培养3周后, 待长出第3片三出复叶时, 取健
康顶端复叶, 液氮速冻后于–80 ℃保存, 便于后期
提取RNA样品。2012年5~10月, 大豆强抗旱品种
‘晋大74’种植于山西农业大学农学院试验站, 大豆
结荚期取根、茎、叶片、花、未成熟豆荚用于组
织特异性表达分析, 每个组织取3次重复, 液氮速冻
后于–80 ℃保存, 便于后期提取RNA样品。
2 方法
2.1 胁迫处理实验
2.1.1 PEG、ABA和SA处理 将大豆幼苗置于18%
PEG6000、100 µmol·L-1 ABA(参考Luo等2012)和2
mmol·L-1 SA (参考Zhang等2009)的水溶液中光照
培养24 h, 其中分别在0 (对照)、4、8、12、18和
24 h处取顶端三出复叶作为供试材料, 每个处理设
置3个重复。本研究中模拟干旱的PEG浓度已通过
梯度实验验证为最适胁迫浓度(数据未发表)。
2.1 .2 盐和冷胁迫处理 将大豆幼苗置于200
mmol·L-1NaCl和4 ℃溶液(参考Luo等2012)中培养
24 h, 其中分别在0 (对照)、0.5、1、3、6和24 h处
取顶端三出复叶作为供试材料, 每个处理设置3个
重复。
2.2 总RNA提取及反转录cDNA
提取每个处理3个重复材料的总RNA, 1.2%琼
脂糖电泳检测总RNA提取质量, Nanodrop 2000核
酸定量仪分析总RNA浓度和纯度, 取1 μg总RNA
反转录为cDNA。植物总RNA提取试剂盒购置于康
为世纪公司, 反转录试剂盒购置于TaKaRa公司。
侯思宇等: 大豆两个C2H2型转录因子基因序列特征及表达分析 667
2.3 基因克隆、序列特征和进化树分析
于大豆TFDB数据库中(http://soybeantfdb.psc.
riken.jp)搜索到2条C2H2型转录因子EST序列, 与
NCBI数据库进行序列比对, 电子拼接基因序列, 获
得完整的ORF区域, 于上海生工生物工程有限公司
合成基因上下游特异引物(表1)。以反转录cDNA
第一链为模板, RT-PCR扩增基因序列, 反应体系设
置为: cDNA模板5 μL, 10×Ex Taq Buffer (Mg2+ plus)
5 μL, dNTP (2.5 mmol·L-1 each) 4 μL, 上下游引物
(10 μmol·L-1)各1 μL, TaKaRa Ex Taq (5 U·μL-1) 0.5
μL, 加ddH2O至终体积50 μL; PCR反应程序设置为
94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min,
共设置30个循环; 72 ℃ 5 min。将PCR扩增产物克
隆于pMD18-T载体上并进行测序, 所获基因序列
提交NCBI数据库, 2个基因分别获得基因登录号为
KC967126和KC967127, 释放日期设置为2014年6
月。基于NCBI数据库生物信息学软件进行核酸和
氨基酸序列特征分析, 使用MEGA5.0软件进行分
子进化树分析。
2.4 基因半定量及荧光定量RT-PCR分析
根据测序结果, 分别设计已提交基因特异荧
光定量分析引物和大豆Gmactin基因(GenBank登
录号为GU830958)引物(表1), 以各个处理的cDNA
为模板进行PCR扩增, 每个处理设置3个重复。RT-
PCR半定量扩增体系包含cDNA模板(50 ng·μL-1) 1
μL、2×Taq Mix混合液12.5 μL、10 μmol·L-1上下
游引物各1 μL, 补足纯水至25 μL。叶片cDNA样品
的RT-PCR半定量扩增反应程序为94 ℃预变性3
min; 26次循环的94 ℃变性30 s, 59 ℃退火30 s, 72
℃延伸30 s; 4 ℃保存。根部cDNA样品的半定量
扩增反应程序为的94 ℃预变性3 min; 30次循环的
94 ℃变性30 s, 59 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s; 4 ℃
保存。实时荧光定量PCR扩增反应体系包含cDNA
模板1 μL、10 μmol·L-1上下游引物各1 μL、2×Ul-
tra SYBR Mixture 12.5 μL , 补足纯水至25 μL。实
时荧光定量扩增反应程序为94 ℃预变性10 min;
40次循环的94 ℃变性15 s, 59 ℃退火30 s, 72 ℃延
