全 文 ：西北植物学报，２０１５，３５（９）：１７６７－１７７５
Ａｃｔａ　Ｂｏｔ．Ｂｏｒｅａｌ．－Ｏｃｃｉｄｅｎｔ．Ｓｉｎ．
　　文章编号：１０００－４０２５（２０１５）０９－１７６７－０９　　　　　　　　　　　　　　　ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－４０２５．２０１５．０９．１７６７
　　收稿日期：２０１５－０５－０４；修改稿收到日期：２０１５－０７－１９
　　基金项目：国家自然科学基金（３１４６００４３）；新疆自治区优秀青年科技人才培养项目（２０１３７２１０１３）
　　作者简介：程　刚（１９８７－），男，在读博士研究生，研究方向为植物学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｅｎｊｏｙ１２３ｆｌｙ＠１６３．ｃｏｍ
　　＊通信作者：兰海燕，博士，教授，研究方向：植物抗逆分子生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌａｎｈａｉｙａｎ＠ｘｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
异子蓬ＰＥＰＣ基因原核表达及其重组菌
在非生物胁迫下的耐受力解析
程　刚，兰海燕＊
（新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐８３００４６）
摘　要：该研究在Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中表达了Ｃ４ 盐生植物异子蓬的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因
（ＰＥＰＣ），并进行了酶学特性及非生物胁迫响应分析，以期初步阐明ＰＥＰＣ基因在非生物胁迫下的生物学功能，为
异子蓬ＰＥＰＣ的非生物胁迫的抗性生理研究提供参考依据。基于５′－ＲＡＣＥ技术获得异子蓬ＰＥＰＣ全长基因
（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＫＰ９８５７１４），构建了Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ重组菌株。通过分光光度法和酶联
免疫吸附技术（ＥＬＩＳＡ）分别测定了ＰＥＰＣ重组蛋白的酶活和含量，并检测Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ重
组菌株在非生物胁迫下的耐受性。生物信息学分析发现，该ＰＥＰＣ基因的ｃＤＮＡ全长为２　９０１ｂｐ，编码９６６个氨
基酸，与甜菜（Ｂｅｔａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＰＥＰＣ的氨基酸序列一致性达９０％，具有ＰＥＰＣ的典型保守结构域（ＰＥＰｃａｓｅ）以及
ＶｌＴＡＨＰＴＱｓｉＲＲ和ＶＭＩＧＹＳＤＳｇＫＤＡＧ活性位点；ＰＥＰＣ蛋白属ＰＥＰＣ－１型的不含信号肽的非分泌型亲水蛋白。
Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果显示，融合ＧＳＴ的ＰＥＰＣ蛋白的分子量约１３０～１４０ｋＤ；在３７℃用０．８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导
Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ重组菌株显示出更高的ＰＥＰＣ酶活及含量，而且Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－
４Ｔ－１－ＰＥＰＣ重组菌在２００～８００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、５％～２０％ 聚乙二醇（ＰＥＧ）６　０００、２５℃～５２℃温度范围、５０～４００
μｍｏｌ／Ｌ甲基紫精和ｐＨ　３．０～１１．０的非生物胁迫下生长均明显优于对照。研究表明，异子蓬ＰＥＰＣ基因的表达提
高了Ｅ．ｃｏｌｉ耐受非生物胁迫的能力。
关键词：异子蓬；Ｃ４ 盐生植物；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；非生物胁迫
中图分类号：Ｑ７８６；Ｑ７８９　　　文献标志码：Ａ
Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＰＥＰＣｆｒｏｍ　Ｈａｌｏｐｈｙｔｅ　Ｓｕａｅｄａ　ａｒａｌｏｃａｓｐｉｃａ
ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｓｔｒａｉｎ
ＣＨＥＮＧ　Ｇａｎｇ，ＬＡＮ　Ｈａｉｙａｎ＊
（Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｕｎｉ－
ｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００４６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｅｌａｂｏｒａｔｅ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＥＰＣ　ｗｈｉｃｈ　ｅｎｃｏｄｅｓ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ
ｆｒｏｍ　Ｃ４ｈａｌｏｐｈｙｔｅ　Ｓｕａｅｄａ　ａｒａｌｏｃａｓｐｉｃａ，ｗｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＰＥＰＣ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅ－
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｕｎｄｅｒ　ｖａｒｉｏｕｓ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ．Ｔｈｅ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　ＰＥＰＣ （ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃ－
ｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＫＰ９８５７１４）ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　５′－ＲＡＣＥ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｒｏｃａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＧＥＸ－
４Ｔ－１－ＰＥＰＣｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＰＥＰＣ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏ－
ｔｏｍｅｔｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）．Ｍｅａｎｔｉｍｅ，ｔｈｅ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍ－
ｂｉｎａｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ－
ｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＰＥＰＣｃｏｎｔａｉｎｅｄ　２　９０１ｂｐ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｅｎｃｏｄｅｄ　９６６ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ，ｗｈｉｃｈ　ｐｏｓｓｅｓ－
ｓｅｓ　ｔｈｅ　ｔｙｐｉｃａｌ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｏｆ　ＰＥＰＣ（ｅ．ｇ．ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅｓ　ＶｌＴＡＨＰＴＱｓｉＲＲ　ａｎｄ　ＶＭＩＧＹＳＤＳｇＫＤＡＧ），
ａｎｄ　ｓｈａｒｅｓ　９０％ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｔｏ　ＰＥＰＣ　ｆｒｏｍＢｅｔａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ；ｏｕｒ　ＰＥＰＣ　ｗａｓ　ａ　ｎｏｎ－ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ　ＰＥＰＣ－１
ｔｙｐｅ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ＰＥＰＣ　ｗａｓ　ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ　１３０－１４０ｋＤ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ＰＥＰＣ　ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗｈｅｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　０．８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ　ａｔ　３７℃．Ｃｏｍ－
ｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｔｒａｉｎ，ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣｓｈｏｗｅｄ　ｂｅｔｔｅｒ　ｇｒｏｗｔｈ
ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｕｎｄｅｒ　ｖａｒｉｏｕｓ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ［ｉ．ｅ．２００－８００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，５％－２０％ＰＥＧ　６　０００，２５℃－５２
℃，５０－４００μｍｏｌ／Ｌ　ｍｅｔｈｙｌ　ｖｉｏｌｏｇｅｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｗｉｄｅ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｂａｓｅ　ｒａｎｇｅ（ｐＨ　３．０－１１．０）］．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＰＥＰＣｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＳ．ａｒａｌｏｃａｓｐｉｃａｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｔｈｅ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｕｎｄｅｒ　ｖａ－
ｒｉｏｕｓ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ，ｗｈｉｃｈ　ｓｕｇｇｅｓｔｓ　ｔｈａｔ　ＰＥＰＣ　ｍａｙ　ｃｏｎｆｅｒ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｏｕｒ　ｗｏｒｋ　ｃａｎ　ｐｒｏ－
ｖｉｄｅ　ｍｏｒｅ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｒｅｖｅａｌｉｎｇ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＥＰＣ　ｆｒｏｍＳ．ａｒａｌｏｃａｓｐｉｃａ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓｕａｅｄａ　ａｒａｌｏｃａｓｐｉｃａ；Ｃ４ｈａｌｏｐｈｙｔｅ；ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ
　　磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ＰＥＰＣ）是Ｃ４ 光合
途径中重要的光合调控酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸
（ＰＥＰ）的β－羧化并以四碳酸形式固定 ＣＯ２，充当
ＣＯ２ 泵的作用［１－３］。ＰＥＰＣ存在于所有植物、绿藻、
光合细菌、古细菌及非光合细菌中，主要参与Ｃ４ 及
景天酸光合代谢途径［４－５］。ＰＥＰＣ在植物中主要以
Ｃ４ 型、Ｃ３ 型、ＣＡＭ 型以及细菌型４种同工酶形式
存在［６－７］。除了调控光合作用，ＰＥＰＣ还参与三羧酸
循环（ＴＣＡ）中各种生物合成及氮同化过程所消耗
的中间产物的回补反应，在植物、藻类及细菌中起到
重要的非光合协调作用［８－１０］。除此之外，ＰＥＰＣ在植
物应对逆境胁迫中也发挥重要作用，如非生物胁迫
中的盐［１１］、干旱［１２］、低温［１３］、臭氧胁迫［１４］等均能诱
导ＰＥＰＣ基因上调表达，参与植物抗逆反应。特别
是通过转基因方法将Ｃ４ 植物ＰＥＰＣ基因导入Ｃ３
经济作物中，以提高其光合速率及胁迫耐受性，从而
增加作物产量和适应性的研究已被广泛报道。研究
发现，转玉米ＰＰＤＫ 和ＰＥＰＣ 基因的拟南芥和水
稻较对照具有更高的光合速率［１５－１６］，干旱胁迫下，过
表达ＰＥＰＣ水稻较对照具有更高光耐受性［１７］。在
生物胁迫中，一些植物病毒能够诱导ＰＥＰＣ基因的
高表达，间接帮助植物抵御病毒侵害［１８］。
近年来发现的几种单细胞Ｃ４ 植物光合碳同化
模式［１９］，为人类进一步认识光合碳同化途径及其进
化关系提供了新证据。异子蓬（Ｓｕａｅｄａ　ａｒａｌｏｃａｓｐｉ－
ｃａ）作为藜科异子蓬属一年生盐生植物，在中国仅分
布于新疆，生长于重度盐化荒漠，整个生活史均具极
强的抗逆性［２０］。异子蓬特有的单细胞 Ｃ４ 光合途
径，能够在单个叶肉细胞内经极性区隔化分布的两
种异型叶绿体进行高效光合作用［２１］。因此，探索单
细胞Ｃ４ 植物异子蓬中ＰＥＰＣ的相关功能对揭示该
物种高光效机制及逆境胁迫响应机制具有重要意
义。前期研究中发现异子蓬中至少有２种植物型
ＰＥＰＣ（根据文献命名为ＰＥＰＣ－１型和ＰＥＰＣ－２型），
目前获得了 ＰＥＰＣ－１型 ＰＥＰＣ 基因的ｃＤＮＡ 全
长［２２］。本研究通过原核表达异子蓬 ＰＥＰＣ－１型
ＰＥＰＣ基因，分析了ＰＥＰＣ在原核表达系统中的酶
学特性，并检测了ＰＥＰＣ重组菌在非生物胁迫下的
耐受性能。本研究为后续深入分析ＰＥＰＣ的功能及
利用其改良作物光合特性和抗逆性提供参考依据。
１　材料和方法
１．１　实验材料
异子蓬（Ｓｕａｅｄａ　ａｒａｌｏｃａｓｐｉｃａ）种植于新疆大学
新疆生物资源基因工程重点实验室阳台。本研究所
用的菌株、质粒和ＰＣＲ扩增用引物序列见表１。
１．２　方　法
１．２．１　ｃＤＮＡ全长序列的克隆　取发育２个月的
异子蓬幼苗嫩叶０．１５ｇ，于液氮中磨碎至均匀粉末
状，用ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ植物总ＲＮＡ提取试剂盒（天
根）提取异子蓬总ＲＮＡ，置－８０℃备用。
取上 述 总 ＲＮＡ　１μｇ，用 Ｍ－ＭＬＶ 试 剂 盒
（ＴａＫａＲａ）反转录合成ｃＤＮＡ第一链，以此作为模
板，根据已报道异子蓬 ＰＥＰＣ 基因的部分序列
（ＤＱ５３８３５３），以及近源种中相似性较高的ＰＥＰＣ
保守编码序列（ＤＱ５３８３５２、ＡＹ９５０６６７）设计简并引
物（表１），获得部分序列（缺失５′端）。ＰＣＲ反应程
序为９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５８．８℃复
性３０ｓ，７２℃延伸３ｍｉｎ，３０个循环后，７２℃延伸７
ｍｉｎ。随后，利用ＳＭＡＲＴｅｒ　ＴＭ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍ－
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＴａＫａＲａ）及引物ＧＳＰ１和
ＮＧＳＰ１扩增获得ＰＥＰＣ 基因５′端序列。获得的
ＰＥＰＣ全长ｃＤＮＡ由上海Ｓａｎｇｏｎ公司测序。
１．２．２　ＰＥＰＣ生物信息学分析　用ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．
８６７１ 西　北　植　物　学　报 ３５卷
表１　菌株、质粒和ＰＣＲ扩增所用引物
Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｔｒａｉｎｓ，ｐｌａｓｍｉｄｓ　ａｎｄ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
类别Ｃａｔｅｇｏｒｙ 名称 Ｎａｍｅ 描述 Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ 来源 Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
菌株Ｓｔｒａｉｎｓ
Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ（ＤＥ３）
Ｆ－ｏｍｐＴｈｓｄＳＢ（ｒＢ
－ｍＢ
－）ｇａｌ　ｄｃｍ　ｌａｃＹ１（ＤＥ３）ｐＲＡＲＥ（ａｒｇＵ，
ａｒｇＷ，ｉｌｅＸ，ｇｌｙＴ，ｌｅｕＷ，ｐｒｏＬ）（Ｃａｍｒ）
ＴｒａｎｓＧｅｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｃｏ．
Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓ５α
Ｆ－φ８０ｄｌａｃ　ＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９　ｅｎｄ　Ａ１　ｒｅｃＡ１
ｈｓｄＲ１７（ｒｋ－，ｍｋ＋）ｓｕｐＥ４４λ－ｔｈｉ－１　ｇｙｒＡ９６　ｒｅｌＡ１　ｐｈｏＡ
ＴｒａｎｓＧｅｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｃｏ．
质粒Ｐｌａｓｍｉｄｓ
ｐＭＤ１８－Ｔ　 ＯｒｉＣｏｌＥ１，ＬａｃＺ　ｏｐｅｒａｔｏｒ，ＭＣＳ，Ａｍｐｒ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　 ＴａＫａＲａ　Ｃｏ．