伸32 s; 72 ℃ 5 min, 4 ℃保存。SYBR Green I 染料
购买于北京康为世纪生物科技有限公司, 实时荧
光定量PCR 仪选用Stratagene公司的Mx-3005P。
用2 –ΔΔC t法处理基因相对表达的C t值 (孙朝霞等
2012; 郭彬等2013)。
实验结果
1 基因序列特征及进化树分析
所克隆到的2个基因于NCBI核酸和蛋白数据
库中同源性比较分析, 结果表明2个基因与大豆锌
指蛋白ZAT9-like和ZAT5-like基因的核酸和氨基酸
序列同源性均为99%, 因此将这2个基因暂且命名
为GmZAT9-like和GmZAT5-like。GmZAT9-like基因
核酸序列长度为975 bp, 包含完整的CDS序列792
bp, 编码263个氨基酸; 其中包含40个碱性氨基酸
(K、R)、27个酸性氨基酸(D、E)、65个疏水氨基
酸(A、I、L、F、W、V)和83个极性氨基酸(N、
C、Q、S、T、Y), 蛋白质等电点预测为9.246, 分
子量大小为29 234.19 Da。GmZAT5-like基因核酸
序列长度908 bp, 其中包含完整CDS序列861 bp, 编
码287个氨基酸; 其中包含35个碱性氨基酸(K、
R)、30个酸性氨基酸(D、E)、76个疏水氨基酸
(A、I、L、F、W、V)和97个极性氨基酸(N、C、
Q、S、T、Y), 蛋白质等电点预测为8.362, 分子量
大小为31 626.5 Da。蛋白分子结构域分析表明:
GmZAT5-like基因包含2个典型保守的C2H2型锌指
基序结构域[CX2CX3FX5LX2HX3H] 以及保守EAR
基序[L/FDLNL/F(x)P]; 尽管GmZAT9-like基因包含
2个锌指基序, 但是第1个基序中组氨酸的位置发
表1 实验中使用的引物
Table 1 Primers used in the experiment
名称 序列(5→3) 名称 引物序列(5→3)
GmZAT9-likeGSF caactggaaatctaccatgcc GmZAT9-likeRTF aactggaaatctaccatgcc
GmZAT9-likeGSR attggcgagtttgtgttcct GmZAT9-likeRTR attggcgagtttgtgttcc
GmZAT5-likeGSF gtttaggaagaagcagcaccga GmZAT5-likeRTF gtttaggaagaagcagcaccg
GmZAT5-likeGSR gcgtgagggttttggagtatt GmZAT5-likeRTR gcgtgagggttttggagtatt
GmactinRTF gggtcaactatgttccctggt GmactinRTR ccctccaatccagacactgta

植物生理学报668
生变异[CX2CHX3FX5LX2H] , 且核心序列[QAL-
GGH]存在氨基酸变异(Q→R, G→S)(图1), 此外另
一个保守EAR基序也存在氨基酸变异(L/F→I)。氨
基酸序列同源性分析表明: GmZAT9-like基因与拟
南芥AtZAT5基因的氨基酸同源性最高达50.6%;
GmZAT5-like基因与拟南芥AtZAT9基因的氨基酸
同源性最高达35.5%。分子进化树分析表明: 大豆
GmZAT-like基因与拟南芥的AtZAT5、AtZAT7、
AtZAT12基因和水稻的OsZFP182基因聚为一类;
而GmZAT9-like基因与苜蓿的MtZFP1、大豆的
GmSCOF-1、西红柿StZFP1和拟南芥的AtSTZ、
AtAZF3、AtAZF1和AtZAT9聚为一大类 , 其中
GmZAT9-like基因与拟南芥的AtZAT9基因同聚一
个亚类(图2)。
2 基因组织特异性表达分析
GmZAT9-like基因在叶片中相对表达量最高,
而在根中该基因相对表达量为叶的0.39倍, 其他组
织中该基因相对表达量也均低于叶片(图3-A)。
GmZAT5-like基因在大豆根中相对表达量最高, 为
叶的20.6倍, 其次在茎中该基因相对表达量为叶片
的17.54倍, 其他组织该基因相对表达量均低于叶
片(图3-B)。
3 胁迫处理下GmZAT9-like基因的表达模式
大豆品种‘晋大74’幼苗PEG胁迫处理24 h后,
叶片中GmZAT9-like基因半定量和相对定量结果表
明(图4): PEG胁迫处理4~18 h, 叶片中GmZAT9-like
基因表达量呈现升高趋势, 直至24 h降低; 且处理
18 h, 该基因相对表达量最高, 为CK的5.97倍(图
4-A)。
盐胁迫处理0.5~24 h, 半定量结果未检测到该
基因表达, 荧光定量分析该基因相对表达量均低于
CK, 最高相对表达量仅为CK的0.19倍(图4-B)。低
温4 ℃胁迫处理0.5~24 h, 半定量结果检测到该基
因表达均低于CK, 荧光定量分析该基因相对表达
量均低于CK, 最高相对表达量仅为CK的0.47倍(图
4-C)。SA处理18 h, 半定量结果检测到该基因表达
高于CK和其他时间处理, 荧光定量分析结果表明
该基因相对表达量在处理18 h高达CK的6.31倍(图
4-D)。ABA处理4~12 h, 半定量结果检测到该基因
表达量呈现升高趋势, 直至18 h后, 该基因表达降
低; 荧光定量分析结果表明处理4~12 h后, 该基因相
对表达量分别为CK的1.26、1.34和2.75倍(图4-E)。
4 胁迫处理下GmZAT5-like基因的表达模式
我们进一步分析大豆幼苗根部PEG胁迫处理
图1 GmZAT9-like、GmZAT5-like基因和其他物种C2H2型锌指蛋白基因蛋白序列比对
Fig.1 Alignment of C2H2-type zinc protein sequence of GmZAT9-like and GmZAT5-like genes with these from other species
黑色下划线表示本研究克隆基因, 方框表示2个保守的C2H2型锌指基序和EAR基序。
侯思宇等: 大豆两个C2H2型转录因子基因序列特征及表达分析 669
4~24 h, 半定量结果表明该基因仅在4 h表达升高,
其他处理时间表达低于CK; 荧光定量分析结果表
明处理4 h该基因相对表达量是CK的1.68倍(图
5-A)。盐胁迫处理0.5~24 h, 半定量结果检测到该
基因表达量均低于CK; 荧光定量分析结果表明该
基因相对表达量最低至CK的0.03倍(图5-B)。低温
4 ℃处理0.5、6和24 h, 半定量检测到该基因表达
低于CK; 处理1和3 h, 半定量结果检测到该基因表
达量高于CK, 荧光定量分析结果表明该基因相对
表达量分别是CK的1.57和1.79倍(图5-C)。SA 处
理8 h, 半定量结果检测到该基因表达高于CK, 且
荧光定量结果表明该基因相对表达量是CK的2.6
倍; 但其他处理时间半定量和荧光定量结果表明
该基因表达量均低于对照(图5-D)。ABA 处理
4~12 h, 半定量结果检测到该基因表达量呈现升高
趋势, 且荧光定量分析结果表明该基因相对表达
图2 GmZAT9-like和GmZAT5-like基因氨基酸序列进化树
Fig.2 Phylogenetic tree of GmZAT9-like and GmZAT5-like gene
▲表示本研究克隆基因。
图3 GmZAT9-like和GmZAT5-like基因组织特异性相对定量表达分析
Fig.3 Relative quantitative expression analysis of GmZAT9-like and GmZAT5-like genes in different tissues
A: GmZAT9-like基因; B: GmZAT5-like基因。
植物生理学报670
图4 胁迫处理下大豆幼苗叶片中GmZAT9-like基因的表达分析
Fig.4 Expression analysis of GmZAT9-like gene in soybean leaves with stress treatment
A: PEG胁迫; B: NaCl胁迫; C: 4 ℃胁迫; D: SA处理; E: ABA处理。
侯思宇等: 大豆两个C2H2型转录因子基因序列特征及表达分析 671
图5 胁迫处理下大豆幼苗根中GmZAT5-like基因的表达分析
Fig.5 GmZAT5-like gene expression analyzed in soybean roots with stress treatment
A: PEG胁迫; B: NaCl胁迫; C: 4 ℃胁迫; D: SA处理; E: ABA处理。
植物生理学报672