ｐＧＥＸ－４Ｔ－１　 ＯｒｉｐＢＲ３２２，ｔａｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ＭＣＳ，Ａｍｐｒ，ＧＳＴ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　 Ｓｔｏｒｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌａｂ
引物（５′→３′）
Ｐｒｉｍｅｒ（５′→３′）
ＰＥＰＣ＿Ｕｐａ ＡＴＧＧＣＷＡＳＷＧＫＧＡＡＧＫＴＧＧＡＧＡＡ 本研究 Ｔｈｉｓ　ｗｏｒｋ
ＰＥＰＣ＿Ｄｏｗｎａ ＴＴＡＡＣＣＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＡＴＴＣＣＡＧ 本研究 Ｔｈｉｓ　ｗｏｒｋ
ＧＳＰ１ ＡＧＧＴＧＴＴＡＣＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＧＧ 本研究 Ｔｈｉｓ　ｗｏｒｋ
ＮＧＳＰ１ ＧＣＡＧＡＡＣＴＣＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＴＣＣＣ 本研究 Ｔｈｉｓ　ｗｏｒｋ
ＰＥＰＣ＿Ｕｐｂ　 ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＡＧＴＴＧＧ 本研究 Ｔｈｉｓ　ｗｏｒｋ
ＰＥＰＣ＿Ｄｏｗｎｂ　 ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＡＴＴＣ 本研究 Ｔｈｉｓ　ｗｏｒｋ
　　注：ａ表示ＰＥＰＣ同源克隆的简并引物；ｂ表示ＰＥＰＣ全长序列的引物；下划线表示酶切位点。
Ｎｏｔｅ：ａｓｔａｎｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｃｌｏｎｅ；ｂ　ｓｔａｎｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ＰＥＰＣ
ｃＤＮＡ；Ｔｈｅ　ｕｎｄｅｒｌｉｎｅ　ｓｉｔｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ．
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ程序进行序列比对，并用Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｘ进行多序列比对分析［２３］。用 ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘ－
ｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｒａｎｓｌａｔｅ／在线软件进行蛋白翻译分析；
利 用 Ｐｒｏｔｐａｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔ－
ｐａｒａｍ／）对蛋白质基本理化性质进行预测；Ｍｏｔｉｆ
Ｓｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｍｙｈｉｔｓ．ｉｓｂ－ｓｉｂ．ｃｈ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｍｏｔｉｆ＿
ｓｃａｎ）对蛋白质功能位点进行预测分析；ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌ－
ｌｏ．ｌｉｆｅ．ｎｃｔｕ．ｅｄｕ．ｔｗ 在线软件进行亚细胞定位预
测；ＳｉｇｎａｌＰ４．０（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ｓｉｇ－
ｎａｌＰ／）预测蛋白质信号肽序列；ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／
ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｈｔｍｌ分析蛋白亲疏水性；Ｐｒｅｄｉｃｔ－
Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｒｇ）及
Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌ（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）预
测蛋白质二级及三级结构。
１．２．３　基因诱导表达及免疫印迹分析　将Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ 重组菌和 Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１对照菌，接种于含１００μｇ／
ｍＬ氨苄青霉素的ＬＢ液体培养基，于３７℃、２２０ｒ／
ｍｉｎ培养至 ＯＤ６０００．４～０．６，加入０．８ｍｍｏｌ／Ｌ
ＩＰＴＧ诱导４ｈ。离心收集５ｍＬ菌液，用ＰＢＳ（ｐＨ
７．４）缓冲液洗涤菌体２次，加入１ｍＬ　ＰＢＳ缓冲液，
超声波破碎菌体（功率２００Ｗ，超声３ｓ，间隔１０ｓ，
重复１０次），随后４℃、１２　０００ｇ离心１０ｍｉｎ，取上
清及１ｍＬ　ＰＢＳ缓冲液重悬沉淀进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
检测。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结束后，９０Ｖ历时５０ｍｉｎ将蛋
白转印至 ＰＶＤＦ膜。先用 １∶１０　０００ 稀释 ＧＳＴ
Ｔａｇ鼠源单克隆抗体与膜反应２ｈ，再用１∶１０　０００
羊抗小鼠ＩｇＧ二抗孵育２ｈ，洗膜后加入ＤＡＢ显色
液室温避光孵育５～１０ｍｉｎ，至出现目的条带后终
止显色反应，观察结果。
１．２．４　重组菌表达蛋白的酶活分析　用索莱宝磷
酸烯醇式丙酮酸羧化酶试剂盒（北京）和朗顿植物磷
酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶联免疫检测试剂盒（上
海），检测Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ重
组菌的ＰＥＰＣ酶活性和蛋白含量，以空载菌株Ｅ．
ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１作为对照。样品前处
理步骤为：离心收集１０ｍＬ菌液，用ＰＢＳ（ｐＨ　７．４）
缓冲液洗涤菌体２次，加入１ｍＬ提取液（含１００
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ的ＰＢＳ缓冲液），超声波破碎菌体
（功率２００Ｗ，超声３ｓ，间隔１０ｓ，共５ｍｉｎ），随后４
℃、８　０００ｇ离心１０ｍｉｎ，取上清，置冰上待测。按照
Ｄｅｎｇ等［２４］的方法，在３４０ｎｍ处检测样品吸光度，
通过监测 ＮＡＤＨ 的减少量来评价ＰＥＰＣ酶活，每
ｍｇ组织蛋白在反应体系中每分钟消耗１ｎｍｏｌ
ＮＡＤＨ定义为一个酶活力单位。用生物素双抗体
夹心酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）评价菌体中ＰＥＰＣ的
含量变化水平。
１．２．５　重组菌的生长和胁迫耐受性测定　重组菌
生长情况测定按照Ｎａｒａｙａｎ等的方法［２５］，并做适当
修改。菌体在０．８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导表达４ｈ，调
节重组菌Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ和
对照菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１的初始
ＯＤ值相等，按１％（ｖ／ｖ）的接种量２次转接至含
１００μｇ／ｍＬ氨苄青霉素的新鲜ＬＢ培养基中，每隔２
ｈ取样，在６００ｎｍ处测定菌液ＯＤ值。
重组菌Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ
和对照菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１的非生
物胁迫耐受性检测按照Ｓｉｎｇｈ等方法［５］，并做适当
９６７１９期 程　刚，等：异子蓬ＰＥＰＣ基因原核表达及其重组菌在非生物胁迫下的耐受力解析
修改。将０．８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导表达４ｈ后的重
组菌和对照菌株调节ＯＤ值一致，按１％（ｖ／ｖ）的接
种量，接种在添加有２００～８００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、５％
～２０％ＰＥＧ　６　０００、５０～４００μｍｏｌ／Ｌ甲基紫精以及
ｐＨ　３．０～１１．０的ＬＢ液体培养基，于３７℃、２２０ｒ／
ｍｉｎ振荡培养。温度胁迫实验是将诱导后培养物添
加到ＬＢ（ｐＨ　７．０），于２５℃～５２℃，２２０ｒ／ｍｉｎ振荡
培养。所有非生物胁迫实验每２ｈ取样１次，在６００
ｎｍ处检测菌液ＯＤ值。
１．３　数据分析
实验数据统计分析及作图采用 ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍ　５．０１软件进行。
２　结果与分析
２．１　ＰＥＰＣ基因克隆及原核表达
以异子蓬总 ＲＮＡ 反转录获得的ｃＤＮＡ 为模
板，通过５′－ＲＡＣＥ和同源克隆技术，对目的片段进
行扩增，得到３　０００ｂｐ左右条带（图１，Ａ），与预期
片段大小一致。
测序结果表明，ＰＥＰＣ基因ｃＤＮＡ全长为２　９０１
ｂｐ。在线蛋白翻译分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／
ｔｒａｎｓｌａｔｅ／）发现，该序列具有完整读码框，可进行后
续蛋白表达。后将ＰＥＰＣ基因重组子转化Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｔｒａｎｓｅｔｔａ（ＤＥ３），得到重组菌Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：
ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ（图１，Ｂ）。
图１　异子蓬ＰＥＰＣ基因ｃＤＮＡ扩增（Ａ）及重组原核表达
载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ双酶切鉴定（Ｂ）
Ｍ１．ＤＬ　５　０００；Ｍ２．ＤＬ　１５　０００；Ａ．１．ＰＥＰＣ基因ＰＣＲ扩增产物；
Ｂ．１．ＥｃｏＲⅠ和ＮｏｔⅠ消化的ｐＧＥＸ－４Ｔ－１；２．ＥｃｏＲⅠ和
ＮｏｔⅠ消化的ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ重组质粒。
Ｆｉｇ．１　ＰＣＲ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＰＥＰＣｃＤＮＡ　ｏｆ　Ｓ．ａｒａｌｏｃａｓｐｉｃａ（Ａ）
ａｎｄ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣｖｅｃｔｏｒ（Ｂ）
Ｍ１．ＤＬ　５　０００；Ｍ２．ＤＬ　１５　０００；Ａ．１．ＰＥＰＣｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｂｙ　ＰＣＲ；
Ｂ．１．ｐＧＥＸ－４Ｔ－１ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ＥｃｏＲⅠａｎｄ　ＮｏｔⅠ；
２．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣｄｉｇｅｓｔｅｄ
ｂｙ　ＥｃｏＲⅠａｎｄ　ＮｏｔⅠ．
２．２　异子蓬ＰＥＰＣ生物信息学分析
本研究通过生物信息学平台系统分析了异子蓬
ＰＥＰＣ的蛋白信息。ＰｒｏｔＰａｒａｍ 分析发现，异子蓬
ＰＥＰＣ 基因编码 ９６６个氨基酸，理论分子量为
１１０．２ｋＤ，等电点为６．１０。该蛋白质的主要氨基酸
构成为 Ｌｅｕ（１２．２％）、Ｇｌｕ（８．５％）、Ａｒｇ（７．３％）、
Ａｌａ（６．８％）、Ａｓｐ（６．１％），推测的分子式为 Ｃ４９０３
Ｈ７８０１Ｎ１３６１Ｏ１４５０Ｓ３７。理论不稳定系数为３８．６５，属于
稳定型蛋白。亲水性及疏水性分析发现，该蛋白多
肽链中亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸且均匀分
布，因此推测异子蓬ＰＥＰＣ属于亲水蛋白。
前人研究发现，植物中Ｃ４ 型ＰＥＰＣ的Ｃ末端
第７７４位或附近的１个氨基酸残基为保守丝氨酸
（Ｓｅｒ），而 Ｃ３ 型 ＰＥＰＣ 的相应位置则为丙氨酸
（Ａｌａ）［２１－２２］。本研究克隆的异子蓬ＰＥＰＣ在Ｃ末端
第７７５位氨基酸是丙氨酸（图２），推测可能属于Ｃ３
型ＰＥＰＣ，并将其命名为ＰＥＰＣ－１型ＰＥＰＣ。
异子蓬ＰＥＰＣ蛋白功能位点与功能域预测发
现，１６３～９６６位氨基酸之间存在一个典型ＰＥＰＣ结
构域。氨基酸序列分析表明，异子蓬ＰＥＰＣ含有植
物型ＰＥＰＣ所有基本模体、保守残基、催化位点及磷
酸化和泛素化位点［２６］（图２）。其中，位于 Ｎ 端的
１１ＳＩＤＡＱＬＲ１７模体，在Ｃ４、ＣＡＭ 及部分Ｃ３ 植物中
参与调控植物酶活性的昼夜变化，该模体中的丝氨
酸残基为专一磷酸化位点［２７］。位于 Ｃ 端的９６３
ＱＮＴＧ９６６模体决定了 ＰＥＰＣ最大催化活性［２８］。６４０
ＧＲＧＧＴＶＧＲＧＧ６４９模体中 Ｒ６４７残基直接参与该酶
的羧化反应［２９］。根据ＰＲＯＳＩＴＥ数据库分析，异子
蓬ＰＥＰＣ氨基酸序列含有２个大的ＰＥＰＣ活性位
点，分别位于１６９～１８０氨基酸位点（ＰＳ００７８１，Ｖｌ－
ＴＡＨＰＴＱｓｉＲＲ）和 ５９２ ～ ６０４ 氨 基 酸 位 点
（ＰＳ００３９３，ＶＭＩＧＹＳＤＳｇＫＤＡＧ）之间。
ＰＥＰＣ亚细胞定位和结构预测结果显示，异子
蓬ＰＥＰＣ位于线粒体基质空间、线粒体内膜、线粒
体间隙和叶绿体类囊体膜的可能性系数分别为
０．５２７、０．２５５、０．２５５和０．２８０。ＰＥＰＣ蛋白跨膜结
构域和信号肽分析发现，该蛋白不含信号肽，属于非
分泌型蛋白。
利用ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ程序预测异子蓬 ＰＥＰＣ二
级结构（图３）分析发现，α－螺旋、无规则卷曲和延伸
链含量分别为６５．７３％、３０．４３％和３．８３％，α－螺旋
和无规则卷曲大量分布，而延伸链稀疏地散布在其
中。利用Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌ程序提供的同源建模法，对
异子蓬ＰＥＰＣ蛋白质进行同源建模，获得的三级结
０７７１ 西　北　植　物　学　报 ３５卷
图２　异子蓬ＰＥＰＣ氨基酸序列的分析
方框标示酶催化反应中重要的结构域；灰色背景标示保守残基；黑色背景标示功能位点；下划线标示模体
Ｆｉｇ．２　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＰＥＰＣ　ｆｒｏｍＳ．ａｒａｌｏｃａｓｐｉｃａ
Ｂｏｘｅｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｄｏｍａｉｎｓ；Ｇｒａｙ　ａｎｄ　ｂｌａｃｋ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｓｉｔｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；
Ｕｎｄｅｒｌｉｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｍｅａｎ　ｍｏｔｉｆｓ
图３　异子蓬ＰＥＰＣ三级结构预测
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｅｒｔｉａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ＰＥＰＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ
构如图３所示。
２．３　异子蓬ＰＥＰＣ蛋白诱导表达及免疫印迹分析
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示，重组菌Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔ－
ｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ样品在１３０ｋＤ处有差异表
达条带（ＰＥＰＣ　１１０ｋＤ＋ＧＳＴ　２６ｋＤ），表明构建原
核表达载体正确（图４，Ａ）。取超声处理后菌体上清
及沉淀进行蛋白可溶性检测（图４，Ｂ）。结果表明目
的蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。
Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果发现，重组菌和对照菌Ｅ．
ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１经ＩＰＴＧ诱导后分别
检测到 ＧＳＴ融合蛋白（１３０ｋＤ）和 ＧＳＴ标签（２６
ｋＤ），且重组菌未诱导情况下也检测到较弱条带，说
明ＰＥＰＣ存在本底表达（图４，Ｃ）。
２．４　重组蛋白的酶活分析
本研究采用酶联免疫吸附技术和分光光度法，
对Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ 重组菌
ＰＥＰＣ蛋白含量及活性进行了测定。结果表明，重
组 菌经０．８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导４ｈ，ＰＥＰＣ含量达
１７７１９期 程　刚，等：异子蓬ＰＥＰＣ基因原核表达及其重组菌在非生物胁迫下的耐受力解析
图４　ＰＥＰＣ重组蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析
Ａ和Ｂ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析：Ｍ１．蛋白质分子量对照；１．重组菌诱导前；２．重组菌诱导后；３．重组菌诱导前总蛋白；４．重组菌诱导前上清；
５．重组菌诱导前上清；６．重组菌诱导后总蛋白；７．重组菌诱导后沉淀；８．重组菌诱导后上清；Ｃ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析：