量分别是CK的1.34、1.67和2.19倍; 处理18~24 h,
该基因表达量均低于CK (图5-E)。
讨　　论
在真核生物中, C2H2型锌指蛋白(C2H2-ZFPs)
是一类大的转录因子家族, 约占哺乳动物所有基因
的3%、双翅目昆虫所有基因的2.3%、酿酒酵母所
有基因的0.8%和拟南芥所有基因的0.7% (Engl-
brecht等2004; Wolfe等2000)。而且拟南芥中鉴定
出2 000个潜在的转录因子中, 有9%的基因属于
C2H2型锌指蛋白转录因子(Mitsuda和Ohme-Takgi
2009; Qu和Zhu 2006)。植物中许多C2H2型锌指蛋
白转录因子具有相同保守的结构域 , 即“QAL-
GGH”, 这6个保守的氨基酸结构域(下划线表示保
守的亮氨酸和组氨酸)对应N端识别部分螺旋位置,
是植物特有的保守结构域(Ciftci-Yilmaz和Mittler
2008)。多个锌指结构域之间以及毗邻锌指之间间
隔的氨基酸数目存在很大变异, 这与哺乳动物和酵
母蛋白中一簇锌指结构域以很短的间隔(6~8个氨
基酸)串联在一起有所不同, 特殊的结构特征暗示
着该类转录因子的靶基因识别和下游基因的调控
机制在植物和动物之间存在着差异(Englbrecht等
2004)。拟南芥基因组中根据锌指基序的排列、类
型和数量, 将C2H2-ZFPs类蛋白划分为A、B和C
类; 其中A和B类包含一个串联或多个串联锌指基
序, 而C类对应锌指蛋白是包含单一锌指或分离的
多锌指基序(2个连续的锌指基序之间至少相差10
个氨基酸残基) (Englbrecht等2004; Gourcilleau等
2011)。
本研究从大豆叶片中克隆到2个基因GmZAT9-
like和GmZAT5-like属于分散的C2H2型双锌指结构
域, 且2个锌指基序间隔相差分别为25和70个氨基
酸残基, 因此应归类于C2H2-ZFPs中C类。根据保
守锌指中2个组氨酸残基的间隔, 拟南芥中又将C
类C2H2-ZFPs进一步分为C1 (相差3个氨基酸)、
C2 (相差4个氨基酸)和C3 (相差5个氨基酸)亚类
(Englbrecht等2004)。由于本研究中2个基因锌指
基序组氨酸残基的间隔相差3个氨基酸残基, 因此
将其划分为C1亚类。已有研究报道, 拟南芥C1亚
类中共有20个成员, 其中包括AtSTZ、AtAZF1、
AtAZF3、AtZAT7和AtZAT12基因, 这些基因可能涉
及到植物非生物胁迫响应的功能。AtSTZ基因表
达受到高盐、干旱和冷胁迫的诱导, 同时也受到
GA、MeJA、SA、2,4-D和ABA的诱导; 而AtAZF1
和AtAZF3基因几乎不受到非生物胁迫条件的诱导
表达(Sakamoto等2000, 2004)。另有报道指出
AtZAT7和AtZAT12基因表达也与盐胁迫和渗透胁
迫相关(Meissner和Michael 1997)。我们根据大豆
转录因子数据库搜索与拟南芥C1亚类基因的同源
基因, 基于电子延伸并克隆获得GmZAT9-like和
GmZAT5-like基因的ORF全长, 基于半定量和实时
荧光定量技术解析这两个基因组织特异性表达模
式以及是否与非生物胁迫响应相关。所获结果表
明在叶片和根部GmZAT9-like和GmZAT5-like基因
均受到PEG胁迫的诱导作用, 但响应程度不同; 其
中叶片中GmZAT9-like基因表达在整个PEG胁迫处
理过程中呈现缓慢升高趋势, 直至24 h降低。而根
部GmZAT5-like基因表达在PEG胁迫处理早期(即4
h)急剧升高, 随后逐渐降低表现出强烈的抑制作
用。而盐胁迫处理叶片和根部条件下, 两个基因
表达均呈现强烈的抑制效应。4 ℃处理条件下, 叶
片中GmZAT9-like 基因表达呈现诱导抑制效应, 但
根部GmZAT5-like基因表达早期(处理1~3 h)呈现升
高趋势, 后期逐渐降低。SA处理条件下, 叶片中
GmZAT9-like基因表达仅在处理18 h有升高, 而其
他处理时间均呈现抑制效应; 但根部GmZAT5-like
基因表达在早期(处理8 h)却有升高响应。ABA处
理条件下, 2个基因表达均在处理早期(4~12 h)呈升
高趋势。综上所述, 叶片中GmZAT9-like基因在
PEG、SA和ABA的诱导条件下可能起到正调控表
达的作用, 但而在盐和低温胁迫条件可能起到负