Ｍ２．预染蛋白质分子量对照；９．对照菌诱导后；１０．重组菌诱导后。箭头所示为ＰＥＰＣ重组蛋白条带。
Ｆｉｇ．４　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＰＥＰＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ
Ａ　ａｎｄ　Ｂ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＰＥＰＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍ１．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｍａｒｋｅｒ；１．Ｕｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ；２．Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ；
３．Ｔｏｔａｌ　ｃｒｕｄｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｕｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ；４．Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｕｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ；
５．Ｓｏｌｕｂｌｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｕｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ；６．Ｔｏｔａｌ　ｃｒｕｄｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ；
７．Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ；８．Ｓｏｌｕｂｌｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ；
Ｃ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＰＥＰＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍ２．Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｍａｒｋｅｒ；
９．Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１；１０．Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ．
Ｔｈｅ　ａｒｒｏｗ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＰＥＰＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ．
０．１９ｎｇ／ｍＬ，分别是非诱导组和对照组的２．０１和
２９．６９倍（图５）。ＰＥＰＣ活性为１７６．１３Ｕ／ｍｇ，分别
是非诱导组和对照组的２．３５和５．３８倍。该结果表
明通过ＩＰＴＧ诱导，重组菌表达了目的蛋白ＰＥＰＣ
且具有活性。非诱导重组菌中ＰＥＰＣ基因有少量
泄漏表达，因此与对照菌相比检测到一定的ＰＥＰＣ
含量及活性。
２．５　重组菌胁迫耐受性测定
为了验证 ＰＥＰＣ 重组菌 Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：
ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ在不同非生物胁迫下的耐受性，
本研究检测了２００～８００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、５％～２０％
ＰＥＧ６０００、２５℃～５２℃、５０～４００μｍｏｌ／Ｌ甲基紫精
和ｐＨ　３．０～１１．０等不同条件下的菌体生长（图６，
Ａ～Ｅ）。结果显示，在４００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理１２ｈ
时，重组菌液 ＯＤ６００值是对照的１．５８倍。在１０％
ＰＥＧ　６　０００、２５℃、７５μｍｏｌ／Ｌ甲基紫精和ｐＨ　９．０
胁迫下，重组菌分别是对照的１．２５、２．７３、１．９２和
１．８２倍。并且，随着胁迫增强，重组菌的生长呈现
优于对照菌的趋势。以上结果表明，过量表达
ＰＥＰＣ能够赋予宿主菌更好的耐受非生物胁迫的
能力。
本研究进一步探讨了４００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、１０％
ＰＥＧ　６　０００、２５℃、７５μｍｏｌ／Ｌ甲基紫精、ｐＨ　９．０等
单一非生物胁迫条件下菌体生长情况（图７，Ｂ～Ｆ）。
图５　异子蓬ＰＥＰＣ蛋白含量和活性测定
１．对照菌非诱导；２．重组菌非诱导；３．重组菌诱导后；
图中数据为平均值±ＳＤ（ｎ＝３）；下同。
Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＰＥＰＣ
ｆｒｏｍＳ．ａｒａｌｏｃａｓｐｉｃａ
１．Ｕｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１；
２．Ｕｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ；
３．Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ；
Ｂａｒ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ　ｍｅａｎ±ＳＤ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ；Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｓ　ｂｅｌｏｗ．
结果显示，在正常条件下（３７℃、ｐＨ　７．０），重组菌和
对照菌生长没有差异，１０ｈ后基本达到平稳期（图
７，Ａ）。在胁迫条件下，除１０％ＰＥＧ　６　０００以外，１２
ｈ两者菌体生长量均有显著差异，并且对照菌的生
长受到明显胁迫抑制。以上结果表明，ＰＥＰＣ基因
的表达促进了菌体在非生物胁迫下的生长。
２７７１ 西　北　植　物　学　报 ３５卷
图６　非生物胁迫下的菌体生长检测
Ｆｉｇ．６　Ｓｔｒａｉｎｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ｕｎｄｅｒ　ｖａｒｉｏｕｓ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ
３　讨　论
尽管ＰＥＰＣ基因在Ｃ３ 或具花环结构的Ｃ４ 植
物中已被广泛研究，但在单细胞Ｃ４ 植物中的研究鲜
见报道。本研究克隆了单细胞 Ｃ４ 植物异子蓬
ＰＥＰＣ基因ｃＤＮＡ全长序列，包含２　９　０　１ｂｐ个核苷
图７　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ重组菌
在不同非生物胁迫下的生长检测
Ｆｉｇ．７　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｔｒａｎｓｅｔｔａ：：ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＰＥＰＣ
ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ
酸，编码９６６个氨基酸，序列中含有多个ＰＥＰＣ已知
模体、保守残基、酶催化位点、磷酸化和泛素化位点
及两个大的ＰＥＰＣ活性位点［２２］。氨基酸序列多重
比对发现，异子蓬ＰＥＰＣ序列与甜菜（Ｂｅｔａ　ｖｕｌｇａｒ－
ｉｓ）、五色苋（Ａｌｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ　ｆｉｃｏｉｄｅａ）及莲子草（Ａｌ－
ｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ　ｓｅｓｓｉｌｉｓ）的同源性最高，均达９０％以
上［２２］。通过生物信息学方法对异子蓬ＰＥＰＣ蛋白
质理化性质、结构及功能位点等预测分析发现，异子
蓬ＰＥＰＣ同其他种属植物型ＰＥＰＣ类似［３０－３１］。该蛋
白主要分布于线粒体基质，属于无跨膜结构域和信
号肽的非分泌蛋白。对其三级空间结构分析显示，
异子蓬ＰＥＰＣ主要以α－螺旋为主，其酶催化反应结
构域位于蛋白中心位置，符合酶活性中心局限于大
分子一定区域的规律［３２］。
经免疫印迹检测原核表达的 １３０ｋＤ 重组
ＧＳＴ－ＰＥＰＣ蛋白主要以包涵体形式存在，在菌体裂
解后上清及未诱导情况下也有少量表达。本实验克
隆的异子蓬ＰＥＰＣ属ＰＥＰＣ－１型，其体外重组酶活
性检测显示，底物ＰＥＰ能够在ＰＥＰＣ及苹果酸脱氢
酶催化下，通过消耗 ＮＡＤＨ 最终生成苹果酸，该结
３７７１９期 程　刚，等：异子蓬ＰＥＰＣ基因原核表达及其重组菌在非生物胁迫下的耐受力解析
果与Ｐａｒｋ等研究结果一致［３３］。众所周知，ＰＥＰＣ作
为重要的光合关键酶在植物中被广泛研究。Ｃ４ 型
ＰＥＰＣ在Ｃ４ 光合途径中催化ＰＥＰ结合大气中ＣＯ２
形成四碳酸，后经脱羧作用释放ＣＯ２，并将其供给
Ｃ３ 循环使用，起到了 ＣＯ２ 浓缩作用［５，９，２２］。Ｃ３ 型
（和／或根型）ＰＥＰＣ在Ｃ３ 及Ｃ４ 植物中则可能在三
羧酸循环的中间物质的回补反应中行使重要功能，
包括草酰乙酸（ＯＡＡ）、苹果酸等［５］。
已有大量报道集中在ＰＥＰＣ抗逆功能的研究。
在转基因植物中过量表达Ｃ４ 植物ＰＥＰＣ，能不同程
度地增强植物抵御和适应外界胁迫的能力。除了增
强植物耐旱［３４－３５］、耐盐［１１］、耐高温［１７］等能力外，Ｂｅ－
ｇｕｍａ等［３６］发现，转ＰＥＰＣ基因水稻具有耐受重金
属毒害的能力。此外，在Ｅ．ｃｏｌｉ中过量表达ＰＥＰＣ
基因有利于细胞抵御逆境胁迫［５，３３］。本研究也发现
原核表达的ＰＥＰＣ蛋白在ＮａＣｌ、ＰＥＧ　６　０００、甲基紫
精（ＭＶ）、ｐＨ　３．０～１１．０的胁迫下能促进菌体生
长，由此推测ＰＥＰＣ在非生物胁迫下参与了Ｅ．ｃｏｌｉ
耐受非生物胁迫的胁迫生理过程，该结果与Ｓｉｎｇｈ
等研究结果相符［５］。推测ＰＥＰＣ参与胁迫应答可能
存 在两种机制，一是ＰＥＰＣ能够催化ＰＥＰ生成
ＯＡＡ和／或随后的苹果酸，ＯＡＡ在ＴＣＡ循环中起
重要的回补反应［３７－３８］；二是菌体内积累大量的苹果
酸能够作为渗透调节物质帮助抵御胁迫产生的细胞
损伤［３９－４０］。因此，ＰＥＰＣ作为一种重要的酶，能够促
进菌体积极应对逆境胁迫。这进一步佐证了ＰＥＰＣ
抗逆性能研究在生物逆境生理研究领域的重要性。
本研究原核表达了异子蓬ＰＥＰＣ－１型ＰＥＰＣ
基因，该基因的异源表达提高了Ｅ．ｃｏｌｉ耐受非生物
逆境胁迫的能力。因此，本研究将为ＰＥＰＣ逆境生
理和逆境生物的工程改造提供了信息。
参考文献：
［１］　ＵＨＲＩＧ　Ｒ　Ｇ，Ｏ＇ＬＥＡＲＹ　Ｂ，ＳＰＡＮＧ　Ｈ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ－ａｎｄ　ｐｌａｎｔ－ｔｙｐｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒ－
ｂｏｘｙｌａｓｅｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｌａｓｔｉｄｉａｌ　ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｆｒｏｍ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｃａｓｔｏｒ　ｏｉｌ　ｓｅｅｄｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００８，１４６（３）：１　３４６
－１　３５７．
［２］　ＩＺＵＩ　Ｋ，ＭＡＴＳＵＭＵＲＡ　Ｈ，ＦＵＲＵＭＯＴＯ　Ｔ，ＫＡＩ　Ｙ．Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ａ　ｎｅｗ　ｅｒａ　ｏｆ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅ－
ｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，５５：６９－８４．
［３］　ＮＩＭＭＯ　Ｈ．Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｉｎ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏ－
ｐｈｙｓｉｃｓ，２００３，４１４（２）：１８９－１９６．
［４］　ＭＡＳＵＭＯＴＯ　Ｃ，ＭＩＹＡＺＡＷＡ　Ｓ，ＯＨＫＡＷＡ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｙ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｏｆ　ｒｉｃｅ
ｐｌａｙｓ　ａ　ｃｒｕｃｉａｌ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，
２０１０，１０７（１１）：５　２２６－５　２３１．
［５］　ＳＩＮＧＨ　Ｊ，ＲＥＤＤＹ　Ｇ　Ｍ，ＡＧＡＲＷＡＬ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｃ４－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＥＰＣ　ｉｓｏｆｏｒｍ　ｆｒｏｍ　Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ　ｇｌａｕｃｕｍ
ｐｌａｙｓ　ａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｄａｐｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，２０１２，５００（２）：２２４－２３１．
［６］　ＴＩＮＧ　Ｉ　Ｐ，ＢＵＲＫ　Ｊ　Ｈ．Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｉｎ　Ｗｅｌｗｉｔｓｃｈｉａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８３，３２（３）：２７９－２８５．
［７］　ＧＥＮＮＩＤＡＫＩＳ　Ｓ，ＲＡＯ　Ｓ，ＧＲＥＥＮＨＡＭ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ－ａｎｄ　ｐｌａｎｔ－ｔｙｐｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎｔｅｒａｃｔ　ｉｎ　ｔｈｅ
ｈｅｔｅｒｏ－ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ　Ｃｌａｓｓ－２ＰＥＰＣ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｏｆ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｃａｓｔｏｒ　ｏｉｌ　ｓｅｅｄｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２００７，５２（５）：８３９－８４９．
［８］　ＣＨＯＬＬＥＴ　Ｒ，ＶＩＤＡＬ　Ｊ，Ｏ＇ＬＥＡＲＹ　Ｍ　Ｈ．Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ａ　ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌ
Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６，４７：２７３－２９８．
［９］　Ｏ＇ＬＥＡＲＹ　Ｂ，ＰＡＲＫ　Ｊ，ＰＬＡＸＴＯＮ　Ｗ　Ｃ．Ｔｈｅ　ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＰＥＰＣ）：ｒｅｃｅｎｔ　ｉｎｓｉｇｈｔｓ　ｉｎｔｏ
ｔｈｅ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ｏｆ　ｎｏｎ－ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ＰＥＰＣｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１１，４３６（１）：１５－３４．
［１０］　ＶＩＤＡＬ　Ｊ，ＣＨＯＬＬＥＴ　Ｒ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ４ＰＥＰ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２（６）：２３０－２３７．
［１１］　ＳＡＮＣＨＥＺ　Ｒ，ＦＬＯＲＥＳ　Ａ，ＣＥＪＵＤＯ　Ｆ　Ｊ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｅｎｃｏｄｅ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｙ　ｕｎｒｅｌａｔｅｄ　ｐｏｌｙ－
ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　ａｒｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ａｎｄ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ，２００６，２２３（５）：９０１－９０９．
［１２］　ＣＡＲＭＯ－ＳＩＬＶＡ　Ａ　Ｅ，ＢＥＲＮＡＲＤＥＳ　ＤＡ　ＳＩＬＶＡ　Ａ，ＫＥＹＳ　Ａ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ＰＥＰ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｃ４ａｃｉｄ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓ
ａｒｅ　ｌｉｔｔｌｅ　ｃｈａｎｇｅｄ　ｂｙ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　ｔｈｒｅｅ　Ｃ４ｇｒａｓｓｅｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｕｂｔｙｐｅｓ［Ｊ］．Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８，９７（３）：２２３－２３３．
［１３］　ＧＯＮＺＡＬＥＺ　Ｍ　Ｃ，ＳＡＮＣＨＥＺ　Ｒ，ＣＥＪＵＤＯ　Ｆ　Ｊ．Ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ　ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　ｗａｔｅｒ　ｂａｌａｎｃｅ　ｉｎｄｕｃｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｅｘｐｒｅｓ－
ｓｉｏｎ　ｉｎ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ，２００３，２１６（６）：９８５－９９２．
［１４］　ＤＩＺＥＮＧＲＥＭＥＬ　Ｐ，ＬＥ　ＴＨＩＥＣ　Ｄ，ＨＡＳＥＮＦＲＡＴＺ－ＳＡＵＤＥＲ　Ｍ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌ　ｒｅｄｏｘ　ｐｏｗｅｒ　ａｆｔｅｒ　ｏ－
ｚｏｎｅ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，１１（１）：３５－４２．
［１５］　ＷＡＮＧ　Ｙ　Ｍ，ＸＵ　Ｗ　Ｇ，ＨＵ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　Ｃ４－Ｐｙｒｕｖａｔｅ　Ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｄｉｋｉｎａｓｅ（ＰＰＤＫ）ａｎｄ　Ｃ４－Ｐｈｏｓ－
４７７１ 西　北　植　物　学　报 ３５卷
ｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　Ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＰＥＰＣ）ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，２０１２，３０：１　３６７－１　３７４．
［１６］　ＢＡＮＤＹＯＰＡＤＨＹＡＹ　Ａ，ＤＡＴＴＡ　Ｋ，ＺＨＡＮＧ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｒａｔｅ　ｉｎ　ｇｅｎｅｔｉｃａｌｙ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｉｎｄｉｃａ　ｒｉｃｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
ｐｅｐｃ　ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｍａｉｚｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７，１７２（６）：１　２０４－１　２０９．
［１７］　ＤＩＮＧ　Ｚ　Ｓ，ＺＨＯＵ　Ｂ　Ｙ，ＳＵＮ　Ｘ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｉｇｈ　ｌｉｇｈｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｓ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｂｙ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ＰＥＰＣ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　ｕｎｄｅｒ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ
Ａｇｒｏｎｏｍｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ，２０１２，３８（２）：２８５－２９２．
［１８］　ＭＬＬＥＲ　Ｋ，ＤＯＵＢＮＥＲＯＶＶ，ＳＹＮＫＯＶＨ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｉｎ　ＰＶＹ（ＮＴＮ）－ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｔｏｂａｃｃｏ
ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，３９０（３）：２４５－２５１．
［１９］　ＶＯＺＮＥＳＥＮＳＫＡＹＡ　Ｅ　Ｖ，ＦＲＡＮＣＥＳＣＨＩ　Ｖ　Ｒ，ＫＩＩＲＡＴＳ　Ｏ，ｅｔ　ａｌ．Ｋｒａｎｚ　ａｎａｔｏｍｙ　ｉｓ　ｎｏｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｆｏｒ　ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ　Ｃ４ｐｌａｎｔ　ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１４：５４３－５４６．
［２０］　ＥＤＷＡＲＤＳ　Ｇ　Ｅ，ＦＲＡＮＣＥＳＣＨＩ　Ｖ　Ｒ，ＶＯＺＮＥＳＥＮＳＫＡＹＡ　Ｅ　Ｖ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌ　Ｃ４ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｖｅｒｓｕｓ　ｔｈｅ　ｄｕａｌ－ｃｅｌ（Ｋｒａｎｚ）ｐａｒａｄｉｇｍ［Ｊ］．
Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，５５：１７３－１９６．
［２１］　ＬＡＲＡ　Ｍ　Ｖ，ＣＨＵＯＮＧ　Ｓ　Ｄ，ＡＫＨＡＮＩ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｐｅｃｉｅｓ　ｈａｖｉｎｇ　Ｃ４ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌ－ｔｙｐｅ　ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｅｖｏｌｖｅｄ　ａ
ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｌｉｋｅ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｋｒａｎｚ－ｔｙｐｅ　Ｃ４ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６，１４２（２）：６７３－６８４．
［２２］　ＲＯＳＮＯＷ　Ｊ　Ｊ，ＥＤＷＡＲＤＳ　Ｇ　Ｅ，ＲＯＡＬＳＯＮ　ＥＨ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｋｒａｎｚ　ａｎｄ　ｎｏｎ－Ｋｒａｎｚ　Ｃ４ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｓｕａｅｄｏｉｄｅａｅ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｏｔａｎｙ，２０１４，６５（１３）：３５９５－３６０７．
［２３］　ＴＨＯＭＰＳＯＮ　Ｊ　Ｄ，ＧＩＢＳＯＮ　Ｔ　Ｊ，ＰＬＥＷＮＩ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｘ　ｗｉｎｄｏｗｓ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：Ｆｌｅｘｉｂｌｅ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
ａｉｄｅｄ　ｂｙ　ｑｕａｌｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｔｏｏｌｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２４（４）：８７６－４８８．
［２４］　ＤＥＮＧ　Ｘ，ＣＡＩ　Ｊ，ＬＩ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＰＥＰＣ１ｇｅｎｅ　ａｆｆｅｃｔ　ｃａｒｂｏｎ　ｆｌｕｘ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ　ｂｙ
ｔｈｅ　ｇｒｅｅｎ　ａｌｇａＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１４，３６（１１）：２　１９９－２　２０８．
［２５］　ＮＡＲＡＹＡＮ　Ｏ　Ｐ，ＫＵＭＡＲＩ　Ｎ，ＲＡＩ　Ｌ　Ｃ．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎａｂａｅｎａ　ＰＣＣ　７１２０　ａｌｌ　３９４０（ａ　Ｄｐｓ　ｆａｍｉｌｙ　ｇｅｎｅ）ｐｒｏｔｅｃｔｓ　Ｅｓｃｈｅ－
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｆｒｏｍ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１０，３９４（１）：１６３－