调控表达作用。根部GmZAT5-like基因在PEG、
SA和ABA的诱导条件下可能起到正调控表达的作
用, 而盐和冷诱导条件可能起到负调控表达的作
用。两个基因表达模式在不同组织部位胁迫诱导
条件下的多样性暗示大豆中C2H2-ZFPs基因的功
能具有多样性和复杂性。叶片和根部是植物干旱
胁迫响应的最敏感部位, 大多与干旱胁迫相关的
侯思宇等: 大豆两个C2H2型转录因子基因序列特征及表达分析 673
基因也主要在叶片和根部特异表达。拟南芥中At-
STZ、AtZAT7和AtZAT12基因主要在根部表达; 本
研究中GmZAT5-like基因主要在根部特异表达,
GmZAT9-like基因则在叶片特异表达。综上所述,
我们推测大豆GmZAT9-like和GmZAT5-like基因与
非生物胁迫相关。
此外, 拟南芥中AtZAT7基因的EAR结构域研
究表明, EAR基序可能作为一个转录抑制子负调控
WRKY70、AOX1、Cor78和NHX1基因的表达从而
激活盐胁迫条件下防御响应相关基因的表达(Cift-
ci-Yilmaz等2007)。本研究中的2个基因同样也包
含一个重要的结构域EAR基序, 但GmZAT5-like和
GmZAT9-like基因是否具有相似的转录抑制功能,
尚需进一步实验验证。目前, 针对C2H2-ZFPs蛋白
的研究在拟南芥、水稻、苜蓿、西红柿和大豆中
已有相关报道, 但这类转录因子涉及到的转录激
活或抑制功能、下游调控靶基因及表达调控机制
仍需大量的研究探索。
本研究从大豆中克隆获得2个C2H2型锌指蛋
白基因, 分析其序列结构特征, 探讨非生物胁迫条
件下的表达机制, 为研究与非生物胁迫相关的大
豆C2H2型转录因子表达调控机制奠定基础。同
时, 将构建这两个基因的过表达和干扰载体, 遗传
转化于大豆或拟南芥中, 进一步探索这两个基因
在非生物胁迫下的调控机制和功能, 为大豆分子
育种提供新的技术手段和解决途径。
参考文献
蔡晓峰, 张余洋, 张俊红, 李汉霞, 叶志彪(2013). 植物Dof基因家族
功能研究进展. 植物生理学报, 49 (1): 1~12
郭彬, 侯思宇, 黄可盛, 路阳, 韩渊怀, 王玉国(2013). 大豆总RNA提
取方法比较及其在基因克隆和表达分析中的应用. 分子植物
育种, 11 (2): 255~261
李贵全, 张海燕, 季兰, 赵二开, 刘建兵, 李玲, 张家蓉(2006). 不同大
豆品种抗旱性综合评价. 应用生态学报, 17 (12): 2408~2412
孙朝霞, 侯思宇, 赵娟, 杨凤龙, 王玉国(2012). 梨果实愈伤组织褐腐
病菌侵染过程cDNA-SRAP差异分析. 植物生理学报, 48 (2):
166~172
杨鹏辉, 李贵全, 郭丽, 吴慎杰(2003). 干旱胁迫对不同抗旱大豆
品种花荚期质膜透性的影响. 干旱地区农业研究, 21 (3):
127~130
赵楠, 赵飞, 李玉花(2009). 锌指蛋白结构及功能研究进展. 生物技
术通讯, 1: 131~134
Agarwal P, Arora R, Ray S, Singh AK, Singh VP, Takatsuji H, Ka-
poor S, Tyagi AK (2007). Genome-wide identification of C2H2
zinc-finger gene family in rice and their phylogeny and expres-
sion analysis. Plant Mol Biol, 65 (4): 467~485
Ciftci-Yilmaz S, Morsy MR, Song L, Coutu A, Krizek BA, Lewis
MW, Warren D, Cushman J, Connolly EL, Mittler R (2007). The
EAR-motif of the Cys2/His2-type zinc finger protein Zat7 plays
a key role in the defense response of Arabidopsis to salinity
stress. J Biol Chem, 282 (12): 9260~9268
Ciftci-Yilmaz S, Mittler R (2008). The zinc finger network of plants.