１６９．
［２６］　ＲＵＩＺ－ＢＡＬＬＥＳＴＡ　Ｉ，ＦＥＲＩＡ　Ａ　Ｂ，ＮＩ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｍｏｎｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎａｐｌｅｒｏｔｉｃ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｏｃｃｕｒｓ　ａｔ
Ｌｙｓ６２４ｉｎ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　ｓｏｒｇｈｕｍ　ｓｅｅｄｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｏｔａｎｙ，２０１４，６５（２）：４４３－４５１．
［２７］　ＬＥＰＩＮＩＥＣ　Ｌ，ＶＩＤＡＬＡ　Ｊ，ＣＨＯＬＬＥＴＢ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，
１９９４，９９（２）：１１１－１２４．
［２８］　ＤＯＮＧ　Ｌ，ＰＡＴＩＬ　Ｓ，ＣＯＮＤＯＮ　Ｓ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ　ｏｆ　ｓｏｒｇｈｕｍ　Ｃ４ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｉｓ　ｉｎ－
ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｍａｘｉｍａｌ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｆｏｒ　ｈｏｍｏｔｅｔｒａｍｅｒ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９９９，３７１
（１）：１２４－１２８．
［２９］　ＭＡＴＳＵＭＵＲＡ　Ｈ，ＸＩＥ　Ｙ，ＳＨＩＲＡＫＡＴＡ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｃ４ｆｏｒｍ　ｍａｉｚｅ　ａｎｄ　ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｏｆ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ－
ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓ［Ｊ］．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２００２，１０（１２）：１　７２１－１　７３０．
［３０］　ＺＨＡＮＧ　Ｇ　Ｆ（张桂芳），ＺＨＡＯ　Ｍ（赵　明），ＤＩＮＧ　Ｚ　Ｓ（丁在松），ｅｔ　ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ
ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＥｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ　ｃｒｕｓｇａｌｌｉ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ａｇｒｏｎｏｍｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ（作物学报），２００５，３１（１０）：１　３６５－１　３６９（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）．
［３１］　ＣＨＥＮ　Ｍ　Ｎ（陈明娜），ＹＡＮＧ　Ｑ　Ｌ（杨庆利），ＹＵ　ＳＨ　Ｌ（禹山林），ｅｔ　ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅ
ｆｒｏｍＳｕａｅｄａ　ｇｌａｕｃａ［Ｊ］．Ｍａｒｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（海洋科学），２００９，３３（６）：６７－７２（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）．
［３２］　王镜岩．生物化学［Ｍ］．北京：高等教育出版杜，２００２：３８４－３８５．
［３３］　ＰＡＲＫ　Ｓ，ＰＡＣＫ　Ｓ　Ｐ，ＬＥＥ　Ｊ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｄｏｎ－ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｇｌａｃｉｅｃｏｌａ　ｓｐ．ＨＴＣＣ２９９９ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｃ４ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，１６７（７）：１　８４５－１
８５３．
［３４］　ＤＵ　Ｘ　Ｈ（杜西河），ＸＵ　Ｗ　Ｇ（许为钢），ＨＵ　Ｌ（胡　琳），ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　Ｃ４－ｔｙｐｅ　ＰＥＰＣａｎｄ　ＰＰＤＫｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｌａｎｔｓ
ｔｏ　ｄｒｏｕｇｈｔ－ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ（分子植物育种），２０１３，１１（４）：４７７－４８４（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）．
［３５］　ＺＨＯＵ　Ｂ　Ｙ，ＤＩＮＧ　Ｚ　Ｓ，ＺＨＡＯ　Ｍ．Ａｌｅｖｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｎ　ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｂｙ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｐｃ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｒｉｃｅ［Ｊ］．
Ａｃｔａ　Ａｇｒｏｎｏｍｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ，２０１１，３７（１）：１１２－１１８．
［３６］　ＢＥＧＵＭＡ　Ｈ　Ｈ，ＯＳＡＫＩＡ　Ｍ，ＷＡＴＡＮＡＢＥＡ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ａｌｕｍｉｎｕｍ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎ－
ｉｃ　ｒｉｃｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２００９，３（１）：８４－９６．
［３７］　ＰＬＡＸＴＯＮ　Ｗ　Ｃ，ＰＯＤＥＳＴＡ　Ｆ　Ｅ．Ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００６，２５（２）：１５９－１９８．
［３８］　ＭＩＬＬＡＲＤ　Ｃ　Ｓ，ＣＨＡＯ　Ｙ　Ｐ，ＬＩＡＯ　Ｊ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｃｃｉｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｂｙ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ
ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６，６２（５）：１　８０８－１　８１０．
［３９］　ＲＺＥＰＫＡ　Ａ，ＲＵＴ　Ｇ，ＫＲＵＰＡ　Ｊ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｎ　ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｍａｌａｔｅ　ａｎｄ　ｃｉｔｒａｔｅ　ａｎｄ　ｏｎ　ｍａｌｉｃ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃ－
ｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｍｏｓｓ　ｇａｍｅｔｏｐｈｏｒｅｓ［Ｊ］．Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃａ，２００９，４７（１）：１４１－１４５．
［４０］　ＢＲＯＡＤＢＥＮＴ　Ｊ　Ｒ，ＬＡＲＳＥＮ　Ｒ　Ｌ，ＤＥＩＢＥＬ　Ｖ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　ＡＴＣＣ　３３４ｔｏ　ａｃｉｄ
ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１９２（９）：２　４４５－２　４５８． （编辑：宋亚珍）
５７７１９期 程　刚，等：异子蓬ＰＥＰＣ基因原核表达及其重组菌在非生物胁迫下的耐受力解析