Cell Mol Life Sci, 65: 1150~1160
Englbrecht CC, Schoof H, Böhm S (2004). Conservation, diversifica-
tion and expansion of C2H2 zinc finger proteins in the Arabidop-
sis thaliana genome. BMC Genomics, 5 (1): 39
Gourcilleau D, Lenne C, Armenise C, Moulia B, Julien JL, Bronner G,
Leblanc-Fournier N (2011). Phylogenetic study of plant Q-type
C2H2 zinc finger proteins and expression analysis of poplar
genes in response to osmotic, cold and mechanical stresses. DNA
Res, 18 (2): 77~92
Kam J, Gresshoff PM, Shorter R, Xue GP (2008). The Q-type C2H2
zinc finger subfamily of transcription factors in Triticum aes-
tivum is predominantly expressed in roots and enriched with
members containing an EAR repressor motif and responsive to
drought stress. Plant Mol Biol, 67 (3): 305~322
Kim JC, Lee SH, Cheong YH (2001). A novel cold-indueible zinc
finger protein from soybean, SCOF-l, enhanees cold tolerance in
transgenic plants. Plant J, 25: 247~259
Luo X, Bai X, Zhu D, Li Y, Ji W, Cai H, Wu J, Liu B, Zhu Y (2012).
GsZFP1, a new Cys2/His2-type zinc-finger protein, is a positive
regulator of plant tolerance to cold and drought stress. Planta,
235 (6): 1141~1155
Meissner R, Michael AJ (1997). Isolation and characterisation of a
diverse family of Arabidopsis two and three-fingered C2H2
zinc finger protein genes and cDNAs. Plant Mol Biol, 33 (4):
615~624
Mitsuda N, Ohme-Takagi M (2009). Functional analysis of tran-
scription factors in Arabidopsis. Plant Cell Physiol, 50 (7):
1232~1248
Qu LJ, Zhu YX (2006). Transcription factor families in Arabidopsis:
major progress and outstanding issues for future research. Curr
Opin Plant Biol, 9 (5): 544~549
Riechmann JL, Ratcliffe OJ (2000). A genomic perspective on plant
transcription factors. Curr Opin Plant Biol, 3 (5): 423~434
Sakai H, Medrano LJ, Meyerowitz EM (1995). Role of SUPERMAN
in maintaining Aiabidopsis floral whorl boundaries. Nature, 378:
199~203
植物生理学报674
Sakamoto H, Araki T, Meshi T, Iwabuchi M (2000). Expression of
a subset of the Arabidopsis Cys2/His2-type zinc-finger protein
gene family under water stress. Gene, 248 (1): 23~32
Sakamoto H, Maruyama K, Sakuma Y, Meshi T, Iwabuchi M, Shi-
nozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2004). Arabidopsis Cys2/
His2-type zinc-finger proteins function as transcription repres-
sors under drought, cold and high-salinity stress conditions.
Plant Physiol, 136 (1): 2734~2746
Takatsuji H, Mori M, Benfey PN, Ren L, Chua N-H (1992). Charac-
terization of a zinc finger DNA-binding protein expressed specif-
ically in Petunia petals and seedlings. EMBO J, 11: 241~249
Wolfe SA, Nekludova L, Pabo CO (2000). DNA recognition by
Cys2His2 zinc finger proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct,
29: 183~212
Zhang G, Chen M, Li L, Xu Z, Chen X, Guo J, Ma Y (2009). Over-
expression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type
transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and
diseases in transgenic tobacco. J Exp Bot, 60 (13): 3781~3796